專利名稱：可用于抑制chki的雜芳基脲衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于抑制酶的化合物，該酶維持和修復(fù)遺傳物質(zhì)的完整性。更具體地，本發(fā)明涉及一系列芳基-和雜芳基-取代的脲化合物，制備這些化合物的方法以及它們例如在治療病癥和其它的以脫氧核糖核酸(DNA)復(fù)制、染色體分離或細(xì)胞分裂中的缺陷為特征的疾病中用作治療劑的用途。

背景技術(shù)：
大量不同的疾病、病癥和障礙(以下稱為“適應(yīng)癥”)特征在于涉及異常增殖的細(xì)胞。用在此處時(shí)，“異常增殖的細(xì)胞”(或“異常的細(xì)胞增殖”)指脫離正常的、適當(dāng)?shù)幕蝾A(yù)料的進(jìn)程的細(xì)胞增殖。例如，異常的細(xì)胞增殖包括其中DNA或其它細(xì)胞組分被損傷或缺陷時(shí)的不適當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖。異常的細(xì)胞增殖還包括由不適當(dāng)?shù)母咚郊?xì)胞分裂、不適當(dāng)?shù)牡退郊?xì)胞死亡(例如，凋亡)或二者同時(shí)引起、介導(dǎo)或作為其結(jié)果的適應(yīng)癥。這類適應(yīng)癥可例如以細(xì)胞、細(xì)胞群或組織的單一或多重局部異常增殖為特征，包括癌癥性(良性或惡性)和非病癥性適應(yīng)癥。
根據(jù)定義，所有的癌癥(良性和惡性)都涉及某種形式的異常細(xì)胞增殖。某些非癌癥性適應(yīng)癥也涉及異常細(xì)胞增殖。涉及異常細(xì)胞增殖的非癌癥性適應(yīng)癥的實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、白癜風(fēng)、韋格內(nèi)氏(Wegener′s)肉芽腫病以及全身性紅斑狼瘡。
一種治療涉及異常增殖的細(xì)胞的適應(yīng)癥的方法包括使用DNA損傷劑。這些試劑被設(shè)計(jì)為通過中斷諸如DNA代謝，DNA合成，DNA轉(zhuǎn)錄以及微管紡錘體形成的活細(xì)胞進(jìn)程而殺死異常增殖的細(xì)胞。它們也可例如通過對DNA引入擾亂染色體結(jié)構(gòu)完整性的損傷而起作用。DNA損傷劑以這種方式被設(shè)計(jì)和給予為試圖對異常增殖的細(xì)胞誘導(dǎo)最大限度的損傷及隨后的細(xì)胞死亡，而對正常的健康細(xì)胞僅有最小限度的損傷。
到目前為止，已經(jīng)開發(fā)出大量不同的DNA損傷劑，包括化學(xué)療法和放射療法，其它的也正在開發(fā)過程中。遺憾的是，DNA損傷劑在治療涉及異常細(xì)胞增殖的病癥中的有效性還不能達(dá)到要求，尤其是在治療癌癥中。這類活性劑對異常增殖的細(xì)胞和健康細(xì)胞的選擇性(有時(shí)稱為治療指數(shù))通常是勉強(qiáng)夠格的。
此外，所有細(xì)胞都具有感知和修復(fù)機(jī)制，其可以與DNA損傷劑以相反目的起作用。這類稱為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的感知機(jī)制幫助維持各種細(xì)胞復(fù)制階段的次序并保證每一步都以高保真度完成(Hartwell等人，Science，246629-634，(1989)；Weinert等人，Genes Dev.，8652，(1994))。當(dāng)細(xì)胞檢測到DNA損傷時(shí)，包括檢測到由DNA損傷劑有意誘導(dǎo)的DNA損傷時(shí)，某些信號(hào)通路活化細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，細(xì)胞復(fù)制周期暫時(shí)停止(“停滯”)。這種停滯使得異常增殖的細(xì)胞有時(shí)間修復(fù)它們的DNA，通常達(dá)到足以使受影響的細(xì)胞繼續(xù)存活和增殖的程度。在異常增殖細(xì)胞情況下，這種修復(fù)是不所需的，因?yàn)槠淇赡芷茐淖阋哉T導(dǎo)DNA損傷以殺死異常增殖細(xì)胞的努力。
例如，稱為GEMZARTM的化療劑(吉西他濱，或2’，2’-二氟-2’-脫氧胞苷)通過在合成過程中將其自身結(jié)合進(jìn)DNA而損傷DNA。留下的未修復(fù)的受損DNA通常導(dǎo)致不能存活。但是，在許多靶向細(xì)胞中，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)檢查不適當(dāng)產(chǎn)生的(或損傷的)DNA?；罨募?xì)胞周期檢查點(diǎn)觸發(fā)細(xì)胞周期停滯一段時(shí)間，該段時(shí)間足以使得受損DNA被修復(fù)，這是異常增殖的細(xì)胞理論上抵抗諸如化療劑的DNA損傷劑，輻射和其它療法的細(xì)胞殺傷效果的一種方式。
其它DNA損傷劑引起腫瘤細(xì)胞在S期停滯。腫瘤細(xì)胞已被發(fā)現(xiàn)在化療劑被施用時(shí)簡單地通過停滯在S期而抵抗某些化療劑，然后當(dāng)藥物一被去除時(shí)，DNA損傷就被修復(fù)，細(xì)胞周期停滯停止，細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期的剩余部分(Shi等人，Cancer Res.611065-72，2001)。其它治療劑引起細(xì)胞周期停滯在其它檢查點(diǎn)，包括G1和G2。因此，預(yù)期抑制各種DNA損傷檢查點(diǎn)有助于防止細(xì)胞修復(fù)治療上誘導(dǎo)的DNA損傷，使靶向細(xì)胞對DNA損傷劑敏感。繼而，這種致敏作用被預(yù)期能增加這些療法的治療指數(shù)。
遍及所有真核物種，細(xì)胞周期在結(jié)構(gòu)和功能上在其基本過程和調(diào)節(jié)方式方面是相同的，有絲分裂(體細(xì)胞)細(xì)胞周期由以下四個(gè)階段組成G1(間隙)期、S(合成)期、G2(間隙)期和M(有絲分裂)期。Gl、S和G2期統(tǒng)稱為細(xì)胞周期的間期。在Gl期，細(xì)胞的生物合成活性以高速率進(jìn)行。當(dāng)DNA合成開始時(shí)S期開始，當(dāng)細(xì)胞核的DNA含量被復(fù)制并形成兩套相同的染色體時(shí)S期終止。
然后，細(xì)胞進(jìn)入G2期，其持續(xù)到有絲分裂開始。在有絲分裂中，染色體配對并分離，兩個(gè)新的細(xì)胞核形成并發(fā)生胞質(zhì)分裂，其中細(xì)胞分裂為兩子細(xì)胞，每一個(gè)接受含有兩套染色體之一的核。胞質(zhì)分裂使M期終止并標(biāo)志著下一細(xì)胞周期的間期的開始。細(xì)胞周期事件進(jìn)行的順序?yàn)閲?yán)格調(diào)節(jié)的，以至于一個(gè)細(xì)胞周期事件的起始依賴于之前的細(xì)胞周期的完成。這使得從一代體細(xì)胞至下一代在遺傳物質(zhì)的復(fù)制和分離中的保真度成為可能。
據(jù)報(bào)道，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)包括至少三種不同種類的多肽，它們相繼對細(xì)胞周期信號(hào)或染色體機(jī)制中的缺陷作出反應(yīng)(Carr，Science，271314-315，(1996))。第一類為檢測或感知DNA損傷或細(xì)胞周期中異常的一族蛋白質(zhì)。這些感受器包括共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白(Atm)和共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張Rad相關(guān)蛋白(Atr)。第二類多肽放大和傳遞由檢測器檢測的信號(hào)，例如Rad53(Alen等人，Genes Dev.82416-2488，(1994))和Chkl。第三類多肽包括介導(dǎo)例如有絲分裂和凋亡的停滯的細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞周期效應(yīng)子，例如p53。
目前對細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的功能的了解大多數(shù)源于對腫瘤衍生細(xì)胞系的研究，在很多情況下，腫瘤細(xì)胞已失去關(guān)鍵的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(Hartwell等人，Science 266182128，1994)。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞向腫瘤性狀態(tài)的演變中的關(guān)鍵步驟是獲得使細(xì)胞周期檢查點(diǎn)途徑失活的突變，如那些涉及p53的突變(Weinberg，Cell 81323-330，1995；Levine，Cell 883234331，1997)。失去這些細(xì)胞周期檢查點(diǎn)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不顧DNA損傷而復(fù)制。
具有完整細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的非腫瘤性組織通常避免了暫時(shí)的單一檢查點(diǎn)通路中斷。但是，腫瘤細(xì)胞在控制細(xì)胞周期進(jìn)程的通路中具有缺陷，以至于對另外的檢查點(diǎn)的擾亂使它們對DNA損傷劑尤其敏感，例如，含有p53突變的腫瘤細(xì)胞在G1 DNA損傷檢查點(diǎn)和維持G2 DNA損傷檢查點(diǎn)兩方面(Bunz等人，Science，2821497 501，1998)有缺陷。靶向G2檢查點(diǎn)或S期檢查點(diǎn)起始的檢查點(diǎn)的抑制劑預(yù)期可進(jìn)一步削弱這些腫瘤細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的能力，因此是增強(qiáng)放射和全身化療的治療指數(shù)的候選者(Gesner，Abstract at SRI ConferenceProtein Phosphorylation and DrugDiscovery World Summit，March 2003)。
在DNA損傷或DNA復(fù)制的任何障礙物存在下，檢查點(diǎn)蛋白Atm和Atr發(fā)動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Atm已被證實(shí)在應(yīng)答電離輻射(IR)的DNA損傷檢查點(diǎn)中起作用。Atr被引起雙鏈DNA斷裂、單鏈DNA斷裂的物質(zhì)和阻斷DNA輻射的物質(zhì)刺激。
Chkl為蛋白激酶，其位于DNA損傷檢查點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Atm和/或Atr的下游(Sanchez等人，Science，2771497-1501，1997；U.S.專利No.6,218,109)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Chkl應(yīng)答包括電離輻射(1R)、紫外(UV)光和羥基脲在內(nèi)的引起DNA損傷的物質(zhì)而磷酸化(Sanchez等人，同上；Lui等人，Genes Dev.，141448-59，2000)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中活化Chkl的該磷酸化依賴于Atm(Chen等人，Oncogene，18249-56，1999)和Atr(Lui等人，同上)。此外，Chkl被證實(shí)磷酸化wee1(O′Connell等人，EMBO J.，16545-554，1997)和Pdsl(Sanchez等人，Science，2861166-1171，1999)，已知它們的基因產(chǎn)物在細(xì)胞周期調(diào)控中很重要。
這些研究證實(shí)哺乳動(dòng)物Chkl在導(dǎo)致在S期停滯的Atm依賴的DNA損傷檢查點(diǎn)中起作用。Chkl在S期哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的作用最近被闡明(Feiioo等人，J.Cell Biol.，154913-923，2001；Zhao等人，PNAS U.S.A.，9914795-800，2002；Xiao等人，J Biol Chem.，278(24)21767-21773，2003；Sorensen等人，Cancer Cell，3(3)247-58，2003)，強(qiáng)調(diào)了Chkl在監(jiān)視DNA合成的完整性方面的作用。Chk1通過使調(diào)節(jié)cyclinA/cdk2活性的Cdc25A磷酸化而引起S期停滯(Xiao等人，supra and Sorenseneta.，前述)。Chkl還通過使Cdc25C磷酸化并失活而引起G2停滯，其中Cdc25C為雙特異性磷酸酶，當(dāng)細(xì)胞從G2進(jìn)入有絲分裂時(shí)其通常使cyclin-B/cdc2(也稱為Cdkl)去磷酸化(Fernery等人，Science，2771495-7，1997；Sanchez等人，supra；Matsuoka等人，Science，282893-1897，1998；和Blasina等人，Curr.Biol.，91-10，1999)。在兩種情況下，對Cdk活性的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，以防止存在DNA損傷或未復(fù)制的DNA細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。
其它種類的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)抑制劑在G1或G2/M期起作用。UCN-01，或7-羥基十字孢堿，起初作為非特異性激酶抑制劑被分離，主要作用于蛋白激酶C，但其最近被發(fā)現(xiàn)抑制Chkl的活性并解除G2細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(Shi等人，前述)。因?yàn)閁CN-01為非選擇性Chkl抑制劑，因此其在高劑量時(shí)對細(xì)胞有毒性。在低劑量時(shí)，它非特異性地抑制很多細(xì)胞激酶并且還抑制Gl檢查點(diǎn)(Tenzer等人，Curr，Med Chem.Anti-Cancer Agents，335-46，2003)。
UCN-01已與其它癌癥療法聯(lián)合使用，例如放射、抗癌劑喜樹堿(Tenzer等人，前述)以及吉西他濱(Shi等人，前述)，取得有限的成功。此外，UCN-01也已被用于加強(qiáng)在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中替莫唑胺(TMZ)誘導(dǎo)的DNA錯(cuò)配修復(fù)(MMR)的效果(Hirose等人，Cancer Res.，615843-5849，2001)。在臨床上，UCN-01并非如所期待的為有效的化療劑，可能是由于治療方案的失敗和缺乏對具體關(guān)鍵分子靶標(biāo)的鑒定而導(dǎo)致(Grant等人，Drug ResistanceUpdates，615-26，2003)。所以，Mack等人報(bào)道了UCN-01在培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺病細(xì)胞系中對順鉑的細(xì)胞周期依賴性增強(qiáng)，但是未特異性地鑒定出UCN-01靶向的關(guān)鍵性細(xì)胞周期檢查點(diǎn)。(Mack等人，Cancer ChemotherPharmacol.，51(4)337-348，2003)。
存在幾種其它的用于使腫瘤細(xì)胞對影響細(xì)胞周期的化療劑敏感的策略。例如，施用2-氨基嘌呤解除了多細(xì)胞周期檢查點(diǎn)機(jī)制，例如含羞草堿誘導(dǎo)的G1停滯或羥基脲誘導(dǎo)的S期停滯，使細(xì)胞進(jìn)入并經(jīng)過有絲分裂(Andreassen等人，Proc Natl Acad Sci USA.，862272-2276，1992)?？Х纫?，一種甲基黃嘌呤，已被用于增強(qiáng)諸如順鉑和電離輻射的DNA損傷劑的細(xì)胞毒性，其介導(dǎo)穿過G2檢查點(diǎn)的發(fā)展，并由此誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。(Bracey等人，Clin.Cancer Res.，31371-1381，1997)。但是，用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期解除的咖啡固的劑量超過了臨床上可接受的水平，不是可行的治療選擇。另外，Chkl激酶的反義核酸已被用于增加對拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑BNPl350的敏感性(Yin等人，Biochem。Biophys.Res.Commun.，295435-44，2002)，但是也表現(xiàn)出通常與反義治療和基因療法相關(guān)的問題。
Chkl抑制劑已經(jīng)公開，包括在美國專利申請No.10/087,715和美國臨時(shí)專利申請60/583,080、60/585,292和60/602,968描述的芳基-和雜芳基取代的脲化合物；在美國專利公開No.2004/0014765、美國專利公開No.US2003/199511、美國專利公開No.2004/0014765和WO03/101444描述的雙芳基脲化合物；在Fan等人，Cancer Res.551649-54，1995中描述的甲基黃嘌呤及相關(guān)化合物；在WO03/029241和WO03/028731中描述的脲基噻吩類；描述于WO 03/028724的N-吡咯并吡啶基酰胺類；描述于WO01/57206和美國專利No.6,211,164的反義Chkl寡核苷酸；描述于WO00/16781的Chkl受體拮抗劑；WO 03/037886雜芳族酰胺衍生物；描述于WO 03/029242的氨基噻吩類；描述于WO 03/004488的(吲唑基)苯并咪唑類；描述于美國專利No.20040092535和WO04/018418的苯并咪唑喹啉酮類；描述于WO 02/16326的雜環(huán)-羥基亞氨基-芴類；含有雙歧藻屬(scytoneman)骨架的衍生物，例如在美國專利No.6,495,586描述的scytonemin；描述于WO 01/53274的雜芳基苯甲酰胺類；描述于WO 01/53268的吲唑化合物；由Tenzer等人(前述)描述的吲哚咔唑類；描述于WO02/070515色烷衍生物；paullones(Schultz等人，J.Med.Chem.Vol2909-2919，1999)；描述于WO 99/17769的茚并吡唑類；Sedlacek等人于Int J.Oncol.，91143-1168，1996描述的黃酮類；絲氨酸蘇氨酸激酶的肽環(huán)的肽衍生物(WO 98/53050)；羥吲哚類(WO03/051838)；描述于WO2004/063198的二氮雜并吲哚酮類(diazepinoindolones)；描述于WO2004/048343的嘧啶類；描述于WO2004/014876的脲化合物；和描述于WO2003/091255的吡咯咔唑類(pyrrolocarbazoles)、苯并呋喃并異吲哚類(benzofuroisoindoles)和氮雜環(huán)戊芴類(azacyclopentafluorenes)。
但是，在本領(lǐng)域仍亟需有效的和選擇性的Chkl抑制劑，本發(fā)明致力于該需要以及其它需要。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及在生物化學(xué)和/或基于細(xì)胞的試驗(yàn)方面顯示出出乎意料性能的檢測點(diǎn)激酶Chkl的強(qiáng)效和選擇性抑制劑。本發(fā)明的Chkl抑制劑可用于治療涉及異常細(xì)胞增殖的適應(yīng)癥，以及可在涉及DNA損傷或DNA復(fù)制中缺陷的適應(yīng)癥的治療中作為化學(xué)增敏和放射增敏劑。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供結(jié)構(gòu)式(I)化合物。這些化合物可用于抑制Chkl的方法中，該方法包括將有效量的結(jié)構(gòu)式(I)的化合物給需要其的個(gè)體施用的步驟。
式(I)化合物的結(jié)構(gòu)式為
其中R1為鹵素、C1-3烷基、CN或CF3； R2為氫、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、鹵素、或N(Rb)2，其中Rb獨(dú)立地為氫或C1-3烷基； R3為6-或7-元飽和雜環(huán)，其中包含一個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)或者第二個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)、環(huán)氧或環(huán)硫，其中的Ra獨(dú)立地為氫、C1-3烷基、CH2CN或CH2CH2CN，而且其中的R3任選被氧代(＝O)取代； R4為氫、C1-3烷基、OC1-3烷基、SC1-3烷基、N(Rb)2、NRbC(＝O)C1-3烷基、或5-或6-元飽和雜環(huán)，其中包含一個(gè)N-Ra基團(tuán)和任選被1-3個(gè)C1-3烷基基團(tuán)取代的環(huán)； 或R2和R4與和其連接的碳一起形成5-～7-元飽和碳環(huán)狀環(huán)； R5為氫或鹵素， 條件是R2和R4中至少一個(gè)不是氫，而且當(dāng)R5為鹵素時(shí)，R2或R4為氫， 或其可藥用鹽、前藥或溶劑合物。
本發(fā)明的另一方面是提供結(jié)構(gòu)式(II)化合物，這些化合物可用于抑制Chkl的方法中。

其中R1為鹵素、C1-3烷基、CN或CF3； R2為氫、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、鹵素、或N(Rb)2，其中Rb獨(dú)立地為氫或C1-3烷基； R3為6-或7-元飽和雜環(huán)，其中包含一個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)或者第二個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)、環(huán)氧或環(huán)硫，其中的Ra獨(dú)立地為氫、C1-3烷基或CH2CN，而且其中的R3任選被氧代(＝O)取代； R4為氫、C1-3烷基、OC1-3烷基或鹵素； 或R2和R4與和其連接的碳一起形成5-～7-元飽和碳環(huán)狀環(huán)； 條件是R2和R4中至少一個(gè)不是氫， 或其可藥用鹽、前藥或溶劑合物。
