專利名稱：：二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物的制備方法及其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及從忍冬屬植物中提取分離并合成二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锼幮ЫM分的方法及其抗流感和抗肝炎用組合物。
背景技術(shù)：
：病毒感染性疾病為10大類疾病之一，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。流感病毒是引起急性病毒性呼吸道傳染病的主要病原體，具有傳染性高、傳播迅速、易發(fā)生流行等特點。由于病毒只能在活細(xì)胞生長、流感病毒的亞型變異速度快而疫苗研究和生產(chǎn)速度較慢，使得化學(xué)藥物和流感病毒疫苗難以發(fā)揮其最佳治療和預(yù)防效果，而且，目前又無法有效預(yù)測流感爆發(fā)的時間和周期，目前公認(rèn)有效治療藥物達(dá)菲，價格昂貴，副作用也較大。因此，抗流感病毒藥物研究受到廣泛重視。乙型肝炎是乙型肝炎病毒(H印atitisBvirus,HBV)引起的一種傳染性疾病。HBV感染人群罹患肝硬化和肝細(xì)胞癌的相對危險至少增加1000倍，并最終導(dǎo)致死亡。全球大約有20億人感染過或者正在感染HBV，其中約4億為HBV慢性感染者，僅我國就有1.3億HBV攜帶者。乙肝的治療已成為世界各國共同關(guān)心的問題。目前臨床上應(yīng)用的抗乙肝病毒藥物核苷類似物及其干擾素，毒副作用較大，療效并不盡如人意。山銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾，包括灰氈毛忍冬、紅腺忍冬或華南忍冬，具有抑制病毒復(fù)制、阻止病毒致細(xì)胞病變的功效，有上百年的臨床應(yīng)用歷史。李光玉等用灰氈毛忍冬對普通感冒的發(fā)熱、頭痛身酸、咽喉腫痛等進(jìn)行臨床研究，并與貴州華南忍冬作比較，結(jié)果表明灰氈毛忍冬對普通感冒的療效高于貴州華南忍冬。時京珍等對灰氈毛忍冬的總皂苷、總次苷和二十九烷醇及灰氈毛忍冬的水提物做了保肝作用研究，結(jié)果表明它們對四氯化碳、D-氨基半乳糖等肝毒物造成大、小鼠肝損傷有保護(hù)作用。李永梅等對灰氈毛忍冬進(jìn)行研究表明其提取液、水提取液、水超聲提取液均能顯著增強(qiáng)體外細(xì)胞抗腺病毒感染的能力。然而，山銀花抗病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)究竟是什么？有效成分含量與藥效有多大的關(guān)系？這些問題都有待進(jìn)一步闡明。在此，本發(fā)明獨辟蹊徑，以中藥譜效關(guān)系為切入點，借鑒基因診斷治療策略，建立基于目標(biāo)成分敲除/敲入(componentknock-out&knock_in)的中藥譜效關(guān)系與量效關(guān)系研究模式，多快好省地確定中藥山銀花抗病毒的關(guān)鍵組分和質(zhì)量控制(含主要藥效組分和/或藥效相關(guān)組分)及其推薦臨床使用劑量，達(dá)到了"量而又準(zhǔn)，關(guān)聯(lián)藥效，可控可評"的目標(biāo)。基于目標(biāo)成分敲除的中藥譜效關(guān)系與藥效關(guān)鍵組分辨識主要包含以下四步(l)中藥譜效關(guān)系的一般分析與目標(biāo)成分的初步確定在系統(tǒng)分層篩選的基礎(chǔ)上，根據(jù)有效萃提物化學(xué)指紋圖譜和藥理藥效試驗指標(biāo)，定性定量地分析各個色譜峰與藥效作用的相關(guān)性，選取與藥效指標(biāo)相關(guān)顯著的色譜峰作為目標(biāo)成分(目標(biāo)成分1、目標(biāo)成分2、目標(biāo)成分3……)；(2)目標(biāo)成分的敲除與目標(biāo)成分陰性樣品的制備盡可能地采用無破壞、無殘留的快速分離純化技術(shù)，富集目標(biāo)成分，同時收集敲除該目標(biāo)成分后的剩余萃提物，即目標(biāo)成分陰性樣品。(3)目標(biāo)成分與目標(biāo)成分陰性樣品的生物等效性試驗采用與方藥功效關(guān)聯(lián)性好、觀測指標(biāo)靈敏、操作簡便的藥理試驗?zāi)Ｐ秃头椒?，對比考察目?biāo)成分、目標(biāo)成分陰性樣品與方藥3總提物的藥效作用和毒性及其客觀差異。