專利名稱：紫杉烷類化合物的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從紅豆杉枝葉中高效提取紫杉烷類化合物的方法，還涉及從所述紫杉烷類化合物中分離7-β-木糖基紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
紫杉烷類化合物是一類具有二萜母核結(jié)構(gòu)的化合物，在自然界它主要存在于紅豆杉枝葉中。
1971年Wani等(Wani Mc，et al，J.A.C.S.93，2325，1971.)從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)樹皮中首次提取得到屬于所述紫杉烷類化合物的紫杉醇，其結(jié)構(gòu)式如下 已知紫杉醇對B-16黑色素瘤、L-1210和P-388白血病、MX-1乳腺癌和異種移植的CX-1結(jié)腸癌等許多腫瘤模型顯示極強的抗癌活性，其作用機理為它能促使微管蛋白聚合成微管，并在其存在下微管不再解體，使癌細(xì)胞限制在構(gòu)架組織內(nèi)而死亡[Dentsch-HM et al，J.M.C.32(4)，788，1989；Manfredi JJ，et al，Phannacolther 25，83，1984]。1992年12月，美國FDA批準(zhǔn)BMS公司的紫杉醇作為轉(zhuǎn)移性卵巢癌的二線治療藥；1993年12月又批準(zhǔn)該藥作為晚期乳腺癌治療藥，目前該藥已經(jīng)在二十多個國家批準(zhǔn)上市。
目前提取天然紫杉醇的方法包括先從紅豆杉枝葉中提取紫杉烷類化合物的混合物，再從所述混合物中分離紫杉醇。所述提取紫杉烷類化合物的方法一般包括如下步驟(1)在容器中裝入經(jīng)干燥和粉碎的紅豆杉枝葉，用浸提液浸泡一段時間；
(2)液-固分離后，再加入浸提液對分離的固體再次進(jìn)行浸泡，分離得到浸提液；(3)重復(fù)步驟(2)。
這種多級浸泡法的缺點是所需時間長，浸提液用量大，從而使得到的產(chǎn)品濃度低，后續(xù)除去溶劑的工作量大，限制了浸提效率。
另外，目前認(rèn)為紫杉醇的活性結(jié)構(gòu)是其分子結(jié)構(gòu)中的C-13位側(cè)鏈以及C-4、C-5、C-20位的環(huán)氧丙烷結(jié)構(gòu)[陳未名等，藥學(xué)學(xué)報.1990，25(3)27] 由于紫杉醇療效顯著，使其需求量很大。目前紫杉醇主要靠從紅豆杉中分離提取。紅豆杉生長非常緩慢，并且在其樹皮中紫杉醇的含量一般僅在0.01～0.03重量％之間，在紅豆杉枝葉中紫杉醇的含量更低。因此，天然紫杉醇的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足要求。有必要尋找新的紫杉醇來源或者其替代品。
7-β-木糖基紫杉醇(7-xylosyltaxol)也是一種紫杉烷類化合物，它可從紅豆杉中提取得到的紫杉烷類化合物的混合物中分離得到，它具有如下結(jié)構(gòu)式 通過特定的酶水解去除木糖即可得到紫杉醇[Patel RN.Annu Rev Microbiol.1998，52361-95]，因此該化合物可以作為制備紫杉醇的一種原料。此外其結(jié)構(gòu)中含有紫杉醇C-13位的側(cè)鏈以及C-4、C-5、C-20位的環(huán)氧丙烷活性結(jié)構(gòu)，加上C-7位聯(lián)有木糖，使得該化合物具有較好的水溶性，可以很方便地制成注射劑。
因此快速高效地從紅豆杉中提取紫杉烷類化合物，并且除了分離紫杉醇化合物以外還從中分離7-β-木糖基紫杉醇(7-xylosyltaxol)具有很高的商業(yè)開發(fā)價值。
也就是說，需要開發(fā)一種高效率浸提紅豆杉枝葉以提取紫杉烷類化合物的方法，并需要一種從所述紫杉烷類化合物中分離7-β-木糖基紫杉醇的方法。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高效率浸提紅豆杉枝葉以提取紫杉烷類化合物的方法；本發(fā)明的另一個目的是提供一種從紅豆杉中提取7-β-木糖基紫杉醇的方法。
