一種細胞生產(chǎn)(s)-氯苯丙酸甲酯的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到近平滑假絲酵母細胞生物催化制備手 性醫(yī)藥中間體（S) -3- (4-氯苯基）-3-羥基丙酸甲酯的技術。
【背景技術】
[0002] 手性（S) _3_ (4_氯苯基）_3_羥基丙酸甲酯是合成手性藥物、精細化學品、農(nóng)藥品 和其他特殊材料的重要中間體。生物催化不對稱反應具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等 優(yōu)點，作為綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來越多地應用于生產(chǎn)一些高附加值 的手性化合物。生物催化制備手性（S)-3-(4-氯苯基）-3_羥基丙酸甲酯具有很好的應用 前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業(yè)上的應用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學活性手性化合物的比例為4: 2:1。
[0004] 生物還原法相對于動力學拆分法而言，最大的優(yōu)勢在于理論收率可達100%，原子 經(jīng)濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑，實現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)-3_(4-氯苯基）_3_羥基丙酸甲酯是合成手性藥物、精細化學品、農(nóng)藥品的重 要手性砌塊，?，F(xiàn)有的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴 重缺陷，難于進行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細胞催化制備（S)-3-(4-氯苯基）-3-羥 基丙酸甲酯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用近平滑假絲酵母細胞催化制備（S)-3-(4-氯苯基）-3_羥基丙酸甲 酯，反應式如下：
底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯（1)經(jīng)近平滑假絲酵母催化反應，得到產(chǎn)物（S)-3-(4-氯 苯基）-3-羥基丙酸甲酯（2)。有多種微生物可以催化此反應，經(jīng)過大量實驗篩選，最終確 定采用近平滑假絲酵母作為催化劑，因為其催化反應的效果最好，反應收率、對映體過量率 (ee%)均很高。
[0007] 許多近平滑假絲酵母都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大， 經(jīng)實驗，本發(fā)明選用近平滑假絲酵母菌株為ATCC 20008，其催化反應效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD (P)H依賴型，而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進行氧化還原反應時，為促進輔酶再生，提高反應效率，在反應體系中 還添加輔助底物構成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過大量實驗確定的輔助底物為：木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、異丙 醇5-6%V/V (體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，PH6. 8; 配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：葡萄糖37-44 g/L，木糖7-8g/L，玉米胚芽粉10-12 g/L，酵母提 取物 4-5 g/L，（NH4) 2H P04 12-15 g/L，KH2P0 4 6. 5-7. 5 g/L. MgS04 ? 7H20 0? 7-0. 8 g/L，NaCl 0.08-0.1 g/L; pH6.8。
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 酵母細胞制備。近平滑假絲酵母經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加 入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至29-30°C，將近平滑假絲酵母種子液接種至發(fā)酵 罐，接種比例為6-6. 5%，通氣比為0. 5-0. 7VAV分鐘），29-30°C培養(yǎng)44-48小時，用過濾式 離心機離心得到濕酵母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0014] 生物催化轉(zhuǎn)化。底部通氣攪拌反應罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 6,加入底物 4_氯苯甲酰乙酸甲酯，使底物濃度為80-90 g/L。其他成份：麥芽浸膏22-26 g，平平加0 (PerogolO, 15個單位的氧乙稀與油醇的縮合物）19-20g/L，木糖45-50g/L、鹿糖25-28g/L、 異丙醇5-6%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至24-25°C時，加入濕酵母細胞 使?jié)舛葹?9-92g/L，通氣比為0. 15-0. 16V/ (V分鐘)，即每分鐘通氣量為0. 15-0. 16倍反 應液體積，進行生物催化反應，反應時間為78-82小時；反應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯 萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（S)-3-(4-氯苯基）-3-羥基丙酸甲酯，反應轉(zhuǎn)化率 98-99 %，產(chǎn)品收率96-97 %，對映體過量率98. 5-99 %。
[0015] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應條件優(yōu)化(反應溫度、通氣量、pH)、反 應介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、麥芽浸膏含量、輔助底物組合、表面活性劑種類及 濃度等。
[0016] 實施例1 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6.8;配制 固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 培養(yǎng)液成份為：葡萄糖37 g/L，木糖78g/L，玉米胚芽粉10 g/L，酵母提取物4 g/L, (NH4) 2H P04 12 g/L, KH2P0 4 6.5 g/L. MgS04 . 7H20 0.7 g/L, NaCl 0.08 g/L; pH6. 8〇
[0018] 濕酵母細胞制備過程如下：近平滑假絲酵母ATCC 20008經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到 種子液。1L發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至29°C，將近平滑假絲酵母 種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為6%，通氣比為0. 5VAV分鐘），29°C培養(yǎng)44小時，用過濾 式離心機離心得到濕酵母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0019] 生物催化轉(zhuǎn)化：0. 5L底部通氣攪拌反應器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 6,加入 底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使?jié)舛葹?0 g/L，麥芽浸膏22 g，平平加0 (PerogolO, 15個 單位的氧乙烯與油醇的縮合物）19g/L，木糖45g/L、蔗糖28g/L、異丙醇6%V/V (體積濃度）， 121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至29°C時，加入濕酵母細胞使?jié)舛葹?9g/L，通氣比為0. 15V/ (V分鐘)，進行生物催化反應，反應時間為78小時；反應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取 反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（S)-3-(4-氯苯基）-3-羥基丙酸甲酯，反應轉(zhuǎn)化率99 %， 產(chǎn)品收率97%，對映體過量率98. 5%。
[0020] 實施例2 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白