(4)藥效關(guān)鍵組分的確定根據(jù)生物等效性試驗結(jié)果，可作如下解析和判斷①方藥總提物比較，如果目標(biāo)成分與方藥總提物的藥效作用相同或相似，而目標(biāo)成分陰性樣品無效或很作用很弱，則說明該目標(biāo)成分與藥效作用之間的存在直接或必然相關(guān)，該目標(biāo)成分為方藥的主要藥效成分之一；②方藥總提物比較，如果目標(biāo)成分無效或作用很弱，而目標(biāo)成分陰性樣品與方藥總提物的藥效作用相同或相似，則提示該目標(biāo)成分與藥效作用之間的沒有直接或必然相關(guān)，該目標(biāo)成分不是方藥的主要藥效成分，尚需進(jìn)一步在目標(biāo)成分陰性樣品中繼續(xù)尋找和確定目標(biāo)成分；③與方藥總提物比較，如果目標(biāo)成分無效或很作用很弱，目標(biāo)成分陰性樣品也無效或很作用很弱，但二者合并起來又具有與方藥總提物相同或相似的藥效作用，說明該目標(biāo)成分與藥效作用之間的存在間接或內(nèi)在相關(guān)，該目標(biāo)成分為方藥的藥效相關(guān)成分之一。④再重復(fù)上述篩查程序，逐次確定或排除各個目標(biāo)成分是否為方藥的主要藥效成分和/或藥效相關(guān)成分。一個方藥的主要藥效成分和/或藥效相關(guān)成分統(tǒng)稱為藥效關(guān)鍵組分，也就是方藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，3，5_二咖啡酰奎尼酸甲酯抗病毒活性非常強(qiáng)，但是在多數(shù)植物中的含量很低，約萬分之一。而3，5-二咖啡?？崴岷枯^高，我們采取了半合成的方式進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，將二咖啡?？崴峒柞セ?，制備二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锼幮ЫM分。
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物的制備方法，包括提取步驟和合成步驟，具體如下所述提取步驟，是對忍冬屬植物，優(yōu)選山銀花的干燥藥材，進(jìn)行水煎煮，濃縮，再經(jīng)純化得忍冬屬植物提取物的步驟。其中，所述水煎煮、濃縮，純化的具體條件優(yōu)選如下取一定量干燥藥材，以5-20倍量水煎煮兩次，每次0.5-2小時，合并煎液，減壓濃縮至0.5g生藥/mL，加于D101型大孔吸附樹脂上(上樣量與樹脂體積比為l:24)，先用3倍柱體積水洗脫，棄去水液。再用5倍柱體積10%乙醇洗脫，棄去10%乙醇洗脫液。繼用5倍柱體積3040%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，殘渣加水溶解至濃度為0.5lg生藥/ml，加稀鹽酸調(diào)pH至14后，用乙酸乙酯萃取35次，合并乙酸乙酯液，回收溶劑，得忍冬屬植物提取物。所述合成步驟，是對所述提取步驟中獲得的忍冬屬植物提取物，進(jìn)行甲酯化合成二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏牟襟E。優(yōu)選在對甲苯磺酸或二甲氨基吡啶作催化劑的條件下進(jìn)行。經(jīng)所述合成步驟獲得的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔镏邪?，3，5-二咖啡?？崴峒柞?、3，4_二咖啡?？崴峒柞ズ?，5-二咖啡?？崴峒柞ァ８鶕?jù)本發(fā)明，二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物具有抑制乙型肝炎病毒核糖核酸復(fù)制和降低乙肝病毒表面抗原表達(dá)的功能。該類化合物來源于對天然產(chǎn)物異綠原酸的結(jié)構(gòu)改造，而他們對于正常細(xì)胞的毒性較低，且經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后的化合物具有較好的抑制乙肝病毒活性，可以預(yù)期作為防治病毒性乙肝的藥物。本發(fā)明涉及的化合物合成方法簡單、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率較好、成本較低，因此具有較可行的市場化前景。并且，本發(fā)明還提供一種二咖啡?？崴犷惣柞セ衔铮涮卣髟谟?，是通過本發(fā)明的上述制備方法制取的。另外，本發(fā)明還提供一種抗流感和抗肝炎用藥物組合物，其作為有效成分含有二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物及其衍生物或前藥、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、多晶形物、酯、鹽和溶劑化物。