本發(fā)明的另一方面是提供包含一種或多種結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物的藥物組合物，以及該組合物用于治療適應(yīng)癥的用途，其中體內(nèi)或離體狀態(tài)對Chk1的抑制作用有助于治療或有益于研究或診斷。
本發(fā)明的另一方面是提供致敏由于適應(yīng)癥而接受化療或放療的個(gè)體中的細(xì)胞的方法，包括將結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物與化療劑和放療劑之一或兩者聯(lián)合給個(gè)體施用。通過該方法治療的非限制性適應(yīng)癥為癌癥。
本發(fā)明的另一方面是提供抑制或預(yù)防異常細(xì)胞增殖的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將含有異常增殖細(xì)胞的細(xì)胞群與至少一種一定量的Chk1活化劑接觸一段時(shí)間，所述量和時(shí)間足以使異常增殖細(xì)胞間的細(xì)胞周期停滯基本同步化。在細(xì)胞群中獲得細(xì)胞周期停滯的基本同步后，使細(xì)胞群與足以基本上解除細(xì)胞周期停滯的至少一種一定量的Chk1抑制劑接觸一段時(shí)間。
本發(fā)明的另一方面是提供一種人類藥用制成品，其包括 (a)包含結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物的藥物組合物； (b)包裝說明書，規(guī)定該組合物用于治療包括異常細(xì)胞增殖在內(nèi)的適應(yīng)癥，和 (c)容器。
本發(fā)明的另一方面是提供 (a)包含結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物的藥物組合物； (b)包裝說明書，規(guī)定該組合物適合在治療與DNA損害或DNA復(fù)制有關(guān)的適應(yīng)癥中用作化學(xué)增敏劑或放射增敏劑； (c)容器。
以下的詳細(xì)說明將會(huì)使本發(fā)明的方方面面變得顯而易見。
發(fā)明詳述 本發(fā)明化合物具有結(jié)構(gòu)式(I)
其中R1為鹵素、C1-3烷基、CN或CF3； R2為氫、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、鹵素、或N(Rb)2，其中Rb獨(dú)立地為氫或C1-3烷基； R3為6-或7-元飽和雜環(huán)，其包含一個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)或者第二個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)、環(huán)氧或環(huán)硫，其中的Ra獨(dú)立地為氫、C1-3烷基、CH2CN或CH2CH2CN，而且其中的R3任選被氧代(＝O)取代； R4為氫、C1-3烷基、OC1-3烷基、SC1-3烷基、N(Rb)2、NRbC(＝O)C1-3烷基、或5-或6-元飽和雜環(huán)，其包含一個(gè)N-Ra基團(tuán)和任選被1-3個(gè)C1-3烷基基團(tuán)取代的環(huán)； 或R2和R4與和其連接的碳一起形成5-～7-元飽和碳環(huán)狀環(huán)； R5為氫或鹵素， 條件是R2和R4中至少一個(gè)不是氫，而且當(dāng)R5為鹵素時(shí)，R2或R4為氫， 或其可藥用鹽、前藥或溶劑合物。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)式(II)
其中R1為鹵素、C1-3烷基、CN或CF3； R2為氫、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、鹵素、或N(Rb)2，其中Rb獨(dú)立地為氫或C1-3烷基； R3為6-或7-元飽和雜環(huán)，其包含一個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)或者第二個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)、環(huán)氧或環(huán)硫，其中的Ra獨(dú)立地為氫、C1-3烷基或CH2CN，而且其中的R3任選被氧代(＝O)取代； R4為氫、C1-3烷基、OC1-3烷基或鹵素； 或R2和R4與和其連接的碳一起形成5-～7-元飽和碳環(huán)狀環(huán)； 條件是R2和R4中至少一個(gè)不是氫， 或其可藥用鹽、前藥或溶劑合物。
在一種式(I)和(II)化合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，R1為氯、甲基、CN或CF3。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，R2為氫、甲基、乙基、氯、溴、二甲基氨基、氰基或甲氧基。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，R2不是氫。
在式(I)和(II)化合物的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，R4為甲基、氯、氟、甲氧基、異丙氧基、二甲基氨基、-SCH3、-NHC(＝O)CH(CH3)2、-NHC(＝O)-CH3、吡咯烷基或3，3-二甲基-吡咯烷基。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4為甲基、氯或甲氧基。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2和R4與其連接的碳一起形成5-元或6-元飽和碳環(huán)狀環(huán)。
在進(jìn)一步優(yōu)選的式(I)和(II)化合物的實(shí)施方案中，當(dāng)R5為鹵素時(shí)R4為氫。在優(yōu)選實(shí)施方案中，R5為氟。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R5為氫。
在式(I)和(II)的一種實(shí)施方案中，當(dāng)R1為氰基時(shí)，R2為氫且R4優(yōu)選為氯或甲基。在另一種實(shí)施方案中，R5為氟、R4為氫且R2為甲基、氯或溴。
式(I)和(II)中R3基團(tuán)的優(yōu)選實(shí)例包括，但不限于

正如本文所用，術(shù)語″C1-3烷基″包括直鏈和支鏈的包含1-3個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，即，甲基、乙基、正丙基和異丙基。
″鹵素″在本文定義為氟、氯、溴和碘。
″氰基″定義為-CN。
″三氟甲基″定義為表示-CF3。
縮寫″Me″為甲基，即-CH3。
活化細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的DNA損傷劑在本文統(tǒng)稱為“檢測點(diǎn)活化劑”?；罨环Q為″Chk1″(發(fā)音為″check-one″)的檢測點(diǎn)的DNA損傷劑在本文稱為“Chk1活化劑”。同樣，這些檢測點(diǎn)的抑制劑在本文分別稱為“檢測點(diǎn)抑制劑”和″Chk1抑制劑″。
正如本文所用，Chk1抑制劑是能夠至少部分地解除Chk1蛋白的細(xì)胞周期檢測點(diǎn)活性的任何化合物。當(dāng)充分克服了細(xì)胞的檢測點(diǎn)機(jī)制，使得細(xì)胞從其停止的細(xì)胞周期階段進(jìn)入細(xì)胞周期的下一階段，或使得細(xì)胞直接進(jìn)入細(xì)胞死亡時(shí)，則實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的解除。細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的解除使得細(xì)胞將損傷或缺陷帶入后續(xù)細(xì)胞周期階段，由此誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞死亡。包括細(xì)胞凋亡和有絲分裂災(zāi)難在內(nèi)的任何機(jī)制都可引起細(xì)胞死亡。本發(fā)明化合物是Chk1抑制劑。
Chk1活化劑包括任何已知或之后發(fā)現(xiàn)的活性劑，其能夠活化Chk1激酶活性，并由此誘導(dǎo)至少部分細(xì)胞周期停滯。Chk1活化劑包括能夠使細(xì)胞周期停滯在細(xì)胞周期任何階段的活性劑，該階段在這里可稱為活化劑的“靶階段”。靶階段包括有絲分裂之外的任何細(xì)胞周期，即G1、S和G2期?？捎糜诒景l(fā)明的Chk1活化劑包括DNA損傷劑，例如化療劑和/或放射物。放射性Chk1活化劑包括但不限于電離輻射。電離輻射包括能夠產(chǎn)生相互作用的離子對的電磁或粒子輻射。電離輻射包括x和γ射線，α和β粒子，中子和帶電核子。輻射包括紫外線、可見光、紅外光輻射、微波輻射及其組合。諸如實(shí)施例8所述的試驗(yàn)可用于確定活性劑是否是Chk1活化劑。
″抑制異常細(xì)胞增殖″指延緩或消除該異常增殖細(xì)胞的增殖的速率。該抑制作用導(dǎo)致復(fù)制速率的降低或細(xì)胞死亡率的增加，或二者皆有。細(xì)胞死亡可由包括細(xì)胞凋亡或有絲分裂災(zāi)難在內(nèi)的任何機(jī)制引起。
″防止異常細(xì)胞增殖″指在異常細(xì)胞增殖發(fā)生之前對其抑制或抑制其復(fù)發(fā)。
″在體內(nèi)″指在活體內(nèi)。在本文中，活性劑可治療性地用于患者體內(nèi)，以延緩或消除異常復(fù)制細(xì)胞的增殖。該活性劑也可用作預(yù)防藥物以防止異常細(xì)胞增殖的發(fā)生或復(fù)發(fā)或者與其有關(guān)的癥狀出現(xiàn)。
″離體″指活體外。離體細(xì)胞群的實(shí)例包括細(xì)胞培養(yǎng)和諸如取自人體或動(dòng)物的液體或組織樣品的生物樣品。該樣品可通過本領(lǐng)域公知的方法獲得。示例性的生物液體樣品包括血液、腦脊髓液、尿、唾液。示例性的組織樣本包括腫瘤和其活組織切片。在本文中，本化合物可用于治療和實(shí)驗(yàn)等大量應(yīng)用中。
本文所用的術(shù)語″輻射增敏劑″指對人或其它動(dòng)物以治療有效量施用以增加細(xì)胞對電磁輻射的敏感度和/或改進(jìn)可用電磁輻射治療的疾病的治療的化合物。
本文所用的術(shù)語″輻射″包括但不限于，波長在10-20-100m的輻射。
術(shù)語″容器″指適合貯存、運(yùn)輸、分配和/或搬運(yùn)藥物制品的貯器和密閉物。
術(shù)語″包裝說明書″指伴隨產(chǎn)品的信息，其中就如何施用本產(chǎn)品以及醫(yī)師、藥劑師和患者針對該產(chǎn)品作出決定需要的安全性和有效性數(shù)據(jù)作出說明。包裝說明書通常被認(rèn)作藥物產(chǎn)品的“標(biāo)簽”。
本發(fā)明包括結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物的所有可能的立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體。本發(fā)明不僅包括外消旋化合物，還包括選光活性異構(gòu)體。當(dāng)結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物需要作為單一對映體時(shí)，其可由終產(chǎn)物的拆分獲得，或從異構(gòu)上的純起始原料或使用手性助劑通過立體專一性合成獲得，例如參見Z.Ma等人，TetrahedronAsymmetry，8(6)，883-888(1997)。終產(chǎn)物、中間體或者起始材料的拆分可通過本領(lǐng)域任何已知的方法完成。另外，在結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物可能存在互變異構(gòu)體時(shí)，本發(fā)明旨在包括該化合物所有的互變異構(gòu)形式。如此后闡述的，特定的立體異構(gòu)體在與化療或放療治療結(jié)合時(shí)可顯示出不尋常的抑制Chk1的能力。
結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物的前藥也可用作本發(fā)明方法中的化合物。已充分證實(shí)前藥方法已成功地用于臨時(shí)(例如生物可逆地)改變化合物的物理化學(xué)特性，其中化合物衍生為適于配制和/或施用的形式，繼而在體內(nèi)作為藥物釋放(參見H.Bundgaard，Ed.，″Design of Prodrugs，″Elsevier，Amsterdam，(1985)；R.B.Silverman，″The Organic Chemistry of DrugDesign and Drug Action，″Academic Press，San Diego，chapter 8，(1992)；K.M.Hillgren等人，Med.Res.Rev.，15，83(1995))。
本發(fā)明化合物可包含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)。如果需要或必要的話，官能團(tuán)可以被修飾以提供前藥。合適的前藥包括例如酸衍生物，例如酰胺和酯。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會(huì)認(rèn)識(shí)到N-氧化物也可用作前藥。
本發(fā)明化合物可以以鹽的形式存在。在本發(fā)明方法中，優(yōu)選本發(fā)明化合物的可藥用鹽。本文所用的術(shù)語″可藥用鹽″指結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物的鹽或兩性離子形式。式(I)或(II)化合物的鹽可以在化合物最終分離和純化中制備或者單獨(dú)地通過化合物與具有合適陽離子的化合物反應(yīng)制備。合適的藥物可接受陽離子包括堿金屬(例如鈉或鉀)和堿土金屬(例如鈣或鎂)陽離子。另外，包含堿性中心的結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物的可藥用鹽是與藥物可接受酸形成的酸加成鹽?？捎糜谛纬煽伤幱名}的酸的實(shí)例包括無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，有機(jī)酸如草酸、馬來酸、琥珀酸、丙二酸和檸檬酸。本發(fā)明化合物的鹽的非限定實(shí)例包括，但不限于，鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、2-羥基乙磺酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、二葡糖酸鹽(digluconate)、磷酸甘油酯、半硫酸鹽(hemisulfate)，庚酸鹽、己酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、丙二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、均三甲苯磺酸鹽、萘磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽、癸酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽、苯磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽。另外，存在于本發(fā)明化合物中的可利用氨基可以用下述物質(zhì)季銨化甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物，和二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯，癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物，以及芐基和苯乙基溴化物。根據(jù)前述，本文出現(xiàn)的關(guān)于本發(fā)明化合物的任何含義都旨在包括結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物及其可藥用鹽、溶劑合物或前藥。
本發(fā)明化合物的非限定實(shí)例為












1-[5-甲基-2-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-372.4)
1-[5-氯-2-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-392.4)
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基]-脲(LRMS(ES，正)m/e-396.4)
1-[5-氯-2-R-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-391.3)
1-[5-溴-2-R-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-438.0)
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-R-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-脲(LRMS(ES，正)m/e-383.0)
1-[5-氯-2-(4-甲基-[1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷(oxazepan)-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-406.0)
1-[5-氯-2-S-(5-氧代-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-392.2)
N-[2-氯-4-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-5-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-乙酰胺(LRMS(ES，正)m/e-435.0)
1-[5-氯-3-氟-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-396.3)
1-[5-甲氧基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-374.3)
1-[5-甲氧基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-358.3)
1-[4-氯-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-378.3)
1-[5-氯-4-氟-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-396.1)
1-[5-氰基-4-甲基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-383.3)
1-[5-氯-4-二甲基氨基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-421.2)
N-[2-氯-4-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-5-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-異丁酰胺 (LRMS(ES，正)m/e-463.2)
1-(5-甲基-吡嗪-2-基)-3-[6-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-茚滿-5-基]-脲(LRMS(ES，正)m/e-384.3)
1-[5-氯-2-(4-氰基甲基-硫代嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-433.0)
1-{5-氯-2-[4-(2-氰基-乙基)-S-嗎啉-2-基甲氧基]-苯基}-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-431.0)
1-[5-氯-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-4-吡咯烷-1-基-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-447.2)


或其鹽、溶劑合物(例如水合物)或其前藥。
本發(fā)明化合物可在治療上作為純化學(xué)品施用，但是所述化合物優(yōu)選以藥物組合物或制劑形式施用。因此，本發(fā)明提供包含式(I)或(II)化合物及其藥物可接受的稀釋劑或載體的藥物組合物。還提供一種制備藥物組合物的方法，其中包括將式(I)或(II)與其藥物可接受稀釋劑或載體混合。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供藥物制劑，其包含結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物及其可藥用鹽、前藥或溶劑合物，連同一種或多種藥物可接受的載體，以及任選的其它治療性和/或預(yù)防性成分。載體為“可接受的”意味著與制劑的其它成分相容并對其接受者無害。
本發(fā)明化合物顯示出出人意料的高效能。效能一般以達(dá)到特定效果需要的化合物濃度表示。效能越高，履行期望功能需要的化合物越少。體外效能一般用術(shù)語IC50值表示并且利用劑量-響應(yīng)試驗(yàn)測量。IC50值可通過使靈敏的檢測系統(tǒng)與一定濃度范圍的所關(guān)心化合物接觸，該濃度范圍包括沒有觀察到或僅觀察到最低限度作用時(shí)的濃度，觀察到部分作用時(shí)的較高濃度至觀察到最大作用時(shí)的飽和濃度。理論上，這種對抑制劑化合物的劑量效應(yīng)作用的檢測可以用將抑制度表示為濃度的函數(shù)的S曲線來描述。理論上，該曲線也經(jīng)過使檢測點(diǎn)酶活性足以降低至該檢測點(diǎn)中酶活性最小值和最大值差值的50％的水平的點(diǎn)。該濃度定義為50％抑制的抑制濃度或IC50值。