因此，本發(fā)明提供一種紫杉烷類化合物的提取方法，它包括(1)用多級連續(xù)滲漉提取法用有機浸提液對紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到含紫杉烷類化合物的有機浸提溶液；(2)除去所述有機浸提溶液中的有機溶劑，得到水性浸提液；(3)用極性有機溶劑對所述水性浸提液進(jìn)行萃取，得到有機萃取液；(4)除去萃取液中的有機溶劑，得到含所述紫杉烷類化合物的浸膏。
本發(fā)明的另一方面提供一種從紅豆杉中提取7-β-木糖基紫杉醇的方法，它包括如下步驟(1)用多級連續(xù)滲漉提取法用有機浸提液對紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到含紫杉烷類化合物的有機浸提溶液；(2)除去有機浸提溶液中的有機溶劑，得到水性浸提液；(3)用極性有機溶劑對所述水性浸提液進(jìn)行萃取，得到有機萃取液；(4)除去萃取液中的有機溶劑，得到含所述紫杉烷類化合物的浸膏；(5)對所述浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以乙酸C1-C6烷酯洗脫，得到含7-β-木糖基紫杉醇的粗溶液；(6)除去所述粗溶液中的乙酸C1-C6烷酯，得到干浸膏；(7)將干浸膏溶解在C1-C6脂肪醇溶劑中，隨后對其進(jìn)行大孔樹脂柱色譜分離，以C1-C6脂肪醇作為洗脫液，得到7-β-木糖基紫杉醇的醇溶液；(8)除去C1-C6脂肪醇溶劑，得到7-β-木糖基紫杉醇。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明多級連續(xù)滲漉提取的示意圖；圖2是本發(fā)明一個較好實例中的分離純化流程圖；圖3是本發(fā)明一個較好實例的滲漉桶的示意圖。
具體實施例方式
下面參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明紫杉烷類化合物的提取方法包括用多級連續(xù)滲漉提取法對紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提。所述多級連續(xù)滲漉提取法如圖1所示，它包括多個串聯(lián)的滲漉段，使用時先在各個滲漉段加入一定量經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉，隨后如箭頭A所示向第一滲漉段緩慢地加入浸提液，該浸提液流經(jīng)第一滲漉段的紅豆杉枝葉后流向第二滲漉段。在后續(xù)加入的浸提液的驅(qū)動下浸提液逐漸流向最后一個滲漉段。在浸提液流經(jīng)最后一個滲漉段后，收集一定量的浸提液B，停止向第一滲漉段加入浸提液而改向第二滲漉段加入浸提液，即此時第二滲漉段升格為第一滲漉段。原先的第一滲漉段卸料后加入新的未浸提的紅豆杉枝葉作為最后一個滲漉段。
停止向第一滲漉段加入浸提液而改成向第二滲漉段加入浸提液的時機取決于滲漉段所含的紅豆杉枝葉的量以及浸提液的流量。一般來說，當(dāng)流經(jīng)最后一個滲漉段而收集得到的浸提液體積(單位為毫升)達(dá)到每一個滲漉段所含紅豆杉枝葉重量(單位為克)的1-3倍，較好1.5-2.5倍，最好為2倍時，就可實施所述浸提液加料轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明方法中，所述浸提液可以以連續(xù)的方式加入，也可以以間歇的方式加入。
在本發(fā)明的一個較好實例中，紅豆枝葉原料平均放置在各個滲漉段，當(dāng)流經(jīng)最后一級滲漉段而收集得到的浸提液體積(ml)達(dá)到每一個滲漉段所含紅豆杉枝葉重量(g)的1-3倍時，停止向第一級滲漉段加入提取液，并在最后一級再增加一個滲漉段，隨后向第二級滲漉段加入提取液。此時，新增加的滲漉段可以是原第一級滲漉段卸料后再加入新的紅豆杉枝葉后形成的。
實施本發(fā)明多級連續(xù)滲漉提取的滲漉裝置無特別的限制。在本發(fā)明的一個較好實例中，使用如圖3所示的滲漉桶。