其中，所述二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锸峭ㄟ^對忍冬屬植物提取物，優(yōu)選山銀花提取物進(jìn)行甲酯化而獲取的。這是由于山銀花植物的莖葉中二咖啡?？崴岷恳草^高，而且原料價廉易得。所述忍冬屬植物提取物制備具體步驟如下對忍冬屬植物的干燥藥材，進(jìn)行水煎煮，濃縮，再經(jīng)純化得的提取物。提取物的具體制備方法同于上述的"提取步驟"，所以在此省略其相關(guān)描述。所述的甲酯化是在對甲苯磺酸或4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為催化劑的條件下，使所述忍冬屬植物提取物，經(jīng)甲酯化合成制得二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏牟襟E。具體步驟同于上述的"合成步驟"，所以在此省略其相關(guān)描述。并且，本發(fā)明的抗流感和抗肝炎用藥物組合物中，對所含的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏牧繜o特別限制，有效劑量即可，通常含有0.1_95%重量。本發(fā)明抗流感和抗肝炎用藥物組合物，優(yōu)選為含有有效量咖啡?？崴峒柞ヮ惢衔锛氨砻婊钚詣?、賦形劑、稀釋劑、載體而制成的藥物固體制劑，藥物表面活性劑包括十二烷基硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮；載體和賦形劑包括乳糖；淀粉及其衍生物類如玉米淀粉、羧甲基淀粉鈉等；纖維素衍生物，諸如微晶纖維素，低取代羥丙纖維素、甲基和乙基纖維素；明膠；無機(jī)類化合物如輕質(zhì)氧化鎂、滑石粉等；油，諸如植物油、礦物油等；包合劑如P-環(huán)糊精；以及二元醇類如聚乙二醇。口服制劑的可做成片劑、膠囊、乳劑、溶液等，也可應(yīng)用于固體分散片、納米混懸劑、脂質(zhì)體制劑、耙向制劑和控釋制劑等。本發(fā)明涉及的化合物藥效上可接受的衍生物或前藥，意思是化合物的任何可接受的鹽，酯和酯的鹽；或者本發(fā)明化合物的其它衍生物，其在給予受者時，能直接或間接的提供本發(fā)明的化合物。尤其優(yōu)選的衍生物和前藥是，當(dāng)這種化合物給予哺乳動物時，能增加本發(fā)明化合物穩(wěn)定性的，和/或能增加本發(fā)明化合物生物利用度的(例如，使口復(fù)給藥的化合物更易于吸收入血)，和/或能增加本化合物在相關(guān)本物種的生物隔室(例如，肝臟，腫瘤)的分布。前藥是任何和載體的通過共價鍵的相連的，當(dāng)這種前藥給予哺乳動物患者時，其在體內(nèi)釋放活性化合物。優(yōu)選的前藥包括，但不限定于，增加水溶性或通過生物膜的活性透過性基團(tuán)連上本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)而形成的衍生物。本發(fā)明的化合物的前藥的制備是通過修飾在化合物中存在的取代基，用這樣的方法，這種修飾對于本化合物是能分離的，無論使用常規(guī)的方法或內(nèi)。前藥包括本發(fā)明的化合物中羥基連上任何的取代基，當(dāng)給予哺乳動物患者時，分離后形成自由的羥基。前藥的實施例包括但不限于本發(fā)明化合物中羥基的乙酰化，甲酰化等。本發(fā)明化合物的各種多晶型物構(gòu)成本發(fā)明的部分并且可以通過在不同的條件下的化合物結(jié)晶制備。例如，使用不同的通常使用餓溶劑或它們的混合物來結(jié)晶；在不同的溫度下結(jié)晶；各種不同的模式來冷卻；在結(jié)晶過程中，從非?？斓椒浅Ｂ姆秶?。多晶型物可以通過加熱或熔融化合物接著漸進(jìn)的或快速的冷卻獲得。多晶型物的存在可以NMR，IR，熱差掃描，x-光粉末衍射或其它的技術(shù)來確證。藥理實驗表明本發(fā)明的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锝M合物具有顯著的抗流感病毒活性、抗乙型肝炎病毒的作用。具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物的制備二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锇凑杖缦虏襟E制備(以山銀花中的灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.干燥藥材為例)取干燥藥材10kg，以10倍量水煎煮兩次，每次1小時，合并煎液，減壓濃縮至0.5g生藥/mL，加于D101型大孔吸附樹脂上(上樣量與樹脂體積比為1:24)，先用3倍柱體積水洗脫，棄去水液。再用5倍柱體積10%乙醇洗脫，棄去10%乙醇洗脫液。