一種酵母生產(chǎn)(s)-氟苯羥丙酸甲酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞生物催化制備手性 醫(yī)藥中間體（S) -3- (4-氟苯基）-3-羥基丙酸甲酯的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性（S) -3- (4-氟苯基）-3-羥基丙酸甲酯是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品 和其他特殊材料的重要中間體。生物催化不對稱反應(yīng)具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等 優(yōu)點(diǎn)，作為綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來越多地應(yīng)用于生產(chǎn)一些高附加值 的手性化合物。生物催化制備手性（S)-3_(4-氟苯基）_3_羥基丙酸甲酯具有很好的應(yīng)用 前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學(xué)拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業(yè)上的應(yīng)用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學(xué)拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學(xué)活性手性化合物的比例為4: 2:1。
[0004] 生物還原法相對于動力學(xué)拆分法而言，最大的優(yōu)勢在于理論收率可達(dá)100%，原子 經(jīng)濟(jì)性好。然而生物還原反應(yīng)需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應(yīng)用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應(yīng)中多釆用整細(xì)胞作為催化劑，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)-3_(4-氟苯基）_3_羥基丙酸甲酯是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品的重 要手性砌塊，?，F(xiàn)有的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴(yán) 重缺陷，難于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細(xì)胞催化制備（S)-3_(4-氟苯基）_3_羥 基丙酸甲酯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞催化制備（S) -3- (4-氟苯基）-3-羥基丙酸甲酯，反應(yīng)式 如下：
底物4-氟苯甲酰乙酸甲酯（1)經(jīng)產(chǎn)朊假絲酵母催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物（S)-3-(4-氟苯 基）-3-羥基丙酸甲酯（2)。有多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定采 用產(chǎn)朊假絲酵母作為催化劑，因?yàn)槠浯呋磻?yīng)的效果最好，反應(yīng)收率、對映體過量率（ee%) 均很高。
[0007] 許多產(chǎn)朊假絲酵母都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng) 實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明選用產(chǎn)朊假絲酵母菌株為ATCC 34964，其催化反應(yīng)效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD (P)H依賴型，而細(xì)胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)時，為促進(jìn)輔酶再生，提高反應(yīng)效率，在反應(yīng)體系中 還添加輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細(xì)胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)確定的輔助底物為：木糖20-24g/L、麥芽糖36-40g/L、異 丙醇3. 5-4. 5%V/V (體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH為 6. 0;配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：葡萄糖 20-22 g/L，麥芽浸膏 23-25 g/L，（NH4)2S04 4. 8-5 . 3 g/L， KH2P049-11g/L，MgS04. 7H20 0? 3-0. 4 g/L，CaCl20? 35-0. 4 g/L,硫酸銨 0? 2-0. 25g/L，硫 酸鎂 0? 3-0. 4g/L，pH5. 6。
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 酵母細(xì)胞制備。產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入 培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為〇. 6-0. 7,121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至30-31°C，將產(chǎn)朊假絲酵母種 子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為6-6. 5%，通氣比為1. 7-1. 8VAV分鐘)，30-31°C培養(yǎng)44-46 小時，用過濾式離心機(jī)離心得到濕酵母細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0014] 生物催化轉(zhuǎn)化 底部通氣攪拌反應(yīng)罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6.0,加入底物4-氟苯甲酰乙酸甲 酯，使底物濃度為80-90 g/L。其他成份：麥芽浸膏22-26 g，直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為 19-20g/L，木糖 20-24g/L、麥芽糖 36-40g/L、異丙醇 3. 5-4. 5%V/V (體積濃度），121°C 高壓滅 菌30分鐘；冷卻至30-31°C時，加入濕酵母細(xì)胞使?jié)舛葹?1-66g/L，通氣比為0. 15-0. 16V/ (V分鐘)，即每分鐘通氣量為0. 15-0. 16倍反應(yīng)液體積，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時間 為65-70小時；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物 (S) -3- (4-氟苯基）-3-羥基丙酸甲酯，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98-99 %，產(chǎn)品收率96-97 %，對映體過量 率 98. 5-99%。
[0015] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應(yīng)條件優(yōu)化(反應(yīng)溫度、通氣量、pH)、反 應(yīng)介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、麥芽浸膏含量、輔助底物組合、表面活性劑種類及 濃度等。
[0016] 實(shí)施例1 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH為6.0; 配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 培養(yǎng)液成份為：葡萄糖20 g/L，麥芽浸膏23 g/L，木糖6 g/L，（NH4)2S04 4. 8 g/L， KH2P04 9 g/L，MgS04. 7H20 0? 3 g/L，CaCl2 0? 35 g/L，硫酸銨0? 2g/L，硫酸鎂0? 3g/L，pH為6. 0. 2〇
[0018] 濕酵母細(xì)胞制備過程如下：產(chǎn)朊假絲酵母ATCC 34964經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到種 子液。10L發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至30-31°C，將產(chǎn)朊假絲酵母 種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為6%，通氣比為1. 7V/ (V分鐘），30-31°C培養(yǎng)46小時，用 過濾式離心機(jī)離心得到濕酵母細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0019] 生物催化轉(zhuǎn)化：0. 5L底部通氣攪拌反應(yīng)器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 0,加入 底物4-氟苯甲酰乙酸甲酯，使?jié)舛葹?0 g/L，麥芽浸膏22 g，直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚 為20g/L，木糖24g/L、麥芽糖36g/L、異丙醇3. 5%V/V (體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘； 冷卻至30-31°C時，加入濕酵母細(xì)胞使?jié)舛葹?1g/L，通氣比為0. 15V/ (V分鐘)，進(jìn)行生物 催化反應(yīng)，反應(yīng)時間為70小時；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸 乙酯，得到產(chǎn)物（S) -3- (4-氟苯基）-3-羥基丙酸甲酯，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99 %，產(chǎn)品收率97 %，對 映體過量率98. 5%。
[0020] 實(shí)施例2 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g