IC50值可利用傳統(tǒng)生物化學(xué)(非細(xì)胞)檢測技術(shù)或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的基于細(xì)胞的檢測技術(shù)確定。這種檢測的實(shí)例在下述實(shí)施例1中給出。
優(yōu)選地，IC50值通過進(jìn)行至少兩次相關(guān)檢測獲得，其中IC50值以獲得的各值的平均值(算術(shù)平均或″平均″)表示。更優(yōu)選地，所述檢測重復(fù)3-10(或更多)次，IC50值以所獲得值的平均值表示。最優(yōu)選地，所述檢測進(jìn)行多次，足以利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的統(tǒng)計(jì)方法產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上可靠的平均IC50值。
本發(fā)明化合物顯示出出人意料的低IC50值，相當(dāng)于出人意料高的體內(nèi)效能。當(dāng)依照下述實(shí)施例進(jìn)行檢測時(shí)，本發(fā)明化合物顯示出的IC50值低于約200nM，在某些實(shí)施方案中低于約150nM，在其它實(shí)施方案中低于約100nM，，在有些實(shí)施方案中低于約50nM，在有些實(shí)施方案中低于約10nM，在有些實(shí)施方案中低于約5nM。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物顯示出的IC50值為約0.1nM-約5nM。
本發(fā)明化合物在其它蛋白激酶上顯示出抑制Chk1的選擇性。選擇性在降低副作用和/或提高治療指數(shù)方面是有利的。
″選擇性″在這里定義為“倍選擇性”。通常，正如本文所用，倍選擇性為測試化合物對對比酶的IC50除以對比劑酶的IC50。具體地，本文使用的Chk1抑制劑的倍選擇性為Chk1抑制劑(測試化合物)對Chk1(比較酶)的IC50除以對比劑酶的IC50。可作為對比測量本發(fā)明化合物的對比劑酶包括至少下列蛋白激酶Cdc2、Chk2、CTAK、EphA1、EphA2、Erk1、FGFR1、FGFR4、IR、JNK1、c-Kit、p38alpha、p38beta、p38delta、Ros、Rse、Rsk2、TrkA、TrkB、蛋白激酶A、蛋白激酶C、pp60v-src、蛋白激酶B/Akt-1、p38MapK、p70S6K、鈣/鈣調(diào)素依賴性激酶II和ab1酪氨酸激酶。
確定測試化合物對對比劑酶IC50值的檢測在實(shí)施例2中描述，而且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。本發(fā)明化合物對上述測試蛋白激酶顯示出至少20倍的選擇性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明Chk1抑制劑相對于上述測試蛋白激酶對Chk1的抑制顯示出至少約50倍選擇性，在其它實(shí)施方案中至少約75倍選擇性，在其它實(shí)施方案中至少約100倍選擇性。
本發(fā)明化合物在基于細(xì)胞的檢測中顯示出出人意料的高效能。為了測量Chk1抑制劑基于細(xì)胞的效能開發(fā)了一種檢測，該檢測能夠測量在涉及異常增殖細(xì)胞的基于細(xì)胞的模型中提高DNA損傷劑抑制生長作用需要的Chk1抑制劑濃度。這種基于細(xì)胞的效能的測量在此用″ECTFS″值表示，其中″ECTFS″為Chk1抑制劑產(chǎn)生相對DNA損傷劑的抑制生長效果兩倍的異常增殖細(xì)胞群敏感性的有效濃度。ECTFS按降DNA損傷劑抑制90％細(xì)胞生長需要的量減少一半的Chk1抑制劑濃度計(jì)算。本申請人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物顯示出人意料低的ECTFS值，相當(dāng)于出人意料高的基于細(xì)胞的效能。
另一個(gè)可以測量的參數(shù)是在LD50(化合物單獨(dú)抑制50％細(xì)胞生長的量)下達(dá)到的倍數(shù)敏感性。這兩個(gè)值，ECTFS和LD50下的倍數(shù)敏感性，使得可對Chk1抑制劑彼此之間的效能和毒性進(jìn)行直接排序。
一種適合測量ECTFS值的檢測方法在下式實(shí)施例3中描述。簡單說來，該檢測使用HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞異常增殖細(xì)胞群，吉西他濱作為DNA損傷劑/Chk1活化劑，本發(fā)明化合物作為Chk1抑制劑。培養(yǎng)所述異常增殖細(xì)胞群并且允許其在合適的介質(zhì)中生長。然后，用一定濃度范圍的DNA損傷劑處理所述細(xì)胞。在預(yù)定時(shí)間后，除去DNA損傷劑，并且在一定時(shí)間內(nèi)用一定濃度的Chk1抑制劑處理所述細(xì)胞。然后收獲培養(yǎng)細(xì)胞板并且計(jì)算存活細(xì)胞的相對量。相對Chk1抑制劑單獨(dú)作為參照使所獲數(shù)據(jù)歸一，然后以DNA損傷劑濃度相對相對細(xì)胞存活率(100％等于1.0)作對數(shù)/對數(shù)圖。倍數(shù)敏感性由使用與不使用Chk1抑制劑達(dá)到90％生長抑制需要的DNA損傷劑量的差別推導(dǎo)而出，其中涉及所用的每個(gè)Chk1抑制劑濃度。然后將這些數(shù)據(jù)描繪于Chk1抑制劑濃度與倍數(shù)敏感性的圖中，由其計(jì)算ECTFS。
ECTFS值優(yōu)選通過進(jìn)行至少兩次檢測獲得，ECTFS值表達(dá)為所獲得各值的平均值。更優(yōu)選地，重復(fù)檢測3-10(或更多)次，ECTFS值以所獲值的平均值表示。最優(yōu)選地，所述檢測進(jìn)行多次，足以利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的統(tǒng)計(jì)方法產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上可靠的平均ECTFS值。
進(jìn)行ECTFS檢測的所有化合物顯示出低于約1000nMECTFS值。與之相比，先前已知的類似結(jié)構(gòu)化合物顯示出約11,000nM的ECTFS值。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物顯示的ECTFS值小于約500nM，其它實(shí)施方案中小于約300nM，其它實(shí)施方案中小于約200nM，其它實(shí)施方案中小于約150nM，其它實(shí)施方案中小于約100nM，其它實(shí)施方案中小于約50nM，其它實(shí)施方案中小于約30nM，其它實(shí)施方案中小于約20nM或小于約10nM，或在其它實(shí)施方案中小于約5nM。
適于用在本發(fā)明中的化合物和藥物組合物包括其中活性成分以有效量施用以獲得其預(yù)期目的的那些。更具體地，“治療有效量”指足以治療患有適應(yīng)癥的個(gè)體的量或減輕該適應(yīng)癥的現(xiàn)有癥狀的量。確定治療有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)，尤其是根據(jù)本文所提供的詳細(xì)的公開。
除了Chk1抑制劑，本發(fā)明藥物組合物還可配制為包括生物活性劑如細(xì)胞因子、淋巴激活素、生長因子、其它造血因子或其混合物，以便降低藥物組合物單獨(dú)施用時(shí)可能產(chǎn)生的或與其有關(guān)的不良副作用?；蛘撸@樣的生物活性劑可包含在本發(fā)明藥物組合物內(nèi)以促進(jìn)所需的治療效果。適用于本發(fā)明藥物組合物的輔助生物活性劑包括但不限于M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNF、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血栓形成素、干細(xì)胞因子、促紅細(xì)胞生成素、促血管生成素(包括Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、和/或人促血管生成素樣多肽)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、骨形成蛋白-1(BMP-1)、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、BMP受體IA、BMP受體IB、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體細(xì)胞誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子1、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子2、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子2、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮素1、表皮生長因子、源于上皮細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞吸引物、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)4、FGF 5、FGF 6、FGF 7、FGF 8、FGF 8b、FGF 8c、FGF 9、FGF 10、酸性FGF、堿性FGF、源于膠質(zhì)細(xì)胞系的中性粒細(xì)胞因子受體1、源于膠質(zhì)細(xì)胞系的中性粒細(xì)胞因子受體2、生長相關(guān)的蛋白質(zhì)、生長相關(guān)的蛋白質(zhì)、生長相關(guān)的蛋白質(zhì)、生長相關(guān)的蛋白質(zhì)、肝素結(jié)合的表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子因子受體、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子受體、神經(jīng)生長因子-3、神經(jīng)生長因子-4、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血小板衍生的生長因子、血小板衍生的生長因子A鏈、血小板衍生的生長因子AA、血小板衍生的生長因子AB、血小板衍生的生長因子B鏈、血小板衍生的生長因子BB、血小板衍生的生長因子受體、血小板衍生的生長因子受體、pre-B細(xì)胞生長刺激因子、干細(xì)胞因子、干細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、TGF、TGF 1、TGF 1.2、TGF 2、TGF 3、TGF5、潛態(tài)TGF 1、TGF、結(jié)合蛋白I、TGF結(jié)合蛋白II、TGF結(jié)合蛋白III、I型腫瘤壞死因子受體、II型腫瘤壞死因子受體、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子受體、血管內(nèi)皮生長因子、以及其嵌合蛋白和生物學(xué)或免疫學(xué)活性片段。
結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物也可以與促進(jìn)化合物在治療應(yīng)用方法中的有益性能(或減輕不期望性能)的輔助部分共軛或連接。這種共軛能夠增強(qiáng)化合物向特定解剖位點(diǎn)或目標(biāo)區(qū)域(例如腫瘤)輸送，能夠使化合物在靶細(xì)胞內(nèi)維持治療濃度，改變化合物的藥動(dòng)學(xué)和藥效特性，和/或改進(jìn)化合物的治療指數(shù)或安全性。適合的輔助部分包括，例如氨基酸、寡肽或多肽，例如，抗體如單克隆抗體和其它工程化抗體；以及靶細(xì)胞或組織中受體的天然或合成配體。其它合適的輔助物包括改進(jìn)生物分布和/或靶細(xì)胞對化合物的攝取的脂肪酸或脂質(zhì)部分(參見，例如Bradley等人，Clin.Cancer Res.73229，2001)。
本發(fā)明制劑可以用治療指定疾病的標(biāo)準(zhǔn)方式施用，例如通過口服、胃腸外、經(jīng)粘膜(例如舌下或經(jīng)口腔)、局部、經(jīng)皮、直腸、吸入(例如經(jīng)鼻或深肺吸入)施用。胃腸外施用包括，但不限于靜脈、動(dòng)脈、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉、鞘內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)施用。胃腸外施用也可以使用高壓技術(shù)如POWDERJECTTM(Powderject Pharmaceuticals，Plc，Oxford，England)完成。
對于口服施用和口腔施用，組合物可以為以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。例如，片劑和膠囊可包含常規(guī)賦形劑，例如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯樹膠、明膠、山梨醇、黃芪膠、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(例如、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣或山梨醇)、潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙二醇或二氧化硅)、崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)或濕潤劑(例如，月桂基硫酸鈉)。片劑可依照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行包衣。
或者，本發(fā)明化合物可被結(jié)合至諸如水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的口服液體制劑中。而且，含有這些化合物的制劑可以干燥產(chǎn)品存在，在使用之前以水或其它適合的載體重新配制。此類液體制劑可包含常規(guī)添加劑，例如，懸浮劑如山梨醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化的可食用脂肪；乳化劑如卵磷脂、單油酸山梨糖醇酐酯或阿拉伯樹膠；非水載體(其可包括食用油)，如杏仁油、分餾椰子油、油性酯、丙二醇和乙二醇；以及防腐劑，如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸。
該制劑也可配制為栓劑，例如，含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)，如椰子油或其它甘油酯。通常用于吸入的組合物可以溶液、懸浮液或乳劑的形式提供，其可作為干燥粉末施用或使用諸如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷的常規(guī)拋射劑以氣溶膠形式施用。
局部和透皮制劑包含常規(guī)的水性或非水載體，例如滴眼液、霜?jiǎng)④浉?、洗劑和糊劑，或者為含藥的膏劑、貼劑或膜的形式。
此外，本發(fā)明組合物可配制為適于通過注射或連續(xù)輸注施用。用于注射的制劑可為油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳劑形式，并可含有組方劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，活性成分可以為粉末形式，在使用前以合適的載體(例如，無菌無熱源的水)重新配制。
本發(fā)明組合物還可配制為儲(chǔ)庫制劑。該長效作用制劑可經(jīng)植入(例如皮下或肌肉)或通過肌肉注射施用。因此，本發(fā)明化合物可與合適的聚合材料(例如水溶性聚合物)或疏水材料(例如可接受的油中的乳液)、離子交換樹脂或微溶的衍生物(例如微溶鹽)一起配制。
對于獸醫(yī)應(yīng)用來說，式(I)或(II)化合物或其可藥用鹽、前藥或溶劑合物可依據(jù)常規(guī)獸醫(yī)實(shí)踐作為合適的可接受制劑施用。獸醫(yī)能容易地確定最適合特定動(dòng)物的劑量方案和施用途徑。可用本發(fā)明化合物和方法治療的動(dòng)物包括但不限于寵物、家畜、展示動(dòng)物和動(dòng)物園中的動(dòng)物。
合成方法 本發(fā)明化合物可依照下述合成方案制備。首先，用于制備本文所述Chk1抑制劑的烷氧基芳基胺可通過不同的普通合成方案制備。例如，普通方案1概述了硝基苯酚與就地形成或制備并單獨(dú)分離的活化醇反應(yīng)，以提供硝基苯基醚產(chǎn)物。在標(biāo)準(zhǔn)條件下還原醚生成用于生產(chǎn)本發(fā)明化合物的芳基胺。
普通方案1
或者，鹵代硝基苯與醇在強(qiáng)堿如氫化鈉或二(三甲基硅烷基)氨基鉀存在下反應(yīng)也生成硝基芳基醚，正如普通方案2所述。這些醚然后按照普通方案1所述還原。
普通方案2
芳基胺轉(zhuǎn)化為脲可通過多種合成方案之一實(shí)現(xiàn)。例如，正如普通方案3所示，芳基胺可以與氨基甲酸吡嗪酯反應(yīng)生成脲。
普通方案3
或者，依照普通方案4所概述，熱誘導(dǎo)的?；B氮分解產(chǎn)生了活潑的芳基異氰酸酯，后者然后可與芳基胺反應(yīng)生成所需的脲。
普通方案4
正如普通方案5所述，另一種方法利用光氣或光氣等效物與兩個(gè)芳基胺偶聯(lián)以生成脲。
普通方案5
本文所述合成方案中使用的縮寫為小時(shí)(h)，分鐘(min)，磅/英寸2(psi)，飽和(sat′d)，水(H2O)，去離子(DI)，異丙醇(iPrOH)，碳載鉑(Pt/C)，氮(N2)，氫(H2)，碳載鈀(Pd/C)，氧化鉑(Pt2O)，硫酸鎂(MgSO4)，鹽酸(HCl)，偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)，二氯甲烷(CH2Cl2)，氯仿(CHCl3)，甲醇(MeOH)，氫氧化銨(NH4OH)，四氫呋喃(THF)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，乙酸(AcOH)，NaOH(NaOH)，EtOAc(EtOAc)，乙醇(EtOH)，二甲基亞砜(DMSO)，氘化二甲基亞砜(d6-DMSO)，碳酸鈉(Na2CO3)，氘化氯仿(CDCl3)，碳酸氫鈉(NaHCO3)，氫化鈉(NaH)，TEA(TEA)，碳酸銫(CSsCO3)，二氧化碳(CO2)，氫氧化鈀(Pd(OH)2)，硫酸(H2SO4)，硝酸(HNO3)，氯化鈉(NaCl)，硫酸鈉(Na2SO4)和二甲基甲酰胺(DMF)。
化合物的制備 下述本發(fā)明化合物利用上述普通方案制備。本發(fā)明的其它化合物可以通過審慎選擇起始材料利用上述普通方案和下述特定合成方法制備。
化合物1
1-[5-氯-2-S-([1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步驟12-氨基-5-甲基吡嗪。
將氨基-丙二腈對甲苯磺酸鹽(20.0g，79mmol)和丙酮醛1-肟(6.88g，79mmol)在燒瓶中合并。加入iPrOH(140mL)，并且在室溫下攪拌所獲得的黃色漿體18小時(shí)，在此期間積聚黃色沉淀物。過濾該混合物，沉淀物用iPrOH(2×50mL)和DI H2O(20mL)洗滌，然后凍干以生成2-氨基-3-氰基-5-甲基吡嗪N-氧化物(10.7g)。
將該吡嗪N-氧化物懸浮于MeOH(22mL)和AcOH(5mL)中。向其中小心地加入5％Pt/C(1.6g)和Darco KB-B(8g)。使該混合物在60psi下吸收H218小時(shí)。該反應(yīng)用25％NaOH(34mL)淬滅并且用N2吹掃30分鐘。
混合物通過濕的硅藻土床過濾并且用MeOH(4×100mL)洗滌。濾液在真空下濃縮至1/4體積。用EtOAc(150mL)稀釋濾液并且用5％NaOH(30mL)洗滌，然后用EtOAc(2×70mL)反萃取。合并有機(jī)層并且用飽和NaCl(20mL)洗滌，過濾，并且在真空下濃縮以生成橙色粘性固體(5.16g)。步驟2(5-甲基吡嗪-2-基)氨基甲酸苯酯。將2-氨基-5-甲基吡嗪(5.16g，47mmol)溶于CH2Cl2(52mL)，在N2下攪拌并且冷卻到0℃。向其中加入吡啶(4.8mL，59mmol)，接著在15分鐘內(nèi)滴加氯甲酸苯酯(6.2mL，59mmol)，引起沉淀形成。將該混合物在0℃下攪拌1小時(shí)。然后，用0.25M HCl(40mL)和無水醚(50mL)使該反應(yīng)淬滅，然后在0℃下攪拌30分鐘。通過過濾分離沉淀物，用DI H2O(20mL)和醚(2×25mL)洗滌，并且在真空下干燥以生成白色松散粉末產(chǎn)物(7.4g)。
步驟3(S)-2-羥基甲基-[1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-4-甲酸叔丁酯。向250mL的圓底燒瓶中加入(S)-(+)-芐基縮水甘油醚(1.31g，7.9mmol)、3-芐基氨基-丙-1-醇(1.3g，7.9mmol)和10mL EtOH。加熱該混合物至40℃達(dá)15h。冷卻該反應(yīng)并且在真空下濃縮，獲得的油狀產(chǎn)物不經(jīng)純化直接使用。將二醇放入250mL圓底燒瓶并且溶于75mL無水吡啶。將該溶液冷卻到0℃并且一次加入甲苯磺酰氯(5.27g，27.7mmol)。攪拌該混合物6小時(shí)，小心地將反應(yīng)溫度保持在0℃。該冷反應(yīng)用50mL飽和NaHCO3水溶液淬滅。另外加入20mL水并且用EtOAc萃取三次，每次用100mL。合并的有機(jī)相在Na2SO4上干燥并且在真空下濃縮。然后以25-50％梯度變化的EtOAc和己烷為洗脫劑通過柱色譜對醇進(jìn)行純化。這樣產(chǎn)生了1.39g黃色油狀的甲苯磺酰醇。
將該醇溶于50mL DMF并且冷卻到0℃。在攪拌的同時(shí)小心地向冷卻的混合物中加入95重量％的NaH(0.29g，11.5mmol)。該反應(yīng)在0℃下攪拌15分鐘，然后使其緩慢地升高到室溫并且攪拌6小時(shí)。小心地用50mL水使該反應(yīng)淬滅并且用EtOAc萃取三次，每次用量50mL。合并的有機(jī)相在Na2SO4上干燥并且在真空下濃縮。粗產(chǎn)物吸收于EtOH并且放入Parr氫化設(shè)備中。另外向溶液中加入10重量％Pd/C(0.426g，0.30mmol)和2MHCl(2.1mL)。氫化在50psi下進(jìn)行2天，此時(shí)通過LCMS分析判斷反應(yīng)進(jìn)行。該溶液用飽和的NaHCO3水溶液中和并且用3∶1的CHCl3∶iPrOH混合物萃取。合并的有機(jī)相在真空下濃縮，粗產(chǎn)物用于下一步驟。