繼用5倍柱體積3040%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，殘渣加水溶解至濃度為0.5lg生藥/ml，加稀鹽酸調(diào)pH至14后，用乙酸乙酯萃取35次，合并乙酸乙酯液，回收溶劑，得原料藥提取物140g。取原料藥提取物100g，在反應(yīng)瓶中加入過量的甲醇，在對甲苯磺酸作催化劑的條件下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，回流反應(yīng)20h，加入等體積水，加壓蒸干甲醇，水溶液用乙酸乙酯(2BV)萃取2次，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑得到二咖啡酰奎尼酸類甲酯類化合物(80g)。二咖啡?？崴犷惣柞ヮ惢衔锝?jīng)LC-MSHNMR并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)構(gòu)鑒定為3，5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(3，5-Dicaffeoyquinicacidmethylester)、3，4-二咖啡?？崴峒子现?3，4-Dicaffeoyquinicacidmethylester)、4，5-二咖啡?？崴峒柞?4，5-Dicaffeoyquinicacidmethylester)。3，5-二咖啡?？崴峒柞?化合物I)淺黃色粉末。易溶于甲醇，難溶于水。m/e:529。^NMR數(shù)據(jù)見表1。結(jié)構(gòu)式見式(1)。3，4-二咖啡?？崴峒柞?化合物II)淺黃色粉末。易溶于甲醇，難溶于水。m/e:529。^NMR數(shù)據(jù)見表1。結(jié)構(gòu)式見式(11)。4，5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(化合物III)淺黃色粉末。易溶于甲醇，難溶于水。m/e:529。^NMR數(shù)據(jù)見表1。結(jié)構(gòu)式見式(III)。6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>表l:3，5-二咖啡?？崴峒柞?I);3，4-二咖啡?？崴峒柞?11)、4，5_二咖啡酰奎尼酸甲酯(iiiVhnmr數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锝M合物的片劑制備處方原料藥(實施例1中制備的二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物類化合物)15gPVPK301.5g微晶纖維素4.5g低取代羥丙纖維素0.45g羧甲基淀粉鈉0.45g硬酯酸鎂適量_制成100片將上述藥物組合物與輔料混合，加入蒸餾水適量，充分?jǐn)嚢杌靹?，探頭超聲(4000r/min)5min后，高壓乳勻(壓力lOOObar)10圈，得混懸液;真空干燥，過80目篩，70%乙醇制粒，干燥，加入硬脂酸鎂適量混勻，制成IOO片，即得。實施例3藥物的抗甲型流感病毒作用試驗藥物咖啡酰奎尼酸甲酯組分(按實施例1中制備的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔?，批號20091106)實驗材料DMEM(Gibco公司)，細(xì)胞維持液除含1%胎牛血清(FBS，美國Gibco產(chǎn)品)，其他成分同DMEM培養(yǎng)液。H印2細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株(A/PR8/34)，流感A型病毒(FluA，HlNl)，由解放軍傳染病研究所提供。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Calif產(chǎn)品。細(xì)胞毒性試驗H印2細(xì)胞或MDCK細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放在37t:的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，待細(xì)胞長成單層后，去掉培養(yǎng)液，加入0.lml維持液對半稀釋的供試藥物溶液，同時設(shè)O.lmL維持液作為空白對照。繼續(xù)置于37t:的(A培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-5d，每天在光鏡下觀察供試藥品對H印2細(xì)胞或MDCK細(xì)胞的細(xì)胞病變(CPE)情況(0:0%CPE，1:1%-25%CPE，2:25%-50%CPE，3:50%-75%CPE，4:75%-100%CPE)包括細(xì)胞單層的脫落、變圓、皺縮、胞漿中顆粒和空泡的形成。