圖3所示的滲漉桶包括料筒1、底層篩網(wǎng)2和任選的閥門3。所述料筒通常由不銹鋼、玻璃、陶瓷等材料制成，它可以是直筒形的，也可以是喇叭形(例如側(cè)面和底面呈120-130℃，較好125℃的夾角)的。料筒1的底面具有一層篩網(wǎng)2，篩網(wǎng)的網(wǎng)孔大小無特別的限制，取決于所需的浸提液流量和紅豆杉枝葉的粉碎程度。在本發(fā)明的一個較好實例中，所述篩網(wǎng)是20目的不銹鋼篩網(wǎng)。
滲漉桶篩網(wǎng)下方還可任選地包括一個閥門，從而當(dāng)該滲漉桶退出滲漉流程時可關(guān)閉閥門，以免內(nèi)部殘留物流出而造成污染。
所述多級連續(xù)滲漉提取法的級數(shù)無限制，但是從經(jīng)濟性的角度考慮，所述多級連續(xù)滲漉提取法較好為4-15級，更好為6-12，最好為10級。
在浸提前需要對紅豆杉枝葉進(jìn)行干燥。干燥的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。其非限定性例子包括加熱干燥。干燥后紅豆杉枝葉的含水量無特別的限制。但是，如果含水量太高，則會降低制得的紫杉烷類化合物水性浸提液的濃度，造成后處理困難；含水量太低，則會增加干燥所需的成本。因此，一般來說，含水量宜為5％～15重量％，較好為10重量％。
本發(fā)明多級連續(xù)滲漉法使用有機溶劑作為浸提液。所述有機溶劑無特別的限制，只要它能浸提紅豆杉枝葉中的紫杉烷類化合物即可。所述有機溶劑的非限定性例子包括醇，較好是C1-6脂肪醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇或它們的50-100％的水溶液；酮，例如丙酮或其50-100％水溶液、甲乙酮或其50-100％水溶液、丁酮、環(huán)己酮；醚，例如乙醚或其50-100％水溶液、甲基乙基醚或其50-100％水溶液；酯，例如乙酸C1-4烷酯，如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯。在本發(fā)明的一個較好實例中，所述有機溶劑是濃度為50-100％的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。
為了增加接觸表面以提高滲漉效率，一般預(yù)先將紅豆杉枝葉粉碎成例如粒徑為0.5-5mm，較好為1-2mm的粉末。
用本發(fā)明有機浸提液得到含紫杉烷類化合物的有機浸提溶液后，除去所述有機浸提溶液中的有機溶劑，由于紅豆杉枝葉中含有水分的緣故，因此得到的是紫杉烷類化合物的水性浸提液(也稱為含水粗浸膏)。所述除去有機溶劑的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，例如它可以是加熱揮發(fā)或減壓蒸餾的方法。
用上述方法得到的紫杉烷類化合物的含水粗浸膏含有許多非紫杉烷類化合物雜質(zhì)。為了提高紫杉烷類化合物浸膏的純度，本發(fā)明方法還可包括用極性有機溶劑對其進(jìn)行萃取的步驟，在實施所述萃取步驟時，先向得到的紫杉烷類化合物含水浸膏中加入一定量的水，隨后進(jìn)行萃取。所述水的加入量無特別的限制，只要能達(dá)到萃取的目的即可。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)具體情況可容易地確定水的加入量。在本發(fā)明的一個較好實例中，水的加入量為含水浸膏體積的0.5-2倍，較好為1倍。萃取步驟使用的極性有機溶劑無特別的限制，只要該溶劑能作為萃取劑從水溶液中萃取紫杉烷類化合物即可。所述萃取劑的例子包括低級鹵代烴，例如氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氯乙烷，1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷等，較好是三氯甲烷。
本發(fā)明用于滲漉的溫度可以是常溫，也可以在升溫下進(jìn)行以提高滲漉的效率。但是，浸提溫度應(yīng)低于浸提液中有機溶劑的沸點，以免有機物沸騰而影響滲漉效率。
本發(fā)明每一個滲漉段還可裝有攪拌裝置，以進(jìn)一步提高浸提液與紅豆杉枝葉的接觸表面，提高浸提率。