將粗氨基醇溶于100mL無水CH2Cl2。將TEA(1.59mL，11.5mmol)和雙碳酸二叔丁酯(5.74g，5.74mmol)加入到該溶液中。該溶液在室溫下攪拌18小時(shí)，然后用飽和NaHCO3水溶液淬滅并且用CH2Cl2萃取三次，每次用量50mL。合并的有機(jī)相用Na2SO4干燥并且在真空下濃縮。該產(chǎn)物通過以25-50％梯度變化的EtOAc/己烷為洗脫劑的柱色譜純化。這樣得到0.240g黃色油狀的氧雜氮雜環(huán)庚醇。
步驟4(S)-2-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-[1，4]氧雜氮雜環(huán)庚-4-甲酸叔丁酯。將氧雜氮雜環(huán)庚醇(0.240g，1.03mmol)、TEA(0.21mL，1.545mmol)和10mL無水CH2Cl2加入50mL的圓底燒瓶中。將該溶液冷卻到0℃并且滴入甲磺酰氯(0.10mL)。在0℃下攪拌該混合物1.5小時(shí)并且用水淬滅，冷卻。分離各層，用20mL CH2Cl2萃取水層一次。合并的有機(jī)相用Na2SO4干燥并且在真空下濃縮。然后將粗甲磺酸酯溶于5mL無水DMF。向該溶液中加入Cs2CO3(0.671g，2.06mmol)和4-氯-2-硝基-苯酚(0.215g，1.24mmol)。然后加熱該嫩黃色溶液至100℃過夜。將該反應(yīng)冷卻到室溫，用50mL水淬滅，并且用EtOAc萃取三次，每次用量50mL。該產(chǎn)物通過使用10-35％梯度變化的EtOAc/己烷的閃蒸色譜純化。該步驟獲得0.120g嫩黃色油狀的硝基苯基氧雜氮雜環(huán)庚烷。
步驟51-[5-氯-2-([1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-(S)-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。在25mL圓底燒瓶中放入硝基苯基氧雜氮雜環(huán)庚烷(0.120g，0.31mmol)和溶于5mL MeOH的Pt2O(0.007g，0.03mmol)。與氦氣球連接，利用吸氣器抽空該燒瓶，并且用H2回填三次，然后在H2下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)物通過硅藻土過濾，用MeOH洗滌硅藻土墊2次，每次用量20mL。該溶液在真空下濃縮。將粗苯胺溶于5mL無水DMF。向該溶液中加入TEA(0.005mL，0.34mmol)和(5-甲基吡嗪-2-基)氨基甲酸苯酯(0.07g，0.31mmol)。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。在真空下除去溶劑，將殘留物再溶于10mL EtOAc并且用飽和NaHCO3水溶液洗滌。有機(jī)物用Na2SO4干燥并且在減壓下濃縮。該灰/棕色殘留物用3mL CH2Cl2覆蓋并且向其中加入1mL濃的三氟乙酸。通過加酸將所有的固體溶解。反應(yīng)在室溫下攪拌4小時(shí)，并且在該時(shí)間下加入飽和NaHCO3水溶液直到溶液達(dá)到pH 8。該混合物用3∶1的CHCl3∶iPrOH混合物萃取三次，每次用量10mL。合并的有機(jī)物在Na2SO4上干燥并且在真空下濃縮。然后在EtOAc中將灰白色固體研磨成粉并且通過中等多孔過濾器過濾，用50mL EtOAc洗滌。在真空下徹底干燥該白色固體。該步驟獲得0.020g白色細(xì)粉狀的所需的脲。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.83(br s，1H)，8.39(dd，1H)，8.18(s，1H)8.04(br s，1H)，6.99(dd，1H)，6.82(d，1H)，4.25-3.98(m，2H)，3.90-3.76(m，1H)，3.38(d，1H)，3.13-3.06(m，2H)，3.00(dd，1H)，2.54(s，3H)，2.06-1.89(m，3H)。LCMS(ES，正)m/e 392.3(M+1)。
化合物2
1-[5-氯-2-(R-嗎啉-3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲步驟13-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯。在氮?dú)夥障?，?5分鐘內(nèi)向冷卻的(0℃浴)嗎啉-3-R-4-二甲酸4-叔丁酯(1.00g，4.32mmol)于無水THF(40mL)的溶液中滴加硼烷(4.76mL于THF的1M溶液，4.76mmol)。攪拌1小時(shí)后，撤掉冰浴并且在環(huán)境溫度下連續(xù)攪拌3小時(shí)。然后加入乙酸(14.3mL 1M水溶液，14.3mmol)。攪拌1小時(shí)后，通過加入過量的碳酸氫鈉飽和水溶液中和該溶液。加入二氯甲烷(20mL)并且攪拌15分鐘，然后分離各層。水層用CH2Cl2(3×20mL)萃取，將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并且過濾。將濾后的溶液濃縮至白色固體(0.46g)。
步驟23-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-R-嗎啉-4-甲酸叔丁酯。在氮?dú)夥障掠?5分鐘內(nèi)向冷卻(-78℃浴)且攪拌的3-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯(0.13g，0.60mmol)和5-氯-2-氟硝基苯(0.11g，0.66mmol)于無水THF(40mL)的溶液中滴加二(三甲基甲硅烷基)氨化鉀(2.4mL于THF的0.5M溶液，1.2mmol)。在另外攪拌15分鐘后，加入飽和氯化銨水溶液(10mL)并且撤除冷卻浴，使溶液升溫到環(huán)境溫度。攪拌1小時(shí)后，加入水(15mL)和CH2Cl2(10mL)并且攪拌5分鐘，分離各層。水層用CH2Cl2(2×10mL)萃取，將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并過濾。過濾后的溶液濃縮為黃色油狀物(0.26g)，后者通過以己烷/EtOAc(1∶1)為洗脫劑的柱色譜純化，得到淡黃色油狀物(0.195g)。
步驟33-(2-氨基-4-氯-苯氧基甲基)-R-嗎啉-4-甲酸叔丁酯。在攪拌下將Pt2O(0.020g，0.088mmol)加入到3-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-R-嗎啉-4-甲酸叔丁酯(0.17g，0.46mmol)于MeOH(4mL)的溶液中。抽空該燒瓶，然后用H2填充該燒瓶，重復(fù)三次。攪拌4小時(shí)后，通過硅藻土墊過濾該溶液，然后濃縮濾液以生成黃色油狀產(chǎn)物。
步驟43-{4-氯-2-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-苯氧基甲基}-R-嗎啉-4-甲酸叔丁酯。制備所述黃色油和(5-甲基-吡嗪-2-基)-氨基甲酸苯酯(0.13g，0.57mmol)于無水DMF(2mL)的溶液并且加入TEA(0.074mL，0.53mmol)。在攪拌24小時(shí)后，在減壓下濃縮該反應(yīng)，然后再溶于水(10mL)和EtOAc(10mL)。攪拌15分鐘后，分離各層，水層用EtOAc(2×10mL)萃取，合并的有機(jī)層用鹽水(10mL)洗滌，然后干燥(Na2SO4)并過濾。濃縮過濾后的溶液，然后通過以EtOAc/CH2Cl2(1∶1)為洗脫劑的柱色譜純化以產(chǎn)生黃色油狀物(0.8g)。
步驟51-[5-氯-2-(R-嗎啉-3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。向受到攪拌的3-{4-氯-2-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-苯氧基甲基}-R-嗎啉-4-甲酸叔丁酯(0.8g)于CH2Cl2(6mL)的溶液中加入三氟乙酸(3mL)。攪拌5小時(shí)后，用碳酸鉀水溶液(1M)處理該溶液直至堿性，然后攪拌30分鐘。進(jìn)行層分離，水層用CH2Cl2(3×10mL)萃取。將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)并且過濾。濃縮過濾后的溶液，然后通過以MeOH/CH2Cl2(1∶9)為洗脫劑的柱色譜純化以產(chǎn)生淺黃色固體(0.0523g)。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.22(s，1H)，9.96(br s，1H)，8.74(s，1H)，8.28(d，1H)，8.18(s，1H)，7.04(dd，2H)，3.94(m，3H)，3.71(br d，1H)，3.43(m，1H)，3.23(m，2H)，3.34(br m，2H)，2.66(br m，1H)，2.43(s，3H).LRMS(es，正)m/e 378.3(M+1)。
化合物3
1-[2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步驟11，4-二甲基-2-(4-甲基-2-硝基-苯氧基甲基)-哌嗪。將4-甲基-2-硝基-苯酚(0.95g，6.20mmol)、(1，4-二甲基-哌嗪-2-基)-MeOH(0.98g，6.82mmol)和三苯基膦(1.79g，6.82mmol)在THF中合并，攪拌5分鐘，然后用DIAD(1.38g，6.82mmol)處理。攪拌該反應(yīng)過夜。在真空下濃縮產(chǎn)生橙色油狀物，后者溶于EtOAc并且用2M的HCl水溶液萃取。合并水性洗液，用EtOAc洗滌，并且用固體NaOH處理直到呈堿性。所獲得的水性混合物用EtOAc萃取，合并的有機(jī)萃取物用Na2SO4干燥，過濾并且在真空下濃縮以形成棕色油。閃蒸色譜處理(1％MeOH的CH2Cl2溶液)生成1.0g所需的芳基醚。
步驟22-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基胺。將1，4-二甲基-2-(4-甲基-2-硝基-苯氧基甲基)-哌嗪(1.02g，3.65mmol)溶于MeOH(75mL)并且用飽和氯化銨水溶液處理直到混合物變混濁。加入鋅(0.24g，3.65mmol)。將所獲得的熱反應(yīng)混合物另外攪拌30分鐘，此時(shí)LCMS顯示已經(jīng)開始消耗起始材料。用EtOAc和Na2CO3水溶液稀釋反應(yīng)并且分離各層。有機(jī)層用飽和NaCl溶液洗滌并且用無水Na2SO4干燥。過濾混合物并且在真空下濃縮以提供所需的苯胺。
步驟31-[2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。將5-甲基-吡嗪-2-甲酸(691mg，5mmol)在甲苯(15mL)中攪拌并且先后用TEA(765mL，5.5mmol)和疊氮磷酸二苯酯(1.0mL，5.0mmol)處理。將所獲得的溶液攪拌30分鐘，然后直接使用。
5-甲基-吡嗪-2-羰基疊氮化物(1.0mmol)于甲苯的溶液在90℃下加熱10分鐘。將反應(yīng)燒瓶從加熱浴中移出，所獲得的棕色溶液用2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯胺(0.25g，1.0mmol)處理。將燒瓶再放回加熱浴中并且在40℃下加熱4小時(shí)。使該混合物冷卻，然后過濾以提供茶褐色粉末狀的產(chǎn)物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ10.90(s，1，H)，8.4(s，1，H)，8.2(m，3，H)，6.8(m，2，H)，4.2(dd，1，H)，3.9(t，1，H)，3.1(d，1，H)，2.8(br d，1，H)，2.6(m，2，H)，2.5(s，3，H)，2.4(m，1，H)，2.4(s，3，H)，2.3(s，3，H)，2.25(m，1，H)，2.2(s，3，H)，2.1(m，1，H)。LRMS(esi，正)m/e 385.30(M+1)。
化合物4
1-[4，5-二氯-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步驟1(S)-2-羥基甲基-嗎啉-4-甲酸叔丁酯。在500mL燒瓶中合并(S)-芐基縮水甘油醚(15g，91.4mmol)、MeOH(10mL)和50重量％NaOH(30mL，365mmol)。分次向該混合物中加入2-氨基乙基硫酸酯(25.8g，183mmol)。將該非均勻混合物加熱到40℃，此時(shí)該溶液變均勻。在40℃下保持4小時(shí)。略微冷卻反應(yīng)并將附加的固體NaOH(14.6g，365mmol)與50mL甲苯一起加入。然后加熱該雙相溶液至65℃達(dá)12h。將反應(yīng)冷卻到室溫，分離各層，水層用75mL甲苯萃取一次。合并的有機(jī)層用1M HCl洗滌三次，每次用量75mL。用NaOH水溶液將合并水層的pH調(diào)整為pH 12并且用EtOAc萃取四次，每次用量70mL。合并的有機(jī)相用Na2SO4干燥并且在真空下濃縮以產(chǎn)生10.084g不透明油狀的所需嗎啉。
將粗嗎啉產(chǎn)物溶于CH2Cl2(100mL)并且加入TEA(12.1mL，87.5mmol)和加入雙碳酸二叔丁酯(15.9g，73mmol)，同時(shí)伴隨產(chǎn)生CO2氣體。將反應(yīng)在室溫下攪拌18小時(shí)，然后用35mL飽和NaHCO3水溶液淬滅。加入另外50mL水并且分離各層。有機(jī)層用無水Na2SO4干燥，在真空下濃縮并且通過閃蒸色譜(20％EtOAc/己烷)純化以產(chǎn)生所需的淺黃色油狀的N-Boc-O-芐基嗎啉(5.536g)。
將純化過的雙保護(hù)嗎啉溶于50L無水EtOH并且加入Pd(OH)2(1.26g，20％wt，1.8mmol)。與氫氣球連接，并且通過抽氣器使燒瓶排空，并且用H2回填三次。在H2下攪拌反應(yīng)30小時(shí)?；旌衔锿ㄟ^硅藻土過濾，并且用EtOH徹底洗滌硅藻土墊。過濾后的溶液在真空下濃縮以產(chǎn)生所需的灰白色固體的N-boc-嗎啉醇(3.918g)。
步驟24，5-二氯-2-硝基-苯酚。在A 250mL圓底燒瓶中裝入溶于50mL CH2Cl2的3，4-二氯苯酚(3.053g，18.7mmol)并且在冰浴中冷卻到0℃。在攪拌下溶液中加入濃H2SO4(1.56mL，28.1mmol)。溶液變混濁。向該混合物中滴入濃HNO3(1.2mL，18.7mmol)并且小心地使溫度保持在5℃之下。將反應(yīng)在0℃下攪拌30分鐘，然后用冰浴冷卻，并且用150mL H2O淬滅。分離各層，水層用35mL CH2Cl2萃取一次。合并的有機(jī)相用無水Na2SO4干燥，在真空下濃縮并且利用閃蒸色譜純化(10％EtOAc/己烷作為洗脫劑)以產(chǎn)生所需的嫩黃色固體硝基苯酚(1.793g)。
步驟31-[4，5-二氯-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。依照制備化合物1的步驟4和5，利用4，5-二氯-2-硝基-苯酚和(S)-2-芐氧基甲基-嗎啉-4-甲酸叔丁酯制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.42(s，1H)，10.29(s，1H)，8.93(s，1H)，8.42(s，1H)，8.21(s，1H)，7.32(s，1H)，4.18-3.41(m，5H)，3.03-2.66(m，4H)，2.38(s，3H)LRMS(ES，正)m/e412.2(M+1)。
化合物5
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-脲 步驟15-溴-吡嗪-2-基胺。將吡嗪-2-基胺(6.66g，70mmol)于CH2Cl2(200mL)的溶液冷卻到0℃，用N-溴琥珀酰胺(12.5g，70mmol)處理并且使其升溫到室溫。將獲得的反應(yīng)混合物攪拌過夜，然后用另外的CH2Cl2(200mL)稀釋并且用10％Na2CO3水溶液洗滌。分離各層，有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，然后用無水MgSO4干燥，過濾并在減壓下濃縮。殘留物吸收于EtOAc(50mL)，通過加入己烷(300mL)沉淀產(chǎn)物。沉淀物在減壓下干燥以生成5.57g茶褐色固體。
步驟25-氨基-吡嗪-2-腈。將5-溴-吡嗪-2-基胺與碘化亞銅(I)(1.3g，6.9mmol)、氰化鉀(0.44g，6.8mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(0.95g，0.83mmol)和18-冠-6(0.058g，0.22mmol)合并于DMF(15mL)中。將獲得的混合物攪拌40分鐘，然后在回流(155℃)下加熱2小時(shí)。將反應(yīng)冷卻到室溫，然后靜置過夜。通過過濾分離沉淀物并且在真空下濃縮濾液至干。橙色殘留物吸收于EtOAc和己烷中，并且形成初始沉淀物，然后通過過濾分離。通過過濾收集靜置過程中在母液中形成的其它沉淀物。合并固體以生成0.10g的鮮橙色固體。
步驟32-{2-[3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲基]-4-甲基-苯氧基甲基}-嗎啉-4-甲酸叔丁酯。2-(2-氨基-4-甲基-苯氧基甲基)-嗎啉-4-甲酸叔丁酯(0.087g，0.270mmol)由2-氨基-4-甲基-苯酚依照化合物3制備方法的步驟1和2，利用2-羥基甲基-嗎啉-4-甲酸叔丁酯(依照化合物2制備方法的步驟1利用相應(yīng)的酸制備)和4-甲基-2-硝基-苯酚制備。與三光氣(0.029g，0.10mmol)、甲苯(2mL)和Hunig′s堿(0.15mL，0.86mmol)合并，并且在室溫下攪拌25分鐘。然后通過套管將該懸浮液轉(zhuǎn)移到含有5-氨基-吡嗪-2-腈(0.032g，0.27mmol)和雙(三甲基硅烷基)氨基鋰于THF(1mL)的冷卻(-78℃)溶液中，所述冷卻的溶液已經(jīng)在-78℃攪拌30分鐘。將反應(yīng)升溫，然后在室溫下攪拌16小時(shí)。形成的沉淀物通過過濾收集以產(chǎn)生所需的產(chǎn)物(0.043g)。
步驟41-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-脲。2-{2-[3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲基]-4-甲基-苯氧基甲基}-嗎啉-4-甲酸叔丁酯(0.043g，0.0918mmol)于THF(2mL)的漿體用溶于二烷(4M，0.11mL)的HCl處理并且攪拌20小時(shí)。另外加入溶于二烷(4M，0.25mL)的HCl并且加熱該反應(yīng)至50℃達(dá)18h。冷卻該反應(yīng)并濃縮。將獲得的固體懸浮于醚，過濾懸浮液并且空氣干燥以得到作為HCl鹽的所需產(chǎn)物(0.042g)。
步驟51-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-脲。將1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-脲鹽酸鹽(0.0104g，0.129mmol)于MeOH(1mL)的溶液冷卻到0℃并且先后用甲醛水溶液(0.12mmol)和三乙酰氧基硼氫化鈉(0.06g，0.292mmol)處理。攪拌反應(yīng)12小時(shí)，然后在真空下濃縮。殘留物進(jìn)行硅膠色譜(溶于CH2Cl2的2％MeOH)處理以得到白色固體產(chǎn)物(0.014g)。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.90(s，1，H)，10(br s，1，H)，8.9(s，1，H)，8.8(s，1，H)，8(s，1，H)，6.9(m，1，H)，6.8(m，1，H)，3.9(m，4，H)，3.6(t，1，H)，2.9(d，1，H)，2.7(d，1，H)，2.2(s，3，H)，2.1(s，3，H)，2(t，1，H)，1.8(t，1，H)。LRMS(esi，正)m/e 383.40(M+1)。
化合物6
1-[5-氯-2-([1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步驟13-芐基-2-氯甲基-[1，3]氧雜氮雜環(huán)庚烷。將3-芐基氨基-丙-1-醇(14g，88.0mmol)和表氯醇(81.4g，880mmol)溶液加熱到40℃。在攪拌3小時(shí)后冷卻反應(yīng)，并且通過真空下的蒸發(fā)除去過量表氯醇。緩慢地加入硫酸(10mL)，然后將反應(yīng)燒瓶放入在150℃下預(yù)熱的油浴中。連續(xù)攪拌1小時(shí)，然后使反應(yīng)區(qū)冷卻到室溫并且通過加冰淬滅。用10％Na2CO3水溶液將混合物調(diào)整到堿性pH并且用EtOAc(3×300mL)萃取。合并的有機(jī)層用無水MgSO4干燥，過濾并且在減壓下干燥。獲得的殘留物通過閃蒸色譜(70∶28∶2己烷/CH2Cl2/2M NH4OH aq)純化以得到5g淺黃色的油狀物。
步驟22-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-[1，3]氧雜氮雜環(huán)庚烷-3-甲酸叔丁酯。在攪拌下向4-溴-2-硝基-苯酚(1.39g，8.0mmol)于DMSO(30mL)的溶液中先后加入碳酸鉀(2.76g，20.0mmol)和3-芐基-2-氯甲基-[1，3]氧雜氮雜環(huán)庚烷。將反應(yīng)在60℃下攪拌12小時(shí)，然后冷卻到室溫并且用EtOAc(200mL)和10％Na2CO3水溶液(200mL)稀釋。分離各層，有機(jī)層用鹽水洗滌，用無水MgSO4干燥并且在真空下濃縮。粗產(chǎn)物通過閃蒸色譜(70∶30己烷/EtOAc)純化以提供480mg淡橙色油狀物。
所述油狀物吸收于CH2Cl2(5mL)并且在冰浴中冷卻。加入氯甲酸α氯乙酯(0.18mL，1.65mmol)。攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后加入2N HCl水溶液。連續(xù)攪拌10分鐘，然后濃縮混合物至干。所獲得的殘留物吸收于MeOH并且回流2小時(shí)。在減壓下濃縮反應(yīng)，用2N HCl(75mL)水溶液吸收殘留物并且用EtOAc(2×50mL)洗滌。通過加入固體NaOH將水層的pH調(diào)整為pH11。獲得的堿性溶液用EtOAc(2×50mL)萃取，合并的有機(jī)層用鹽水洗滌并且用MgSO4干燥。過濾并在真空下濃縮以提供240mg淡黃色油狀產(chǎn)物。