半毒性濃度(CC5。)以Pg.m"表示，最大細(xì)胞無毒濃度(MNCC)是指在光鏡下觀察檢測到的對細(xì)胞不產(chǎn)生毒性的藥品的最大濃度?？共《驹囼濰印2細(xì)胞或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，去掉培養(yǎng)液，加入0.lml病毒懸液和O.lml的MNCC為最高濃度對半稀釋后的供試藥物溶液，同時以不含供試藥物的維持液作為空白對照。96孔板置于37t:的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d。光鏡下檢測病毒引起的細(xì)胞病變情況(CPE計分同上)。病毒繁殖的減少一病毒對照的百分?jǐn)?shù)(％，virUSCOntrol=CPEexperiment/CPEviruscontrol*100%)計算，半數(shù)抑制率濃度(IC5。)以iig.ml—1表示。治療指數(shù)SI=CC5。/IC5。。實驗中達(dá)菲(奧斯他韋)為平行陽性對照藥物。表2抗FluA諷N》感染的實驗結(jié)果(MDCKcells)藥物和對照藥ic50CC50SI(嗎-mr1)(叫mr1)咖啡?？崴峒柞ソM分10.1200.019.8奧斯他韋8.3200.024.1結(jié)果表明，咖啡?？崴峒柞ソM分具有顯著的抗流感病毒活性。實驗例4藥物的體外抗肝炎病毒作用試驗藥物咖啡酰奎尼酸甲酯組分(按實施例1中制備的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔?，批號20091106)試劑DMEM(美國Gibco公司產(chǎn)品)；胎牛血清(美國Gibco產(chǎn)品)；G_418(美國Sigma公司產(chǎn)品)；HbeAg，HbsAg固定相放射免疫測定盒(中國同位素公司北方免疫試劑研究所產(chǎn)品)。2.2.15細(xì)胞為了轉(zhuǎn)染HBV(Aayw亞基)全基因組，能分泌HbeAg、HbsAg、HBV-DNA顆粒的人肝母瘤細(xì)胞系，(美國Mountsinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所病毒室傳代培養(yǎng))。實驗方法以每毫升10萬個2.2.15細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，每孔lml，37°C5%C02培養(yǎng)24小時，加無毒濃度以下2倍稀釋試驗藥液，5個稀釋度分別為4、2、1、0.5、0.25mg/ml，每濃度3孔，37t:5%C02培養(yǎng)，收集第8天含藥培養(yǎng)液，-2(TC冰凍保存。參照固相放射免疫測定盒說明書測定，用Y計數(shù)儀測定每孔cpm值。實驗設(shè)HBeAg，HBsAg陽性和陰性對昭。表3咖啡?？崴峒柞ソM分在2.2.15細(xì)胞中對HBsAg的影響藥物濃度cpm抑制率(|ag/mL)(x±s)(%)2002022±16459.0±5.51002710±13945.2±5.7503102±21037.2±7.5細(xì)胞4968±262對照表4咖啡?？崴峒柞ソM分在2.2.15細(xì)胞中對HBeAg的影響藥物濃度cpm抑制率(mg/ml)(x±s)(%)2001070±10560.1±5.71001378±15148.6±7.9501605±16440.2±7.8細(xì)胞2699±121對照實驗表明咖啡?？崴峒柞ソM分加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)8天，明顯抑制HbsAg和HbeAg的分泌，能抑制2.2.15細(xì)胞HbsAg和HbeAg的復(fù)制和表達(dá)。本發(fā)明化合物對2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對乙型肝炎病毒有抑制作用，說明其對乙型肝炎病毒有較強(qiáng)的抑制作用。實施例5藥物的體內(nèi)抗肝炎病毒作用試驗藥物咖啡酰奎尼酸甲酯組分(按實施例1中制備的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔?，批號20091106)試劑拉米夫啶(英國葛蘭素威康有限公司B022306);a-32p-dCTP(北京福瑞生物技術(shù)工程公司，批號081206);缺口翻譯藥盒(Promega公司，批號080426);鴨乙型肝炎病毒為鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強(qiáng)陽性上海麻鴨血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所病毒室提供，-7(TC保存)動物1日齡北京維鴨購自北京南苑養(yǎng)鴨場實驗方法1日齡北京鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射上海麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清，每只0.3ml，感染后7天取血，分離血清，檢測血清中DHBV-DNA含量。雛鴨血清脛檢測DHBV呈陽性后，將鴨隨機(jī)分為5組，病毒對照組、拉米夫啶組(50mg/kg)、3，5-DCQAME(160、80、40mg/kg)三個計量組，每組6只。灌胃給藥，1.5ml/只，每天2次。對照組給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥10天。分別于藥物治療后5天(T5)、10天(T1Q)和停藥后3天(P3)自鴨脛靜脈取血，分離血清，按缺口翻譯試劑和說明書方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，酶標(biāo)儀測定0D值(濾光片為490nm)，計算血清DHBV-DNA光密度，以雜交斑點OD值作為標(biāo)本DHBV-DNA水平值。表5咖啡?？崴峒柞ソM分治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>統(tǒng)計結(jié)果給藥治療組DHBV-DNA抑制率與病毒對照組同時間的DHBV-DNA抑制率比較(成組t檢驗)。*P<0.05，**P<0.01試驗結(jié)果表明，咖啡?？崴峒柞ソM分對感染鴨乙型肝炎病毒感染的鴨血清中DHBV-DNA水平的抑制效果有顯著作用實施例6二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏闹苽涠Х弱？崴犷惣柞セ衔锇凑杖缦虏襟E制備(以山銀花中的灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.干燥藥材部位為例)取干燥藥材lkg，以10倍量水煎煮兩次，每次1小時，合并煎液，減壓濃縮至0.5g生藥/mL，加于D101型大孔吸附樹脂上(上樣量與樹脂體積比為1:24)，先用3倍柱體積水洗脫，棄去水液。再用5倍柱體積10%乙醇洗脫，棄去10%乙醇洗脫液。繼用5倍柱體積3040%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，殘渣加水溶解至濃度為0.5lg生藥/ml，加稀鹽酸調(diào)pH至14后，用乙酸乙酯萃取35次，合并乙酸乙酯液，回收溶劑，得原料藥提取物14g。在反應(yīng)瓶中加入過量的200mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和催化量的50mg，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，以100ml二氯甲烷做反應(yīng)溶劑在室溫下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，反應(yīng)lh。之后，往反應(yīng)瓶中加入實施例1中原料藥提取物lg，室溫條件下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，回流反應(yīng)24h，將反應(yīng)液減壓抽慮，減壓回收反應(yīng)溶劑。加入100ml甲醇，甲醇溶液用石油醚(2BV)萃取2次，石油醚層棄去。將甲醇層減壓回收，加入100ml乙酸乙酯，乙酸乙酯溶液用水(2BV)萃取兩次，水層棄去，減壓蒸干乙酸乙酯得咖啡酰奎尼酸類甲酯類化合物600mg。二咖啡?？崴犷惣柞ヮ惢衔锝?jīng)LC-MSHNMR并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)構(gòu)鑒定為3，5-二咖啡?？崴峒柞ァ?，4-二咖啡?？崴峒柞?、4，5-二咖啡?？崴峒柞?。實施例7二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏闹苽淙』覛置潭稍锴o葉lkg，置于圓底燒瓶內(nèi)，加入12倍重量的蒸餾水回流提取，第一次10倍量蒸餾水煎煮1.0小時，濾過，濾渣加入10倍量蒸餾水回流提取1.0小時，濾過，合并二次提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮干燥后，制得浸膏；將制得的浸膏用水溶解后，上預(yù)先處理好的D101型大孔吸附樹脂，結(jié)合HPLC色譜分析，收集含有異綠原酸的部分；大孔吸附樹脂的洗脫條件大孔樹脂使用前先用5%化011、10%醋酸和95%乙醇分別處理，待用蒸餾水將樹脂洗到無醇味時，上樣，上樣濃度為0.5g生藥/ml，上樣量與樹脂的比例為l:3，上樣流速控制在0.5BV/h。