本發(fā)明紫杉烷類化合物的提取率是以7-β-木糖基紫杉醇為基準(zhǔn)測定的，其測試方法如下取10g樹粉以樹粉8倍重量的95％的乙醇多次超聲提取，每次2小時，直至提取液以HPLC法檢測不到7-β-木糖基紫杉醇的峰存在，將提取液合并，回收，定容于100mL容量瓶，以HPLC法測定7-β-木糖基紫杉醇含量(外標(biāo)法，參見《中華人民共和國藥典》2000年版二部附錄VD)，得到樹粉中7-β-木糖基紫杉醇的含量。另取相當(dāng)于10g樹粉的多級滲漉提取所得的滲漉液，按上述方法定容于100mL容量瓶，以HPLC法測定7-β-木糖基紫杉醇含量，與樹粉中的含量相比即得提取率。
本發(fā)明提取方法具有提取效率高(它可將紅豆杉枝葉中99％以上的紫杉烷類化合物提取至浸膏中)，提取時間短(提取時間比傳統(tǒng)浸提法縮短兩倍以上)，溶劑用量少(該法溶劑用量為傳統(tǒng)浸提法溶劑用量的十分之一～十六分之一)的優(yōu)點，從而降低了制造成本并且有助于環(huán)境保護(hù)。
在本發(fā)明的一個較好實例中，所述提取方法包括如下步驟1)將紅豆杉枝葉自然干燥至含水量為10重量％，粉碎成粒徑為1～2毫米的粉末；2)在10級連續(xù)滲漉提取段中用濃度為50％～100％的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液對紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到濃滲漉液；3)將所述濃滲漉液減壓蒸發(fā)至溶液中基本沒有甲醇、乙醇或丙酮后得到含水粗浸膏；4)向該含水粗浸膏中加入等體積水稀釋，以氯仿萃取該稀釋液；5)回收氯仿得浸膏，按紅豆枝葉的總重量計，紫杉烷類化合物提取率大于95重量％的浸膏得率為5～10重量％。
所述浸膏得率是將最終得到的干浸膏(紫杉烷類化合物提取率大于95重量％)的重量除以用于浸提經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉總重量計的。由于本發(fā)明采用連續(xù)滲漉提取法，因此，所述用于浸提的經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉總重量為連續(xù)滲漉浸提的級數(shù)(n)與每級中經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉裝填量(m)之積n×m。
本發(fā)明的另一方面涉及一種從所述浸膏中分離含7-β-木糖基紫杉醇的方法，該方法首先對所述浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以乙酸C1-C6烷酯洗脫，得到含7-β-木糖基紫杉醇的粗溶液。
本發(fā)明方法中使用的硅膠柱層析法無特別的限制，它可以是本領(lǐng)域常用的硅膠柱層析法。在本發(fā)明的一個較好實例中，所述硅膠柱層析法使用的硅膠購自山東芝罘硅膠廠。
用于洗脫7-β-木糖基紫杉醇的洗脫液為乙酸低級烷酯。在本發(fā)明中，術(shù)語“C1-C6烷基”是指C1-C6直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等。較好為乙酸C1-C4烷酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯和乙酸異丙酯，更好為乙酸乙酯。
在用乙酸C1-C6烷酯洗脫前，較好用1∶1的石油醚-乙酸乙酯或正己烷-乙酸乙酯混合液預(yù)先洗脫會影響洗脫7-β-木糖基紫杉醇的雜質(zhì)，以提高分離效率。
接著除去得到的7-β-木糖基紫杉醇粗溶液中的乙酸C1-C6烷酯，得到干浸膏。所述除去乙酸烷酯的方法無特別的限制，可以是本領(lǐng)域的任何方法，只要其對7-β-木糖基紫杉醇產(chǎn)品無不利影響即可。例如，它可以采用蒸發(fā)、噴霧干燥等方法。
隨后將干浸膏溶解在30-60％(v/v)的C1-C6脂肪醇水溶液中，隨后對其進(jìn)行大孔樹脂柱色譜分離，以90-98％(v/v)的C1-C6脂肪醇水溶液作為洗脫液，得到7-β-木糖基紫杉醇的醇溶液。