所述油狀物溶于CH2Cl2(3mL)，然后用TEA(0.116mL，0.831mmol)和雙碳酸二叔丁酯(0.181g，0.831mmol)處理。將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用附加的CH2Cl2(100mL)稀釋并且用10％Na2CO3水溶液(100mL)洗滌。有機(jī)層用MgSO4干燥，過濾并在減壓下濃縮。利用閃蒸色譜(7∶3己烷/EtOAc)純化以提供252mg白色泡沫狀產(chǎn)物。
步驟32-(2-氨基-4-氯-苯氧基甲基)-[1，3]氧雜氮環(huán)庚烷-3-甲酸叔丁酯。依照化合物3制備方法的步驟2由2-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-[1，3]-氧雜氮雜環(huán)庚烷-3-甲酸叔丁酯(0.252g，0.65mmol)制備，生成150mg透明油狀的產(chǎn)物。
步驟41-[5-氯-2-([1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。根據(jù)化合物2制備方法的步驟4和化合物5制備方法的步驟4由2-(2-氨基-4-溴-苯氧基甲基)-[1，3]氧雜氮雜環(huán)庚烷-3-甲酸叔丁酯制備，生成0.175g產(chǎn)物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.65(br s，1，H)，8.3(s，1，H)，8.25(s，1，H)，6.98(dd，1，H)，6.8(d，1，H)，4.08(m，3，H)，3.8(m，1，H)，3.35(s，1，H)，3.25(d，1，H)，3(m，3，H)，2.5(s，3，H)，1.98(m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e 391.90(M+1)。
化合物7
1-[5-甲基-2-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步驟13-羥基甲基-4-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯。哌嗪-2-甲酸(20g，154mmol)于200mL 1∶1 H2O/二烷中的漿體在冰浴中冷卻并且用固體NaOH(11g)處理，通過滴液漏斗加入溶于二烷的雙碳酸二叔丁酯(21.6g，99mmole)溶液。在此反應(yīng)期間根據(jù)需要將反應(yīng)的pH調(diào)整為pH＞10。將所獲得的混合物攪拌3小時(shí)，然后用水稀釋直到均勻并且用濃HCl酸化直到pH在2和3之間。用醚洗滌該溶液并且用NaOH調(diào)節(jié)pH直到pH為6.5-7。使該溶液靜置數(shù)天，并且通過過濾收集形成的沉淀以提供白色固體狀的哌嗪-1，3-二甲酸1-叔丁酯(9.7g)。
哌嗪-1，3-二甲酸1-叔丁酯(4.62g，20.0mmol)于CH3OH(100mL)的漿體用甲醛水溶液(40mmol)和甲酸(70mmol)處理，然后在65℃下加熱數(shù)小時(shí)。在通過HPLC確認(rèn)完成后，冷卻反應(yīng)并且在真空下濃縮。
用THF吸收殘留物并且在冰浴中冷卻，然后用氫化鋁鋰于THF(19.0mmol)的溶液處理。1小時(shí)后，使反應(yīng)升溫到室溫并且再攪拌30分鐘。然后在冰浴中冷卻反應(yīng)并且先用H2O(0.75mL)和15％NaOH水溶液(0.75mL)，然后用H2O(3×0.75mL)淬滅。通過過濾除去鹽并且在真空下濃縮濾液以提供粗產(chǎn)物。通過硅膠色譜(2.5％MeOH的CH2Cl2溶液)產(chǎn)生黃色油狀產(chǎn)物(0.70g)。
步驟21-[5-甲基-2-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。依照化合物3制備方法和化合物5制備方法步驟4利用3-羥基甲基-4-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.24(br s，1，H)，10.1(s，1，H)，9.7(br s，1，H)，9.42(s，1，H)，9.12(s，1，H)，8.2(s，1，H)，8.08(s，1，H)，6.91(d，1，H)，6.82(d，1，H)，4.6(d，1，H)，4.4(m，1，H)，4.1(m，1，H)，3.6(m，6，H)，3(s，3，H)，2.4(s，3，H)，2.2(s，3，H)。LRMS(csi，正)m/e 371.40(M+1)。
化合物8
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-脲 依照化合物5制備方法的步驟1-4，使用4-甲基-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，CD3OD)，δ8.80(s，1，H)，8.7(s，1，H)，7.9(s，1，H)，6.8(m，2，H)，4.2(m，4，H)，3.8(m，1，H)，3.6(m，1，H)，3.5(m，1，H)，3.2(m，2，H)，2.3(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 369.30(M+1)。
化合物9
1-[5-氯-4-甲基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1制備方法的步驟4和5利用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯制備，依照化合物4制備方法的步驟1使用4-氯-5-甲基-2-硝基-苯酚制備，依照化合物4制備方法的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.32(s，1H)，10.21(s，1H)，8.75(s，1H)，8.29-8.10(m，2H)，7.06(d，1H)，7.18(d，1H)，4.12-3.42(m，5H)，3.29-2.63(m，4H)，2.48(s，3H)，2.25(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.2(M+1)。
化合物10
1-[5-氯-4-甲基-2-(R-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1制備方法的步驟4和5使用2-羥基甲基-R-嗎啉-4-甲酸制備，由(R)-芐基縮水甘油醚酸叔丁酯和由4-氯-5-甲基-2-硝基-苯酚使用化合物4步驟1制備，依照化合物4步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.32(s，1H)，10.21(s，1H)，8.75(s，1H)，8.29-8.10(m，2H)，7.06(d，1H)，7.18(d，1H)，4.12-3.42(m，5H)，3.29-2.63(m，4H)，2.48(s，3H)，2.25(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.3(M+1)。
化合物11
1-[4，5-二氯-2-(R-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟4和5使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4，5-二氯-2-硝基-苯酚制備，依照化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.42(s，1H)，10.29(s，1H)，8.93(s，1H)，8.42(s，1H)，8.21(s，1H)，7.32(s，1H)，4.18-3.41(m，5H)，3.03-2.66(m，4H)，2.38(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 412.2(M+1)。
化合物12
1-[4，5-二甲基-2-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟4和5使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4，5-二甲基-2-硝基-苯酚制備，依照化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.02(s，1H)，9.89(br s，1H)，8.85(br s，1H)，8.27(s，1H)，8.91(s，1H)，6.84(s，1H)，4.18-3.97(m，3H)，3.69(t，1H)，3.43-3.26(m，2H)，2.97(t，2H)，2.33(s，3H)，2.18(s，2H)，2.12(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e372.3(M+1)。
化合物13
1-[4-氯-5-甲基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟4和5使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和5-氯-4-甲基-2-硝基-苯酚制備，依照化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.26(s，1H)，8.82(s，1H)，8.19(s，1H)，8.17(s，1H)，7.10(s，1H)，4.21-3.96(m，2H)，3.90-3.86(m，2H)，3.54(dt，1H)，2.98(d，1H)，2.84(t，2H)，2.36(s，3H)，2.21(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.1(M+1)。
化合物14
1-[5-氰基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟4和5使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4-羥基-3-硝基-芐腈制備，依照化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.43(br s，1H)，10.30(s，1H)，8.62(br s，1H)，8.53(s，1H)，8.21(s，1H)，7.48(d，1H)，7.33(d，1H)，4.20-4.11(m，2H)，3.94-3.73(m，2H)，3.51(dt，1H)，3.00(d，1H)，2.77-2.61(m，2H)。LRMS(ES，正)m/e 369.2(M+1)。
化合物15
1-[5-氯-4-乙基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟4和5使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-5-乙基-2-硝基-苯酚制備，依照化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.33(s，1H)，10.19(s，1H)，8.66(s，1H)，8.33-8.01(m，3H)，7.05(d，1H)，4.29-3.39(m，5H)，3.29-2.91(m，2H)，2.89-2.70(m，2H)，2.58(q，2H)，2.49(s，3H)，1.17(t，3H)。LRMS(ES，正)m/e 406.1(M+1)。
化合物16
1-[5-氯-4-甲氧基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟4和5使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-5-甲氧基-2-硝基-苯酚制備，依照化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.11(s，1H)，10.05(br s，1H)，8.64(s，1H)，8.19(s，2H)，6.91(s，1H)，4.29(s，2H)，4.16(m，1H)，4.09(d，1H)，3.87(s，3H)，3.75(t，1H)，3.44-3.17(m，2H)，3.01(t，2H)，2.39(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 408.0(M+1)。
化合物17
1-[5-二甲基氨基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟4和5使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4-二甲基氨基-2-硝基-苯酚制備，依照化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.11(s，1H)，10.05(br s，1H)，8.69(s，1H)，8.19(s，1H)，7.75(s，1H)，6.90(d，1H)，6.34(dd，1H)，4.05-3.81(m，4H)，3.56(t，1H)，3.14(d，1H)，2.93(d，1H)，2.80(s，6H)，2.76-2.63(m，2H)，2.41(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 387.4(M+1)。
化合物18
1-[5-溴-4-甲基-2-S-(嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-5-甲基-2-硝基-苯酚制備，利用化合物4的步驟2制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.31(br s，1H)，10.19(s，1H)，8.63(s，1H)，8.41(s，1H)，8.20(s，1H)，7.07(s，1H)，4.13-3.94(m，3H)，3.87-3.74(m，2H)，δ3.52(td，1H)，3.00(d，1H)，2.69(t，2H)，2.42(s，1H)，2.25(s，1H)。LRMS(ES，正)m/e 438.2.0(M+1)。
化合物19
1-[5-甲基-2-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物3的方法使用由相應(yīng)的酸依照化合物2的步驟1制備的2-羥基甲基-嗎啉-4-甲酸叔丁酯制備。1H-NMR(400MHz，CD3OD)，8.90(s，1，H)，8.6(s，1，H)，7.9(s，1，H)，6.9(m，2，H)，4.2(m，4，H)，3.8(t，1，H)，3.7(s，2，H)，3.5(d，1，H)，3.2(m，1，H)，2.6(s，3，H)，2.3(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 358.20(M+1)。
化合物20
1-[5-氯-2-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物3的方法使用由相應(yīng)的酸依照化合物2的步驟1制備的4-氯-2-硝基-苯酚和2-羥基甲基-嗎啉-4-甲酸叔丁酯制備。1H-NMR(400MHz，CD3OD)，δ8.70(s，1，H)，8.5(s，1，H)，8.4(s，1，H)，7.05(m，1，H)，4.2(m，4，H)，3.8(t，1，H)，3.5(d，1，H)，3.2(m，2，H)，2.6(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 378.50(M+1)。
化合物21
1-[5-氯-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-氯-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.35(s，1，H)，9.4(br s，1，H)，8.55(br s，1，H)，8.25(m，2，H)，7.22(m，2，H)，4.2(m，3，H)，4(d，1，H)，3.8(t，1，H)，3.4(d，1，H)，3.2(d，1，H)，2.8(m，1，H)，2.45(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 378.30(M+1)。
化合物22
1-[5-甲基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用(R)-芐基縮水甘油醚和4-甲基-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.20(s，1，H)，10.1(br s，1，H)，9.89(br s，1，H)，9.5(br s，1，H)，8.7(s，1，H)，8.3(s，1，H)，7.98(s，1，H)，6.9(m，1，H)，6.8(m，1，H)，4(m，3，H)，3.42(m，2，H)，3.19(m，2，H)，3(m，2，H)，2.43(s，3，H)，2.25(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 358.30(M+1)。
化合物23
1-[5-氯-2-(R-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用(R)-芐基縮水甘油醚和4-氯-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.45(s，1，H)，9.6(br s，1，H)，9.3(brs，1，H)，8.7(br s，1，H)，8.3(s，1，H)，7.19(m，2，)，4.2(m，2，H)，4(d，1，H)，3.84(t，1，H)，3.41(d，1，H)，3.21(d，1，H)，3.02(m，2，H)，2.5(s，3，H)。
LRMS(esi，正)m/e 378.30(M+1)。
化合物24
1-[5-氯-2-R-([1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的方法使用(R)-2-羥基甲基-[1，4]氧雜氮雜-4-甲酸叔丁酯制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.83(br s，1H)，8.39(dd，1H)，8.18(s，1H)，8.04(br s，1H)，6.99(dd，1H)，6.82(d，1H)，4.25-3.98(m，2H)，3.90-3.76(m，1H)，3.38(d，1H)，3.13-3.06(m，2H)，3.00(dd，1H)，2.54(s，3H)，2.06-1.89(m，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.3(M+1)。
化合物25
1-[5-氯-2-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物7的方法使用4-氯-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.35(br s，1，H)，10.2(s，1，H)，9.84(br s，1，H)，9.6(s，1，H)，8.31(s，1，H)，8.21(s，1，H)，7.08(m，2，H)，4.58(d，1，H)，4.42(d，1，H)，3.7(m，6，H)，3(s，3，H)，2.44(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 391.40(M+1)。
化合物26
1-[5-氯-2-S-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物7的方法使用S-哌嗪-2-甲酸和4-氯-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.80(s，1，H)，8.28(d，2，H)，6.99(s，2，H)，4.17(m，3，H)，3.1(d，1，H)，2.92(d，2，H)，2.84(t，1，H)，2.5(s，3，H)，2.45(m，2，H)，2.42(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 391.30(M+1)。
化合物27
1-[5-氯-4-甲基-2-S-([1，4]-氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的方法使用依照化合物4的步驟2制備的4-氯-5-甲基-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.2(s，1H)，8.62(s，1H)，8.27(s，1H)，8.24(s，1H)，7.32(m，1H)，7.18(s，1H)，4.09-3.91(m，3H)，3.90-3.79(m，1H)，3.77-3.62(m，1H)，3.14(d，1H)，2.85(m，1H)，2.73(s，2H)，2.39(s，3H)，2.27(s，1H)，1.82-1.67(m，2H)。LRMS(ES，正)m/e 406.2(M+1)。
化合物28
1-[5-溴-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ10.30(s，1，H)，8.63(br s，1，H)，8.43(s，1，H)，8.22(s，1，H)，7.15(m，1，H)，7.05(d，1，H)，4.08(m，3，H)，3.82(m，2，H)，3.47(t，1，H)，3.17(s，2，H)，3(d，1，H)，3.07(s，3，H)，2.68(m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e423.90(M+1)。
化合物29
1-[5-溴-2-R-(R-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用(R)-芐基縮水甘油醚和4-溴-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ10.30(br s，1，H)，8.65(br s，1，H)，8.43(s，1，H)，8.25(s，1，H)，7.18(dd，1，H)，7.03(d，1，H)，4.03(m，2，H)，3.82(m，2，H)，3.52(t，2，H)，3.19(d，1，H)，3(d，1，H)，2.76(m，2，H)，2.43(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 443.90(M+1)。
化合物30
1-[5-溴-2-S-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-2-硝基-苯酚和化合物2的步驟4以及化合物5的步驟4和5制備。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ11.43(br s，1，H)，9.02(s，1，H)，8.6(s，1，H)，8.33(s，1，H)，8.2(s，1，H)，7.12(d，1，H)，6.76(d，1，H)，4(m，3，H)，3.8(t，1，H)，3.02(d，1，H)，2.73(d，1，H)，2.51(s，3，H)，2.3(t，1，H)，2.22(s，3，H)，2.08(t，1，H)。