先用3倍柱體積水按照流速為lBV/h沖洗，再用5倍量10%乙醇按照流速為lBV/h沖洗綠原酸，后用35%乙醇洗脫，按照流速為lBV/h收集該部分作為下一步的分離對象。35X乙醇洗脫部分溶解在蒸餾水里，調(diào)整濃度為0.7g生藥/ml，調(diào)節(jié)pH至23范圍，然后加入2倍量體積的乙酸乙酯萃取3次，得到較純的異綠原酸類化合物。得到的異綠原酸類化合物，經(jīng)減壓濃縮真空或冷凍干燥后得干粉。取提取物lg，在反應(yīng)瓶中加入過量的甲醇，在對甲苯磺酸作催化劑的條件下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，回流反應(yīng)20h，加入等體積水，加壓蒸干甲醇，水溶液用乙酸乙酯(2BV)萃取2次，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑得到咖啡?？崴犷惣柞ヮ惢衔?0.7g)。二咖啡酰奎尼酸類甲酯類化合物經(jīng)LC-MSHNMR并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)構(gòu)鑒定為3，5-二咖啡?？崴峒柞?、3，4-二咖啡?？崴峒柞ァ?，5-二咖啡?？崴峒柞?。權(quán)利要求一種二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏闹苽浞椒?，包括提取步驟，是對忍冬屬植物的干燥藥材，進(jìn)行水煎煮，濃縮，再經(jīng)純化得忍冬屬植物提取物的步驟；和合成步驟，是對所述提取步驟中得的忍冬屬植物提取物，進(jìn)行甲酯化合成二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏牟襟E。2.如權(quán)利要求1所述的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，所述提取步驟中，所述水煎煮是以5-20倍量水煎煮兩次，每次0.5-2小時；所述濃縮是減壓濃縮；所述純化是加于大孔吸附樹脂上的柱層析，所述合成步驟是在對甲苯磺酸或二甲氨基吡啶作催化劑的條件下進(jìn)行的。3.如權(quán)利要求1所述的二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏闹苽浞椒?，其特征在于，所述二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锇?，5-二咖啡酰奎尼酸甲酯、3，4-二咖啡?？崴峒柞?、和4，5-二咖啡?？崴犷惣柞セ衔?。4.如權(quán)利要求1所述的二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物的制備方法，其特征在于，所述忍冬屬植物為山銀花。5.二咖啡?？崴犷惣柞セ衔?，其特征在于，是通過權(quán)利要求1至4中所述的任一制備方法制取。6.—種抗流感和抗肝炎用藥物組合物，其作為有效成分含有權(quán)利要求5所述的二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物及藥效上可接受的衍生物或前藥、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、多晶形物、S旨、鹽和溶劑化物。7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物在用于制備抗流感和抗肝炎藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锏闹苽浞椒捌淇沽鞲泻涂垢窝子盟幬锝M合物。本發(fā)明的二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物的制備方法，從忍冬屬植物中提取分離并化學(xué)修飾得到二咖啡?？崴犷惣柞セ衔铮⒅苽淦淇沽鞲泻涂垢窝子盟幬锝M合物。根據(jù)本發(fā)明可從二咖啡?？崴犷惣柞セ衔锖繕O低的植物中，大量生產(chǎn)作為有效成分含有二咖啡酰奎尼酸類甲酯化合物的抗流感和抗肝炎用藥物。文檔編號C07C67/08GK101774921SQ20101011766公開日2010年7月14日申請日期2010年3月4日優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日發(fā)明者張?zhí)鹛?肖小河,袁海龍,趙艷玲申請人:中國人民解放軍第三○二醫(yī)院