化合物31
1-[5-溴-2-([1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物6的方法使用依照化合物4步驟2制備的4-溴-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.72(br s，1，H)，8.48(s，1，H)，8.45(s，1，H)，7.11(d，1，H)，6.75(d，1，H)，4.02(m，3，H)，3.8(m，1，H)，3.21(d，1，H)，2.97(m，2，H)，2.51(s，3，H)，1.92(br m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e436.00(M+1)。
化合物32
1-[5-溴-2-(4-甲基-[1，4]氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-2-硝基-苯酚和化合物5的步驟5制備。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.25(s，1，H)，8.23(s，1，H)，7.1(d，1，H)，6.72(d，1，H)，4.19(m，1，H)，4(m，1，H)，3.95(m，2，H)，3.42(br s，1，H)，3.02(d，1，H)，2.84(m，1，H)，2.62(t，1，H)，2.5(s，3，H)，2.4(s，3，H)，2(m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e 451.90(M+1)。
化合物33
1-[5-氯-2-S-(4-氰基甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 將1-[5-氯-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(0.189g，0.5mmol)懸浮于DMF(2mL)。加入碳酸鉀(0.104g，0.75mmol)和溴乙腈(0.035mL，0.5mmol)并且加熱該混合物至80℃達(dá)8h。使反應(yīng)混合物冷卻到室溫并且通過加入H2O(10mL)淬滅。通過過濾收集形成的固體并且從MeOH重結(jié)晶以提供白色粉末狀的產(chǎn)物(0.072g)。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.46(br s，1H)，10.26(br s，1H)，8.63(br s，1H)，8.31(d，1H)，8.17(s，1H)，7.10(d，1H)，7.03(dd，1H)，4.14(dd，1H)，4.09(dd，1H)，3.96-4.01(m，1H)，3.91-3.95(m，1H)。3.81(d，1H)，3.72(d，1H)，3.64(td，1H)，2.95(br d，1H)，2.72(br d，1H)，2.43(s，3H)，2.32(td，1H)，2.18(t，1H)。LRMS(esi，正)m/e 417(M+1)。
化合物34
1-[5-氯-2-(硫代嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物2的步驟2(使用依照化合物2的步驟1由硫代嗎啉-2，4-二甲酸4-叔丁酯獲得的2-羥基甲基-硫代嗎啉-4-甲酸叔丁酯)、化合物3的步驟2以及化合物2的步驟4和5制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.48(br s，1H)，10.27(br s，1H)，8.62(br s，1H)，8.31(d，1H)，8.21(s，1H)，7.12(d，1H)，7.03(dd，1H)，4.36(t，1H)，4.12(dd，1H)，3.24(dd，1H)，3.10-3.17(m，1H)，2.99(dd，1H)，2.94-2.98(m，1H)，2.89(ddd，1H)，2.71(ddd，1H)，2.46-2.48(m，1H)，2.44(s，3H)。LRMS(esi，正)m/e 394(M+1)。
化合物35
1-(5-甲基-吡嗪-2-基)-3-[3-S-(嗎啉2-基甲氧基)-5，6，7，8-四氫-萘-2-基]-脲 依照化合物3的步驟1(使用依照化合物2的步驟1由S-嗎啉-2，4-二甲酸4-叔丁酯制備的(S)-2-羥基甲基-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和依照化合物4的步驟2制備的3-硝基-5，6，7，8-四氫-萘-2-醇)和化合物1的步驟5制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.09(br，1，H)，10.05(s，1，H)，8.60(br s，1，H)，8.17(s，1，H)，7.86(s，1，H)，6.68(s，1，H)，3.97(m，1，H)，3.89(m，1，H)，3.78(m，2，H)，3.31(t，1，H)，2.98(d，1，H)，2.63(m，6，H)，2.44(m，1，H)，2.41(s，3，H)，1.68(m，4，H)。
化合物36
1-[5-氯-2-S-(嗎啉3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物2的方法使用嗎啉-3-S-4-二甲酸4-叔丁酯制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.22(s，1，H)，9.96(br，1，H)，8.74(s，1，H)，8.29(d，1，H)，8.18(s，1，H)，7.04(m，2，H)，3.94(m，3，H)3.70(br d，1，H)，3.42(m，1，H)，3.23(m，2，H)，2.83(br s，2，H)，2.43(s，3，H)。
化合物37
1-[5-甲基-2-R-(嗎啉3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物2的方法使用4-甲基-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.08(br s，1，H)，9.76(br，1，H)，8.17(s，1，H)，8.03(d，1，H)，6.90(d，1，H)，6.80(d，1，H)，3.88(m，3，H)，3.70(br d，2，H)，3.41(m，1，H)，3.20(m，2，H)，2.82(m，2，H)，2.43(s，3，H)，2.24(s，3，H)。
化合物38
1-[5-氯-2-S-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟2-5使用依照Miesel美國專利No.4,293,552的方法制備的5-三氟甲基-吡嗪-2-基胺和(S)-2-羥基甲基-嗎啉-4-甲酸叔丁酯制備。1H-NMR(d6-DMSO)δ10.85(bs，1H)，9.97(bs，1H)，9.11(bs，1H)，8.98(bs，1H)，8.73(bs，1H)，8.22(bs，1H)，7.08(bs，1H)，4.19-3.73(m，6H)，3.32-2.98(m，4H)。LRMS(esi，正)m/e 432(M+1)。
化合物39
1-[4-氯-5-甲基-2-S-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物5的步驟1-4使用依照化合物4的步驟2由3-氯-4-甲基-苯酚制備的5-氯-4-甲基-2-硝基-苯酚制備。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ10.39(br s，1H)，9.05(br s，1H)，8.74(s，1H)，8.68(s，1H)，8.18(s，1H)，6.91(s，1H)，4.04(m，4H)，3.78(m，1H)，3.19(d，1H)，2.97(m，2H)，2.78(m，1H)，2.36(s，3H)。LCMS(esi，正)m/z 403.16(M+1)。
化合物40
1-[5-氯-4-甲氧基-2-(S-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟2(使用依照化合物5的步驟1和2制備的5-氨基-吡嗪-2-腈)和化合物1的步驟4和5(使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和依照化合物4的步驟2制備的4-氯-5-甲氧基-2-硝基-苯酚)制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.82(s，1H)，9.93(s，1H)，8.95(s，1H)，8.81(s，1H)，8.14(s，1H)，6.93(s，1H)，4.25(s，2H)，4.13-3.98(m，2H)，3.83(s，3H)，3.61(t，1H)，3.41-3.19(m，2H)，3.17-2.91(m，2H)。LRMS(ES，正)m/e419.1(M+1)。
化合物41
1-[5-氯-2-S-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步驟2(使用依照化合物5的步驟1和2制備的5-氨基-吡嗪-2-腈)和化合物1的步驟4和5(使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-2-硝基-苯酚)制備。1H-NMR(d6-DMSO)δ10.97(bs，1H)，10.02(bs，1H)，9.05(bs，1H)，8.95(s，1H)，8.85(s，1H)，8.2(s，1H)，7.10(m，1H)，3.96-4.24(m，4H)，3.68-3.78(m，2H)，3.3(m，2H)，3.0(m，2H)。LRMS(esi，正)m/e 388(M+1)。
化合物42
1-[5-氯-2-S-(4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 步驟11-[5-氯-2-(嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲。依照化合物1的步驟2(使用依照化合物5的步驟1和2制備的5-氨基-吡嗪-2-腈)和化合物1的步驟4和5(使用2-羥基甲基-S-嗎啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-2-硝基-苯酚)制備以提供0.27g產(chǎn)物。
步驟2將1-[5-氯-2-(嗎啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲(0.276g，0.73mmol)懸浮于DMF(5mL)并且用碳酸鉀(0.15g，1.1mmol)和甲基碘(0.046mL，0.73mmol)處理?；旌衔镏饾u均勻，并且在在室溫下攪拌4小時(shí)。通過加水(20mL)使反應(yīng)淬滅并且用3∶1 CHCl3∶iPrOH混合物萃取(3×25mL)。合并的有機(jī)層在減壓下濃縮，殘留物用EtOAc研磨。過濾后提供0.214g白色固體狀的產(chǎn)物。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ11.01(s，1H)，10.16(s，1H)，8.86(d，2H)，8.27(d，1H)，8.17(s，1H)，7.18(m，2H)，4.25-4.06(m，2H)，3.95(m，1H)，3.83(d，1H)，3.61(t，1H)，2.89(d，1H)，2.65(d，1H)，2.18(s，3H)，2.02(td，1H)，1.83(t，1H)。LRMS(ES，正)m/e 403.0(M+1)。
化合物43
1-[5-氯-2-(S-4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物42的步驟2使用1-[5-氯-2-(S-4-甲基-嗎啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲制備。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.54(br s，1H)，10.24(s，1H)，8.73(s，1H)，8.30(s，1H)，8.27(s，1H)，7.12-6.93(m，2H)，4.17-3.81(m，4H)，3.59(t，1H)，3.91(d，1H)，2.64(d，1H)，2.43(s，3H)，2.18(s，3H)，2.03(td，1H)，1.82(t，1H)。LRMS(ES，正)m/e 392.1(M+1)。
治療方法 本發(fā)明化合物可用于治療涉及異常細(xì)胞增殖的病癥，例如，本發(fā)明化合物可用于強(qiáng)化用在癌癥和其它細(xì)胞增殖適應(yīng)癥治療中的放射和/或化療劑的效果，其中這些細(xì)胞增殖適應(yīng)癥涉及真核細(xì)胞，包括人和其它動(dòng)物中的細(xì)胞。通常，本發(fā)明化合物抑制異常增殖的細(xì)胞，包括癌癥性的和非癌癥性。例如，本發(fā)明化合物可用于增強(qiáng)對通常以注入氨甲蝶呤、吉西他濱或5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代謝物進(jìn)行治療的腫瘤的治療。
本發(fā)明化合物的使用可導(dǎo)致異常增殖細(xì)胞的部分或完全消退，即這類細(xì)胞從細(xì)胞群中部分或完全消失。例如，當(dāng)異常增殖的細(xì)胞群為腫瘤細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明化合物可用于延緩腫瘤細(xì)胞生長的速率，降低腫瘤的大小或數(shù)量，和/或誘導(dǎo)部分或完全的腫瘤消退。
當(dāng)還沒有異常細(xì)胞增殖被確認(rèn)或沒有異常細(xì)胞增殖正在進(jìn)行，但懷疑或預(yù)料會(huì)有異常細(xì)胞增殖時(shí)，本發(fā)明化合物可分別在在體內(nèi)或離體使用。本發(fā)明化合物還可以在異常細(xì)胞增殖之前已被治療時(shí)使用，以預(yù)防或抑制其復(fù)發(fā)。
本發(fā)明一種方法包括給需要其的個(gè)體施用治療有效量的本發(fā)明Chk1抑制劑與化療劑的聯(lián)合?；蛘撸景l(fā)明的方法包括給需要其的個(gè)體施用治療有效量的至少一種本發(fā)明Chk1抑制劑與抗體的聯(lián)合，其中所述抗體具有抑制癌癥細(xì)胞增殖的活性，例如赫賽汀(herceptin)。
因此，癌癥對通過本發(fā)明Chk1抑制劑與化療劑或抗體的聯(lián)合施用的增強(qiáng)治療敏感。可通過本發(fā)明治療的癌癥包括以實(shí)體瘤為特征的癌和惡性肉瘤，以及骨髓或淋巴系統(tǒng)的癌癥，包括白血病、淋巴瘤，以及通常缺乏腫瘤實(shí)體但是分布在血管淋巴腺系統(tǒng)的癌癥。這些癌癥包括，例如結(jié)腸直腸癌、頭頸部癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、外陰癌、白血病、淋巴癌、黑素瘤、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、腦瘤、骨肉瘤以及肺癌。
因此，本發(fā)明化合物適用于由Chk1活性介導(dǎo)的癌癥。更具體地，Chk1活性與包括下述(但不限于)癌的形式有關(guān)成人和兒童腫瘤，實(shí)體瘤/惡性腫瘤的生長物，粘液瘤和圓形細(xì)胞癌，局部晚期腫瘤，轉(zhuǎn)移性癌，人軟組織肉瘤，包括尤文氏(Ewing′s)肉瘤，癌的轉(zhuǎn)移，包括淋巴性轉(zhuǎn)移，鱗狀細(xì)胞癌，尤其是頭頸癌、食道鱗片細(xì)胞癌，口腔癌，血細(xì)胞惡性腫瘤，包括多發(fā)性骨髓癌，白血病，包括急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性非淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病以及毛細(xì)胞白血病，滲出性淋巴瘤(基于體腔的淋巴瘤)，胸腺淋巴瘤肺癌(包括小細(xì)胞癌，皮膚T細(xì)胞淋巴癌，霍奇金氏(Hodgkin′s)淋巴癌，非霍奇金氏淋巴癌，腎上腺皮質(zhì)瘤，產(chǎn)生ACTH的腫瘤，非小細(xì)胞癌、乳癌(包括小細(xì)胞和導(dǎo)管癌)，胃腸癌(包括胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸直腸瘤形成相關(guān)的息肉)，胰腺癌，肝癌，泌尿道癌(包括膀胱癌，例如原發(fā)性表面膀胱癌、膀胱的侵入性轉(zhuǎn)移細(xì)胞癌，肌肉侵入性膀胱癌)，前列腺癌，女性生殖道惡性腫瘤(包括卵巢癌、原發(fā)性腹膜上皮贅生物、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、陰道癌、女陰癌、子宮癌以及在卵泡中的實(shí)體瘤)，男性生殖道惡性腫瘤(包括睪丸癌和陰莖癌)，腎癌(包括腎細(xì)胞癌)，腦癌(包括內(nèi)發(fā)性腦腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞)，骨癌(包括骨瘤以及骨肉瘤)，皮膚癌(包括惡性黑色素瘤、人皮膚角化細(xì)胞進(jìn)行性腫瘤以及扁平細(xì)胞瘤)，甲狀腺癌，成視網(wǎng)膜細(xì)胞癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，腹膜滲漏，惡性腫瘤性胸腔積液，間皮瘤，腎母細(xì)胞(Wilms′s)瘤，膽囊癌，滋養(yǎng)層贅生物，血管外皮瘤以及卡波西氏(Kaposi′s)肉瘤。
本發(fā)明化合物還可用于輻射敏化細(xì)胞?？捎秒姶泡椛渲委煹募膊“ǖ幌抻?，腫瘤性疾病、良性和惡性腫瘤以及癌細(xì)胞。輻射治療采用電磁輻射，例如γ輻射(10-20-10-13m)，X-射線輻射(10-12-10-9m)，紫外光(10nm-400nm)，可見光(400nm-700nm)，紅外輻射(700nm-1.0mm)和微波輻射(1mm-30cm)。
目前，某些癌癥治療方案采用電磁輻射例如X-射線輻射活化的輻射增敏劑。X-射線輻射增敏劑的實(shí)例包括但不限于下列物質(zhì)甲硝噠唑、迷索硝唑、去甲基迷索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑(nimorazole)、絲裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、煙酰胺、5-溴脫氧尿苷(BUdR)、5-碘脫氧尿苷(IUdR)、溴脫氧胞苷、氟脫氧尿苷(FUdR)、羥基脲、順鉑以及治療上有效的類似物及其衍生物。
癌的光動(dòng)力療法(PDT)使用可見光的輻射活化劑。光動(dòng)力輻射致敏劑的實(shí)例包括但不限于下列物質(zhì)血卟啉衍生物、PHOTOFRIN、苯并卟啉衍生物、NPe6、本卟啉錫(SnET2)、pheoborbide-a、細(xì)菌葉綠素-a、萘酞菁、酞菁、酞菁鋅以及治療上有效的類似物和其衍生物。
輻射增敏劑可與治療有效量的一種或多種除Chk1抑制劑之外的化合物聯(lián)合施用，這些化合物包括但不限于，促進(jìn)輻射致敏劑結(jié)合靶細(xì)胞的化合物、控制治療劑、營養(yǎng)物和/或氧流向靶細(xì)胞的化合物、與或不與另外輻射劑一起作用與腫瘤的化療劑，或其它用于治療癌癥或其它疾病的治療上有效的化合物?？膳c輻射致敏劑聯(lián)合使用的其它治療劑或方法的實(shí)例包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸、氧、卡波金、紅細(xì)胞輸血、全氟化碳(例如FLUOSOLW-DA)、2，3-DPG、BW12C、鈣離子通道阻斷劑、己酮可可堿、抑制血管生成化合物、肼苯噠嗪以及L-BSO。
可與本發(fā)明化合物聯(lián)合用于治療癌癥的化療劑包括但不限于烷化劑、抗代謝物、激素及其拮抗劑、放射性同位素、抗體以及天然產(chǎn)物及其組合。例如，本發(fā)明抑制劑化合物可與抗生素類如阿霉素和其它蒽環(huán)類似物，氮芥類如環(huán)磷酰胺，嘧啶類似物如5-氟尿嘧啶，順鉑、羥基脲、紫杉醇及其天然與合成衍生物等一起使用。作為另一實(shí)例，對于混合瘤，例如其中腫瘤包括依賴促性腺激素和不依賴促性腺激素細(xì)胞的乳腺癌，所述化合物可與亮丙瑞林或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽類似物)聯(lián)合施用。其它抗瘤方案包括使抑制劑化合物與另一治療方式一起使用，后者為例如手術(shù)或輻射，以下稱之為“輔助抗瘤方式”?？捎糜诒景l(fā)明的其它化療劑包括激素及其拮抗劑、放射性同位素、抗體、天然產(chǎn)物及其組合。可用在采用本發(fā)明化合物的方法的治療劑的實(shí)例列于下表。
尤其可用于與輻射增敏劑聯(lián)合使用的化療劑實(shí)例包括，例如喜樹堿、卡鉑、順鉑、柔紅霉素、阿霉素、干擾素(α、β、γ)、依立替康、羥基脲、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤、2-氯腺嘌呤核苷、氟達(dá)拉濱、氮胞苷、吉西他濱、培美曲塞、白介素2、依立替康、多烯紫杉醇、紫杉醇、托泊替康以及治療上有效的類似物及其衍生物。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明化合物可用于單獨(dú)與吉西他濱或者進(jìn)一步與紫杉醇一起聯(lián)合使用。本發(fā)明化合物還可以與僅與培美曲塞或加上順鉑、卡鉑或其它鉑類聯(lián)合使用。本發(fā)明Chk1抑制劑還可與吉西他濱和培美曲塞聯(lián)合施用。
與吉西他濱聯(lián)合施用的本發(fā)明Chk1抑制劑可用于治療，例如胰腺癌、子宮的平滑肌肉瘤、骨肉瘤、轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌、四肢和軀干軟組織肉瘤、腎細(xì)胞癌、腺癌以及何杰金氏病。與培美曲塞聯(lián)合施用的本發(fā)明的Chk1抑制劑可用于間皮瘤的治療。
本發(fā)明化合物還可加強(qiáng)藥物在治療以異常細(xì)胞增殖為特征的炎癥性疾病、病癥或障礙中的有效性。可以用本發(fā)明化合物治療的炎癥性疾病的實(shí)例包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、牛皮癬、白癜風(fēng)、維格內(nèi)氏肉芽腫病、全身型幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(JCA)，以及全身性紅斑狼瘡(SLE)。對關(guān)節(jié)炎、維格內(nèi)氏肉芽腫病以及全身性紅斑狼瘡的治療經(jīng)常涉及利用免疫抑制療法，例如電離輻射、氨甲喋呤以及環(huán)磷酰胺。這樣的治療通常直接地或間接地誘導(dǎo)DNA損傷。在損壞的免疫細(xì)胞內(nèi)對Chk1活性的抑制致使細(xì)胞對這些標(biāo)準(zhǔn)治療的控制更敏感。牛皮癬和白癜風(fēng)通常以紫外輻射(UV)和補(bǔ)骨脂素聯(lián)合進(jìn)行治療。本發(fā)明化合物增強(qiáng)UV和補(bǔ)骨脂素殺死作用，增強(qiáng)這種治療方案的治療指數(shù)。通常，當(dāng)與免疫抑制藥物聯(lián)合使用時(shí)，本發(fā)明化合物強(qiáng)化了對炎性疾病細(xì)胞的控制。
本發(fā)明化合物還可用于治療以異常增殖細(xì)胞為特征的其它非癌性病癥。這些病癥包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、血管炎、腎炎、視網(wǎng)膜病、腎病、增殖性皮膚障礙、牛皮癬、瘢痕疙瘩性傷痕、光化性角化病、多形糜爛性紅斑、骨質(zhì)疏松癥、包括表皮向下生長在內(nèi)的過渡增殖性眼部疾病、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病(PVR)、糖尿病性視網(wǎng)膜病、血管增殖性疾病、魚鱗病或乳頭狀瘤。
一種優(yōu)選的以本發(fā)明Chk1抑制劑施用的方法描述在Keegan等人于2004年9月17日提交的PCT申請PCT/US2004/30806中，該申請基于2003年9月7日提交的美國臨時(shí)申請No.60/503,925，本文引用其全部公開內(nèi)容作為參考。這種抑制異常細(xì)胞增殖的方法涉及按時(shí)施用Chk1活化劑(例如化療劑)和本發(fā)明Chk1抑制劑。在這種方法中，至少一種Chk1活化劑以足以誘導(dǎo)增殖細(xì)胞中基本上同步的細(xì)胞周期停滯的劑量和時(shí)長施用。當(dāng)完成基本上的階段同步時(shí)，以至少一種Chk1抑制劑施用以消除細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)治療性細(xì)胞死亡。該方法可與任何Chk1活化劑一起使用，并且在治療或預(yù)防癌癥性和非癌癥性的異常細(xì)胞增殖中得到應(yīng)用。
異常增殖細(xì)胞群可與一種或多于一種的本發(fā)明Chk1抑制劑接觸。如果使用多種Chk1抑制劑，則可以采用相同或不同方法與這些Chk1抑制劑接觸(例如同時(shí)或連續(xù)、持續(xù)相同或不同時(shí)間，或利用相同或不同劑型施用)，具體由熟練技術(shù)人員，例如主治醫(yī)師(在人類患者的情況下)或化驗(yàn)員(在體內(nèi)或離體方法的情況下)決定。
異常增殖細(xì)胞群還可以與一種或多種Chk1活化劑接觸。如果使用多種Chk1活化劑，這些Chk1活化劑可以采用相同或不同的方法與細(xì)胞接觸，一般與上面關(guān)于Chk1抑制劑所述相同。
本發(fā)明化合物還可應(yīng)用于離體細(xì)胞群。例如，本發(fā)明化合物可離體使用以獲得涉及Chk1抑制劑對給定的適應(yīng)癥、細(xì)胞類型、患者施用的時(shí)間表和/或劑量和/或其它參數(shù)的信息。這些信息能夠用于試驗(yàn)?zāi)康幕蛟谂R床上以確定體內(nèi)治療的方案。本發(fā)明適合的其它離體用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的，附加的活性或輔助劑可用于本文所述方法。本發(fā)明技術(shù)人員還認(rèn)識(shí)到，這里所涉及的治療延及預(yù)防、以及對已經(jīng)形成的疾病或癥狀的治療。
本發(fā)明化合物用于治療的量根據(jù)待治療的病癥的性質(zhì)和患者的年齡和狀況而變化，并且最終由醫(yī)師和獸醫(yī)確定。但是，對于成人治療來說，通常施用量在0.001mg/kg至約100mg/kg每天的范圍內(nèi)。所需的劑量可以單一劑量施用，或在適當(dāng)?shù)拈g隔以多劑量施用，例如每天二、三、四或更多次的亞劑量施用。實(shí)際上，醫(yī)生確定適合個(gè)體患者的給藥方案，并且該劑量隨具體患者的年齡、體重和反應(yīng)而變。上述劑量為示例性的一般情況，但是特殊情況也可存在，其中使用更高或更低劑量，并且這樣的情況都處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
細(xì)胞群與本發(fā)明Chk1抑制劑的接觸可以任何劑量進(jìn)行足夠的時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)基本上解除細(xì)胞周期檢查點(diǎn)。通常，但是非必須，這樣的時(shí)間包括高達(dá)約72小時(shí)至約96小時(shí)，具體取決于多種因素。在某些實(shí)施方案中，期望或必需在多至約幾個(gè)星期或以上的時(shí)間內(nèi)施用Chk1抑制劑，具體由主治醫(yī)師或技術(shù)人員的決定。因而，本發(fā)明的Chk1抑制劑通常可以施用多至約1小時(shí)，多至約2小時(shí)，多至約3小時(shí)，多至約4小時(shí)，多至約6小時(shí)，多至約12小時(shí)，多至約18小時(shí)，多至約24小時(shí)，多至約48小時(shí)或多至約72小時(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解此處表述的范圍僅僅是示例性的，并且在所述范圍之內(nèi)和之外的范圍和子范圍也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明Chk1抑制劑可以劑量的倍數(shù)施用。例如，Chk1抑制劑可以下述劑量施用每隔四天將四倍的劑量作為一次劑量遞送一天(q4d×4)；每隔三天將四倍的劑量作為一次劑量遞送一天(q3d×4)；每隔五天將四倍的劑量作為一次劑量遞送一天(qd×5)；每周一次的劑量，持續(xù)三周(qwk3)；五次日劑量，休息兩天，另一五次日劑量(5/2/5)；或合乎情況而決定的任何劑量方案。
實(shí)施例 實(shí)施例1 確定Chk1抑制劑IC50值 人Chk1的cDNA已被鑒定和克隆，如之前在1998年9月4日提交的第WO 99/11795號(hào)國際申請公布中所述。FLAG標(biāo)簽被同框插入全長Chk1的氨基末端。5′引物含有EcoRI位點(diǎn)、Kozak序列，并且還編碼用于利用M2抗體(Sigma，St.Louis，MO)親合純化的FLAG標(biāo)簽。3′引物包含SalI位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增鏈段作為EcoRI-SalI片斷被克隆進(jìn)pCI-Neo(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后作為EcoRI-NotI片斷亞克隆進(jìn)pFastBacI(Gibco-BRL，Bethesda，MD)。如Gibco-BRL Bac-to-Bac手冊中所述進(jìn)行重組桿狀病毒的制備，并將其用于感染生長在CCM3培養(yǎng)基(HyClone Laboratories，Logan，UT)中的Sf-9細(xì)胞，以便表達(dá)加有FLAG-標(biāo)簽的Chk1蛋白。
從經(jīng)桿狀病毒感染的SF9細(xì)胞的冷凍純化加有FLAG-標(biāo)簽的Chk1。將冷凍的細(xì)胞塊與等體積的2X溶胞緩沖液混合，該緩沖液含有100mMTris-HCl pH 7.5、200mM NaCl、50mM B-甘油磷酸酯、25mM NaF、4mM MgCl2、0.5mM EGTA、0.2％TWEEN-20、2mM釩酸鈉、2mM DTT以及蛋白酶抑制劑混合物(Complete mini，Boehringer Mannheim 2000catalog#1836170)。然后，細(xì)胞以杜恩斯勻漿器的自由杵勻漿20次，并以48,400x離心1小時(shí)。將M2親合柱以10柱體積的溶液預(yù)洗滌，先用50mM甘氨酸(pH 3.5)，接著用20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，輪流三次，以Tris NaCl洗滌結(jié)束。隨后，以25柱體積的20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1％TWEEN-20、1mM EGTA、1mM EDTA和1X完全小型蛋白酶片洗滌柱子。然后在4℃下在4小時(shí)內(nèi)將澄清的溶胞產(chǎn)物分批地結(jié)合到M2親合樹脂。接著將樹脂和溶胞產(chǎn)物的混合物倒入柱子，并收集流出物。將樹脂以10柱體積的20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl和3mM N-辛基糖苷洗滌。接著以6柱體積的含有0.5mg/mL FLAG肽(Sigma，2000 Catalog#F-3290)的冷20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、3mM N-辛基糖苷從柱子中洗脫加有FLAG-標(biāo)簽的Chk1。收集三個(gè)組分并分析是否存在加有FLAG-標(biāo)簽的Chk1。
測定Chk1激酶活性，其中包括100ng純化的FLAG-Chk1(150pmol ATP/min)、20μm Cdc25C肽(H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg-arg-arg-arg-OH)(SEQ ID NO1)、4μm ATP、2μCi[32P]γ-ATP、20mM Hepes pH 7.2、5mM MgCl2、0.1％NP40和1mMDTT。反應(yīng)由加入含有ATP的反應(yīng)混合物起始，在室溫下進(jìn)行10分鐘。通過加入磷酸(150mM的終濃度)終止反應(yīng)，并將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到磷酸纖維素圓盤。磷酸纖維素圓盤用150mM磷酸洗滌5次并風(fēng)干。添加閃爍液并在Wallac閃爍計(jì)數(shù)器中對圓盤計(jì)數(shù)。該測定在寬濃度范圍的Chk1抑制劑化合物存在下溫育并且計(jì)算化合物的IC50值。置于該測定的所有本發(fā)明化合物在測定中都顯示出小于約200nM的IC50值。
實(shí)施例2 選擇性 以Chk1為對比酶和下述蛋白激酶為比較(comparator)酶測試本發(fā)明Chk1抑制劑的選擇性Cdc2、Chk2、CTAK、EphA1、EphA2、Erk1、FGFR1、FGFR4、IR、JNK1、c-Kit、p38α、p38β、p38δ、Ros、Rse、Rsk2、TrkA、TrkB、蛋白激酶A、蛋白激酶C、pp60v-src、蛋白激酶B/Akt-1、p38MapK、p70S6K、鈣鈣調(diào)素依賴性激酶II和ab1酪氨酸激酶。
依照上述測量化合物相對Chk1的IC50值。利用SelectSmartTM(MDSPharma Servies，Bothell，Washington，USA)專利技術(shù)平臺(tái)測量所述化合物相對比較酶的IC50值，該平臺(tái)或者具有改進(jìn)的ELISA方法或者具有熒光極化。測試的所有抑制劑顯示出選擇性都是受測比較酶的至少20倍。
或者，測定所有這些激酶的IC50的程序已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述，包括美國專利公開No.2002-016521A1和1995年1月23日提交的PCT/US95/00912，兩者都通過引用并入本文。
實(shí)施例3 確定Chk1抑制劑的ECTFS值的基于細(xì)胞的檢測 本發(fā)明Chk1抑制劑的基于細(xì)胞的效能通過測定本發(fā)明化合物致敏HT29人癌細(xì)胞系對吉西他濱的能力進(jìn)行評估。平均ECTFS值由下述的多次實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)。因而，通過本文所述的方法合成本發(fā)明Chk1抑制劑。將化合物以10mM的原液濃度溶于100％二甲基亞砜(DMSO)并且在-70℃下儲(chǔ)存。HT29細(xì)胞由ATCC獲得并且保持在由包含10％胎牛血清(FCS)的RPMI、青霉素/鏈霉素、谷氨酸鹽和其它輔助材料組成的生長培養(yǎng)基中。吉西他濱鹽酸鹽由Qventas獲得并且以50mM的濃度溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)并且儲(chǔ)存在-20℃。3H-胸(腺嘧啶脫氧核苷)由Perkin-Elmer獲得。
將HT29細(xì)胞以每孔1.3×103的密度接種在96孔培養(yǎng)板(Corning)上并且使其貼壁過夜。第二天，吉西他濱先稀釋125倍，接著在1.2ml TiterTubesTM(BioRad)中于生長培養(yǎng)基中稀釋5倍。最終的稀釋系列濃度為11、20、4、0.8、0.16、0.032、6.4×10-3、1.28×10-4和5.12×10-5nM。然后將稀釋的吉西他濱加入細(xì)胞2小時(shí)。然后洗出吉西他濱并且將本發(fā)明Chk1抑制劑加入細(xì)胞24小時(shí)。在首先于生長培養(yǎng)基中稀釋1000倍后，10μM(DMSO原液)本發(fā)明Chk1抑制劑連續(xù)在1.2ml Titer TubesTM中稀釋3倍，達(dá)到最終稀釋系列2.5、0.83、0.28、0.09和0.03μM。72小時(shí)之后，每孔中細(xì)胞用1μMCi3H-胸腺嘧啶脫氧核苷標(biāo)記12小時(shí)，然后在-70℃下冷凍。然后解凍所述板并且用Cell MateTM板收獲器(Perkin Elmer)收獲到96孔濾板(Millipore)上。然后加入30μL MicroscintTM 20(Perkin Elmer)并且在Top Count plate reader(Perkin Elmer)上為該板計(jì)數(shù)。將數(shù)據(jù)歸一為單獨(dú)用本發(fā)明Chk1抑制劑處理的細(xì)胞，然后以吉西他濱濃度(μM)相對細(xì)胞生長(100％等于1.0)為作對數(shù)/對數(shù)圖。對于所用各個(gè)Chk1抑制劑濃度，推導(dǎo)在90％生長抑制下的提高的倍數(shù)敏感性，然后以Chk1抑制劑濃度相對倍數(shù)敏感性作圖。然后計(jì)算ECTFS值。
接受該檢測的本發(fā)明Chk1抑制劑的ECTFS測量值小于約1000nM。
實(shí)施例4 本發(fā)明Chk1抑制劑增強(qiáng)癌癥治療對細(xì)胞的殺死 為了證明本發(fā)明化合物對Chk1的抑制作用使靶細(xì)胞對DNA損傷劑的殺死作用敏感，可將細(xì)胞在本發(fā)明的Chk1抑制劑存在下孵育并暴露于輻射或化學(xué)DNA-損傷劑。在37℃下，在含有5％CO2的加濕保溫箱中，將以細(xì)胞plated at a density of 1000-2000每孔的密度接種在96孔微孔板中的細(xì)胞生長在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RMPI 164018小時(shí)，測試的孔包括感興趣的任何細(xì)胞或細(xì)胞系，例如HeLa、ACHN、786-0、HCT116、HCT15、SW620、HT29、Colo205、SK-MEL-5、SK-MEL-28、A549、H322、OVCAR-3、SK-OV-3、MDA-MB-231、MCF-7、PC-3、HL-60、K562、Bx-PC3、Mia-PaCa2、H810、H226、H2126和MOLT4。指定的所有細(xì)胞系指下列人細(xì)胞系 HeLa宮頸腺癌 ACHN腎腺癌 786-0 腎腺癌 HCT116 結(jié)腸癌 SW620 結(jié)腸癌，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 HT-29 結(jié)腸直腸腺癌 Colo205結(jié)腸腺癌 SK-MEL-5 黑素瘤 SK-MEL-28 惡性黑素瘤 A549 肺癌 H322 支氣管肺泡癌 OVCAR-3卵巢腺癌 SK-OV-3卵巢腺癌 MDA-MB-231 乳腺癌 MCF-7 乳腺癌 PC-3 前列腺癌，從轉(zhuǎn)移瘤至骨 HL-60 急性早幼粒細(xì)胞性白血病 K562 慢性髓細(xì)胞性白血病 MOLT4 急性成淋巴細(xì)胞性白血??；T淋 巴母細(xì)胞 細(xì)胞僅以含有化療藥物的培養(yǎng)基或以含有化療藥物和Chk1抑制劑的培養(yǎng)基處理。在通過測定3H-胸(腺嘧啶脫氧核)苷的攝取以測量生長之前，將細(xì)胞孵育約5天?；熕幬锇ㄒ劳胁窜?、阿霉素、順鉑、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)。將細(xì)胞的生長抑制至未處理的對照細(xì)胞的90％所需要的藥物濃度定義為GI90。
本發(fā)明化合物可以其它的包括氨甲喋呤、羥基脲、2-氯腺嘌呤核苷、氟達(dá)拉濱、氮胞苷以及吉西他濱在內(nèi)的抗代謝藥物進(jìn)行測試，以評估其增強(qiáng)這些活性劑殺死作用的能力。通過評估與吉西他濱聯(lián)合增強(qiáng)殺死HT29結(jié)腸直腸癌，可將本發(fā)明化合物相互比較。
此外，可測試本發(fā)明Chk1抑制劑增強(qiáng)通過輻射殺死的能力。
實(shí)施例5 測量動(dòng)物模型中的Chkl抑制劑活性的靈敏性測定 開發(fā)了下面的靈敏性測定，以測量嚙鼠類動(dòng)物腫瘤模型中的Chkl抑制劑活性。具體地，除了別的以外，可以使用該測定，以測量Chkl抑制劑阻斷腫瘤模型中的Chkl功能的能力，并允許評價(jià)促進(jìn)Chk1抑制劑向分子靶的接近的條件。
使用定量免疫熒光測定，其通過監(jiān)控絲氨酸10上的組蛋白H3磷酸化(H3-P)(有絲分裂-特異性的事件)來測量有絲分裂指數(shù)，測量選擇性的Chkl抑制劑取消化療-誘導(dǎo)的檢查點(diǎn)的能力(Ajiro等，J BiolChem.，27113197-201，1996；Goto等，J Biol Chem.，27425543-9，1999)。測定方案如下。切離來自用或未用Chkl活化劑(在本研究中，化療劑)和/或Chkl抑制劑處理的嚙齒類動(dòng)物的腫瘤，并用石蠟包埋。將腫瘤切成6微米厚的切片，并封固到玻璃載玻片上。通過連續(xù)用二甲苯、100％乙醇、95％EtOH、70％EtOH和去離子H2O處理3分鐘，從載玻片除去石蠟。然后，在10mM檸檬酸鈉中將載玻片加熱到95℃進(jìn)行10分鐘，隨后為20分鐘冷卻步驟。用封閉緩沖液(溶于含有0.05％Triton X-100的磷酸緩沖鹽水(PBST)中的20％正常人血清和2％牛血清白蛋白)封閉載玻片30分針。在封閉緩沖液中1∶200稀釋抗磷酸組蛋白(antipbospho histone)H3抗體(Upstate Biotech，目錄號(hào)06-570)，并與載玻片一起溫育1小時(shí)。在PBST中洗滌載玻片3次、5分鐘。加入第二抗體驢抗兔羅丹明(Jackson，目錄號(hào)711-295-152)30分鐘。然后，在PBST中洗滌載玻片2次，加入75μM溶于PBS中的0.1μM/ml DAPI(Sigma)，并允許染色30分鐘。然后，在PBST中洗滌載玻片另外2次，并用Vectashield(Vector，目錄號(hào)HJ400)封固。使用熒光顯微鏡術(shù)觀察載玻片。使用Metamorph軟件(Universal Imaging Corporation，Version 4.6)，定量用H3-P抗體染色的細(xì)胞相對于總(DAPI染色的)細(xì)胞的百分比。
實(shí)施例6 選擇性的Chkl抑制劑取消DNA損傷-誘導(dǎo)的G2和S期檢查點(diǎn) 以前的研究證實(shí)，選擇性的Chkl抑制劑基本上取消DNA損傷-誘導(dǎo)的G2/M和S期檢查點(diǎn)。在前者中，DNA損傷由電離輻射(IR)誘導(dǎo)，它的靶期是G2期。在后者中，DNA損傷由化療劑誘導(dǎo)，它的靶期是S期。見公開的美國專利申請公開號(hào)2003/0069284和其中引用的文獻(xiàn)。
簡而言之，通過有絲分裂指數(shù)實(shí)驗(yàn)，測定IR-誘導(dǎo)的G2 DNA損傷檢查點(diǎn)的Chkl抑制劑取消。用800拉德輻照大約1×106HeLa細(xì)胞，并在37℃溫育7小時(shí)。因?yàn)檫@些細(xì)胞在功能上是p53陰性的，所以它們排他地停滯在G2。然后，加入洛可達(dá)唑至0.5μg/mL的濃度，并在37℃溫育15小時(shí)(洛可達(dá)唑的加入被設(shè)計(jì)用于捕捉穿過有絲分裂中的G2停滯的細(xì)胞，從而阻止它們進(jìn)一步進(jìn)入Gl，并允許定量M期細(xì)胞)。加入選擇性的Chkl抑制劑8小時(shí)，通過離心收獲細(xì)胞，用PBS洗滌一次，然后重新懸浮于2.5mL 75mM KCl中，并再次離心。然后將細(xì)胞固定在3mL新制備的冷醋酸∶MeOH(1∶3)中，并在冰上溫育20分鐘。沉淀細(xì)胞，吸出固定溶液，并將細(xì)胞重新懸浮于0.5mL PBS中。通過將100μL固定的細(xì)胞移液到玻璃顯微鏡載玻片上，并用1mL固定溶液沖洗樣品，制備有絲分裂展開樣。然后，使載玻片風(fēng)干，用Whghts染科(Sigma，St.Louis，MO)染色1分鐘，然后在水中洗滌一次，并在50％MeOH中洗滌一次。濃縮的染色體的存在和核被膜的缺乏，指示著有絲分裂的細(xì)胞。在有輻照存在下，Chkl抑制劑導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞數(shù)目的增加，從而證實(shí)IR-誘導(dǎo)的G2停滯的取消。該檢查點(diǎn)取消會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白B/cdc2的活性的增強(qiáng)，這是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂所必需的。用IR、隨后用Chk1抑制劑處理的細(xì)胞，因而攜帶受損的DNA進(jìn)入有絲分裂。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了下述假設(shè)，即Chkl參與IR-誘導(dǎo)的G2。
實(shí)施例7 在有Chkl活化劑存在下，異種移植腫瘤模型中的腫瘤細(xì)胞攝取Chkl抑制劑 在異種移植腫瘤模型中，將HT29結(jié)腸癌腫瘤移入裸鼠的脅腹，并允許生長至200mm3。然后在第1天和第4天，間隔3天，用載體、300mg/kgChkl抑制劑、20mg/kg吉西他濱或共同施用300mg/kg Chkl抑制劑和20mg/kg吉西他濱處理小鼠2次。與單獨(dú)的吉西他濱相比，共同施用Chkl抑制劑和吉西他濱處理攜帶腫瘤的小鼠導(dǎo)致腫瘤的4天生長延遲。
為了評價(jià)Chkl抑制劑向腫瘤組織中的擴(kuò)散，測量Chkl抑制劑的血漿和組織水平。使用Alzet泵，在連續(xù)送遞系統(tǒng)中，經(jīng)24小時(shí)時(shí)間段，將500mg/kg Chkl抑制劑施用給攜帶HT29腫瘤的小鼠。取血漿樣品，然后收集腫瘤、腎、肝、脾和肺。在1、2、4、8和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)收集。提取組織，并定量Chk1抑制劑的水平。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Chkl抑制劑穿入正常和腫瘤組織，在腫瘤組織中達(dá)到約15μM的水平，且在脾組織中在8小時(shí)達(dá)到約20μM的峰值。因而，Chkl抑制劑能容易地被增殖細(xì)胞攝取，且可以與Chkl激活化療劑一起，用作治療增殖性疾病的療法。
實(shí)施例8 用Chkl抑制劑和吉西他濱治療的腫瘤的劑量反應(yīng) 為了確定吉西他濱治療后的Chkl抑制劑的有效劑量和劑量依賴性的檢查點(diǎn)取消是否與抗腫瘤活性有關(guān)，進(jìn)行了劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。
將HT29腫瘤細(xì)胞移入裸鼠，并允許腫瘤發(fā)展10天。腫瘤在開始時(shí)大約100mm3。用MTD(160mg/kg)的吉西他濱、然后用50mg/kg、200mg/kg或400mg/kg的Chkl抑制劑治療動(dòng)物。如基于細(xì)胞的測定所確定的，在該實(shí)驗(yàn)中的吉西他濱預(yù)處理時(shí)間是32小時(shí)，所述測定指示該時(shí)間點(diǎn)對于這類腫瘤是最佳的。在每個(gè)治療方案中的腫瘤體積的分析表明，用所述療法治療攜帶HT29腫瘤的小鼠，會(huì)比單獨(dú)的吉西他濱更強(qiáng)地減慢腫瘤生長，200mg/kg或400mg/kgChkl抑制劑+吉西他濱再次顯示了Chkl抑制劑的劑量依賴性效應(yīng)。
實(shí)施例9 確定試劑是否是Chkl活化劑的測定 為了確定試劑是否是Chkl活化劑，可以使用Chk1上的特定磷酸化位點(diǎn)的磷酸特異性的抗體，測量Chkl的磷酸化狀態(tài)。已經(jīng)表明，在用電離輻射、紫外線輻射、羥基脲、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、替莫唑胺和吉西他濱處理細(xì)胞后，絲氨酸317和345會(huì)被磷酸化。Liu等，Genes Dev.141448-59，2000；Zhao等，Mol.Cll Biol.214129-4139，2001；Lopez-Giroma等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9811289-11294，200l；Guo等，Genes Dev.142745-2756，2000；Gatei等，J.Biol.Chem.27814806-14811，2003；Ng等，J Biol Chem.279(10)-.8808-19，2004；Wang等，Natl Acad Sci USA.100(26)15387-92，2003；Stojic等，GenesDev.18(11)1331-44，2004。這些絲氨酸位點(diǎn)會(huì)被上游檢查點(diǎn)激酶Atm和Atr磷酸化。Liu等，Genes Dev.141448-59，2000；Zhao等Mol.CellBiol.214129-39，2001)。
通過腫瘤細(xì)胞的蛋白印跡或免疫組織化學(xué)，可以監(jiān)控候選Chkl活化劑引起的這些位點(diǎn)的磷酸化。例如，可以使用下面的方案來證實(shí)，吉西他濱導(dǎo)致絲氨酸345和317處的Chkl激活。用20μM吉西他濱處理HT29細(xì)胞2小時(shí)。從細(xì)胞生長培養(yǎng)基中洗掉吉西他濱，并將細(xì)胞培養(yǎng)另外的22小時(shí)。制備蛋自裂解物，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用對磷酸化的絲氨酸317或345(Cell Signalling)特異性的抗血清(Cell Signalling)探測。蛋白印跡表明，用吉西他濱處理HT29結(jié)腸癌細(xì)胞，導(dǎo)致絲氨酸317和345的磷酸化。
實(shí)施例10 監(jiān)控Chkl抑制劑引起的Chkl活性的測定 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Chkl在絲氨酸296處的磷酸化由吉西他濱處理腫瘤細(xì)胞刺激，且在該位點(diǎn)的磷酸化由Chkl抑制劑抑制。在該位點(diǎn)的磷酸化不受到渥曼青霉素的抑制，后者抑制Atm和Atr。因此，絲氨酸296的磷酸化不同于絲氨酸317和345的磷酸化。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在純化的Chkl制劑中，該位點(diǎn)被磷酸化，從而表明純化的酶能磷酸化它自身或其它Chkl分子的絲氨酸296。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明絲氨酸296處的磷酸化由Chkl自身進(jìn)行。因此，該方法可以用于監(jiān)控Chkl活化劑引起的腫瘤中的Chkl活性。而且，該方法可以用于測量Chkl抑制劑對Chkl激活的抑制。
因而，用20μM吉西他濱處理HT29細(xì)胞2小時(shí)。從細(xì)胞生長培養(yǎng)基中洗掉吉西他濱，并將細(xì)胞培養(yǎng)另外的22小時(shí)。制備蛋白裂解物，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用對磷酸化的絲氨酸296(Cell Signalling)特異性的抗血清(CellSignalling)探測。蛋白印跡表明，用吉西他濱處理HT29結(jié)腸癌細(xì)胞，導(dǎo)致絲氨酸296的磷酸化。而且，用選擇性的Chkl抑制劑處理HT29細(xì)胞15分鐘，沒有表現(xiàn)出絲氨酸296磷酸化。這些數(shù)據(jù)表明絲氨酸296磷酸化由Chkl激酶進(jìn)行。
實(shí)施例11 動(dòng)物腫瘤模型 為了測試本發(fā)明Chk1抑制劑在小鼠中增強(qiáng)通過DNA損傷劑殺死腫瘤的能力，建立了采用結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系的異種移植腫瘤模型。5-氟尿嘧啶(5-FU)或吉西他濱可用作DNA損傷劑。HT29和Colo205(人結(jié)腸癌)以及H460和Calu-6(非小細(xì)胞癌)細(xì)胞可用于在6-8周齡雌性胸腺Balb/c(nu/nu)小鼠中培植異種移植腫瘤。小鼠飼養(yǎng)在無病原體的層流室中，自由攝取無菌食品和水。在5％CO2加濕環(huán)境中，細(xì)胞系在補(bǔ)充有10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和1.5mM L-谷氨酸的RPMI1640培養(yǎng)基中生長至亞融合狀態(tài)。在CMF-PBS中制備單細(xì)胞混懸液，并且細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×108細(xì)胞/mL。在小鼠右側(cè)或右腿皮下(s.c.)總計(jì)接種1×107細(xì)胞(100μL)。
當(dāng)腫瘤達(dá)到75-100cm3(通常接種后7-11天)，將小鼠隨機(jī)(5-15小鼠/群)分為四個(gè)處理組使用。腫瘤以游標(biāo)卡尺測量，腫瘤體積使用憑經(jīng)驗(yàn)推導(dǎo)的以下公式估算腫瘤體積(cm3)＝腫瘤長度(cm)×腫瘤寬度(cm)×腫瘤厚度(cm)/3.3。治療包括i)以160mg/kg腹膜內(nèi)(i.p)注射吉西他濱100μL。在以吉西他濱治療的小鼠中觀察到腫瘤生長的延緩。預(yù)料對小鼠以160mg/kg吉西他濱聯(lián)合口服Chk1抑制劑的治療可減少腫瘤體積并延長壽命。在實(shí)驗(yàn)期間，每隔一天監(jiān)測腫瘤大小。
顯然，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的條件下，可對以上描述的本發(fā)明作出許多修改和變化。因此，本發(fā)明僅為所附的權(quán)利要求書所限定。
權(quán)利要求
1.具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物或其可藥用鹽、前藥或溶劑合物，
其中R1為鹵素、C1-3烷基、CN和CF3；
R2為氫、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、鹵素、或N(Rb)2，其中Rb獨(dú)立地為氫或C1-3烷基；
R3為6-或7-元飽和雜環(huán)，其中包含一個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)和第二個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)、環(huán)氧或環(huán)硫，其中的Ra獨(dú)立地為氫、C1-3烷基、CH2CN或CH2CH2CN，而且其中的R3任選被氧代(＝O)取代；
R4為氫、C1-3烷基、OC1-3烷基、SC1-3烷基、N(Rb)2、NRbC(＝O)C1-3烷基、或5-或6-元飽和雜環(huán)，其中包含一個(gè)N-Ra基團(tuán)和任選被1-3個(gè)C1-3烷基基團(tuán)取代的環(huán)；
或R2和R4與和其連接的碳一起形成5-至7-元飽和碳環(huán)狀環(huán)；
R5為氫或鹵素，
條件是R2和R4中至少一個(gè)不是氫，而且當(dāng)R5為鹵素時(shí)，R2或R4為氫。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為氯、甲基、CN或CF3。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R2為氫、甲基、乙基、氯、溴、二甲基氨基、氰基或甲氧基。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R2不是氫。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R4為氫、甲基、氯、甲氧基、氟、二甲基氨基、-SCH3、異丙氧基、-NHC(＝O)CH(CH3)2、-NHC(＝O)CH3、
或
6.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R4為甲基、氯或甲氧基。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R5為鹵素。
8.如權(quán)利要求7所述的化合物，其中R5為氟。
9.如權(quán)利要求7所述的化合物，其中R2或R4為氫。
10.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中R4為氫。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R2和R4一起形成5元或6元飽和雜環(huán)。
12.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R3選自下述基團(tuán)
和
13.一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物或其可藥用鹽、前藥或溶劑合物
其中R1為鹵素、C1-3烷基、CN或CF3；
R2為氫、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、鹵素、或N(Rb)2其中Rb獨(dú)立地為氫或C1-3烷基；
R3為6-或7-元飽和雜環(huán)，其中包含一個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)或者第二個(gè)環(huán)狀N-Ra基團(tuán)、環(huán)氧或環(huán)硫，其中的Ra獨(dú)立地為氫、C1-3烷基或CH2CN，而且其中的R3任選被氧代(＝O)取代；
R4為氫、C1-3烷基、OC1-3烷基或鹵素；
或R2和R4與和其連接的碳一起形成5-至7-元飽和碳環(huán)狀環(huán)；
條件是R2和R4中至少一個(gè)不是氫。
14.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中R1為氯、甲基、CN或CF3。
15.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中R2為甲基、乙基、氯、溴、氰基、二甲基氨基或甲氧基。
16.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中R4為甲基、氯或甲氧基。
17.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中R2和R4與和其連接的碳一起形成6元飽和雜環(huán)。
18.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中R3選自下述基團(tuán)
19.如權(quán)利要求1所述的具有下述結(jié)構(gòu)的化合物及其混合物，或其鹽、溶劑合物或前藥，

20.如權(quán)利要求13所述的具有下述結(jié)構(gòu)的化合物及其混合物，或其鹽、溶劑合物或前藥，
21.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中R1為甲基或氰基；R2為甲基、氰基、氯或溴；R3為
22.如權(quán)利要求21所述的化合物，其中R4為氫。
23.如權(quán)利要求21所述的化合物，其中R4為甲基或乙基。
24.如權(quán)利要求21所述的化合物，其中R4為氯。
25.具有下述結(jié)構(gòu)的化合物及其混合物，或其鹽、溶劑合物或前藥，
26.抑制細(xì)胞中檢查點(diǎn)激酶1的方法，包括使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1或權(quán)利要求13化合物接觸的步驟。
27.使因醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥而接受化療或放療治療的個(gè)體的細(xì)胞敏化的方法，包括給所述個(gè)體施用與化療劑、放療劑或其混合物聯(lián)合的治療有效量的權(quán)利要求1或權(quán)利要求13化合物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括給所述的個(gè)體施用細(xì)胞因子、淋巴因子、生長因子、其它造血因子或其混合物。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述化療劑選自烷化劑、抗代謝物、激素或其拮抗劑、放射性同位素、抗體及其混合物。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中放療劑選自γ輻射、X-射線輻射，紫外光、可見光、紅外輻射和微波輻射。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的病癥選自結(jié)腸直腸癌、頭頸部癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、外陰癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、腦癌、骨肉瘤以及肺癌的癌癥。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述病癥選自粘液瘤和圓形細(xì)胞癌、局部晚期腫瘤、轉(zhuǎn)移性癌、尤文氏肉瘤、轉(zhuǎn)移癌、淋巴性轉(zhuǎn)移、鱗狀細(xì)胞癌、食道鱗狀細(xì)胞癌、口腔癌、多發(fā)性骨髓瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性非淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞白血病、滲出性淋巴瘤(基于體腔的淋巴瘤)、胸腺淋巴瘤肺癌、小細(xì)胞癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、產(chǎn)生ACTH的腫瘤、非小細(xì)胞癌、乳腺癌、小細(xì)胞癌、導(dǎo)管癌、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸直腸瘤形成相關(guān)的息肉、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、原發(fā)性表面膀胱腫瘤、膀胱的侵入性轉(zhuǎn)移細(xì)胞癌、肌肉侵入性膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、原發(fā)性腹膜上皮贅生物、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、陰道癌、外陰癌、子宮癌以及在卵泡中的實(shí)體瘤、睪丸癌、陰莖癌、腎細(xì)胞癌、內(nèi)發(fā)性腦腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞、骨瘤以及骨肉瘤、惡性黑色素瘤、人皮膚角化細(xì)胞進(jìn)行性腫瘤、扁平細(xì)胞癌、甲狀腺癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腹膜滲漏、惡性腫瘤性胸腔積液、間皮瘤、腎母細(xì)胞瘤、膽囊癌、滋養(yǎng)層贅生物、血管外皮瘤以及卡波西氏肉瘤的癌癥。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述治療為對選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、白癜風(fēng)、韋格內(nèi)氏肉芽腫病以及全身性紅斑狼瘡的炎癥施用。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其中權(quán)利要求1所述的化合物對Chk1的抑制相對于蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src抑制Chk1具有至少20倍的選擇性。
35.如權(quán)利要求27所述的方法，其中權(quán)利要求1所述的化合物對Chk1的抑制相對于蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src抑制Chk1具有至少75倍的選擇性。
36.如權(quán)利要求27所述的方法，其中權(quán)利要求1所述的化合物對Chk1的抑制相對于蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src抑制Chk1具有至少100倍的選擇性。
37.一種抑制異常細(xì)胞增殖的方法，包括讓含有異常增殖細(xì)胞的細(xì)胞群與Chk1活化劑接觸以使所述異常增殖細(xì)胞之間的細(xì)胞周期停滯基本同步，并且隨后讓所述細(xì)胞群與權(quán)利要求1或權(quán)利要求13的化合物接觸以使所述細(xì)胞周期停滯基本解除。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述Chk1活化劑包括至少一種化療劑。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中Chk1活化劑包括離子化或紫外輻射。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述離子輻射與輻射增敏劑、光敏劑或其混合物聯(lián)合施用。
41.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述異常增殖細(xì)胞是非癌性細(xì)胞。
42.權(quán)利要求1或13所述化合物用于制造抑制檢查點(diǎn)激酶1的藥物的用途。
43.權(quán)利要求1或13所述化合物用于制造使個(gè)體中細(xì)胞敏化的藥物的方法，所述個(gè)體因醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥而接受化療或放療治療。
44.權(quán)利要求1或13所述化合物用于制造抑制包含異常增殖細(xì)胞的細(xì)胞群中的異常細(xì)胞增殖的藥物的用途。
45.權(quán)利要求1或13所述化合物用于制造在細(xì)胞內(nèi)病癥的治愈性或預(yù)防性治療的藥物的用途，其中所述病癥中檢查點(diǎn)激酶1的抑制具有治療益處。
46.人類藥物用途的制品，其包含
(a)包含權(quán)利要求1或13化合物的藥物組合物；
(b)包裝說明書，規(guī)定該組合物用于治療包括異常細(xì)胞增殖在內(nèi)的適應(yīng)癥，和
(c)容器。
47.人類藥物用途制品，其包含
(a)包含權(quán)利要求1或13化合物的藥物組合物；
(b)包裝說明書，規(guī)定該組合物在治療與DNA損傷或DNA復(fù)制有關(guān)的適應(yīng)癥中可用作化學(xué)增敏劑或輻射增敏劑；
(c)容器。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可用于與DNA損傷和DNA復(fù)制有關(guān)的疾病和病癥的治療的取代的脲化合物。本發(fā)明還公開了制備這些化合物的方法以及它們例如在治療癌癥和其它的以DNA復(fù)制、染色體分離或細(xì)胞分裂中的缺陷為特征的疾病中用作治療劑的用途。
文檔編號(hào)C07D403/12GK101151259SQ200680010150
公開日2008年3月26日 申請日期2006年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月29日
發(fā)明者F·迪亞茲, F·S·法魯茲, R·霍爾庫姆, E·A·凱西奇, H·C·奧伊, A·魯?shù)婪? F·斯塔彭貝克, E·托爾塞特, J·J·瓜迪諾, K·L·費(fèi)舍爾, A·W·庫克 申請人:艾科斯有限公司