用于溶解所述干浸膏的低級脂肪醇溶劑的非限定性例子有下列醇的30-60％(v/v)的水溶液甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇等。較好為30-60％(v/v)的甲醇、乙醇或正丙醇的水溶液，最好為40％(v/v)甲醇或乙醇的水溶液或其混合物。
所述大孔樹脂柱色譜分離法是本領(lǐng)域常用的方法，包括AB-8、D101或ZTC-1大孔樹脂柱色譜分離。在大孔樹脂柱色譜分離時使用90-98％(v/v)的C1-C6脂肪醇，較好是95％甲醇或乙醇，作為洗脫液。所述C1-C6脂肪醇的非限定性例子有甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇等。
為了進(jìn)一步除去雜質(zhì)，在用90-98％(v/v)的C1-C6脂肪醇洗脫前先依次使用水和40％甲醇或乙醇洗脫2-5個柱體積，較好3個柱體積，以除去雜質(zhì)。
最后除去低級脂肪醇溶劑，得到7-β-木糖基紫杉醇產(chǎn)品。
為了提高制得產(chǎn)品的純度進(jìn)而提高分離效率，在進(jìn)行大孔樹脂柱色譜分離步驟前可任選地先對得到的干浸膏進(jìn)行一次沉淀分離，以除去雜質(zhì)。該步驟包括將干浸膏溶解在5-10倍，較好為7-9倍，最好為8倍量的無水C1-C6脂肪醇，較好無水乙醇或甲醇中，加水至C1-C6脂肪醇濃度達(dá)20～60％，優(yōu)選為30％，隨后將其在3-6℃(較好5℃)時放置2～10小時，優(yōu)選為6小時，析出沉淀，過濾。將得到的經(jīng)沉淀純化的干浸膏(即濾餅)如上所述用C1-C6脂肪醇-水(較好30-60％，最好40％的甲醇-水或乙醇-水)溶解，隨后進(jìn)行大孔色譜樹脂分離。
為了進(jìn)一步提高產(chǎn)品的純度以滿足不同的需求，還可任選地對得到的7-β-木糖基紫杉醇進(jìn)行進(jìn)一步純化。在本發(fā)明的一個較好實例中，所述純化包括將得到的產(chǎn)物溶解在50％甲醇-水或乙腈-水混合溶劑中，進(jìn)行反相中壓制備(它使用與上述硅膠柱層析相同的方法，但是以C18反相硅膠為柱層析填料，)，以40～80％甲醇-水或乙腈-水梯度加壓洗脫，228nm在線檢測，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，減壓回收溶劑。
經(jīng)色譜法測定，用本發(fā)明方法制得的7-β-木糖基紫杉醇的純度大于95％。
圖2是本發(fā)明一個較好實例中所述7-β-木糖基紫杉醇分離方法的流程圖。它包括對含紫杉烷類化合物的混合物的浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離；將得到的含7-β-木糖基紫杉醇餾份進(jìn)行干燥、溶劑處理、低溫放置后除去溶劑；得到的濾餅用大孔樹脂色譜法分離；除去得到的含7-β-木糖基紫杉醇餾份中的溶劑，用反相中壓柱色譜法進(jìn)一步分離，得到高純度7-β-木糖基紫杉醇。
下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實施例測試方法1.浸膏提取率本發(fā)明浸膏提取率是以7-β-木糖基紫杉醇為基準(zhǔn)測定的，其測試方法如下取10g樹粉以樹粉8倍重量的95％的乙醇多次超聲提取，每次2小時，直至提取液以HPLC法檢測不到7-β-木糖基紫杉醇的峰存在，將提取液合并，回收，定容于100mL容量瓶，以HPLC法測定7-β-木糖基紫杉醇含量(外標(biāo)法，參見《中華人民共和國藥典》2000年版二部附錄VD)，得到樹粉中7-β-木糖基紫杉醇的含量。另取相當(dāng)于10g樹粉的多級滲漉提取所得的滲漉液，按上述方法定容于100mL容量瓶，以HPLC法測定7-β-木糖基紫杉醇含量，與樹粉中的含量相比即得提取率。
2.7-β-木糖基紫杉醇純度的測定實施例中所用的高效液相色譜儀為日本島津公司生產(chǎn)的LC-10A泵和SPD-10A紫外檢測器，
以HPLC法測定7-β-木糖基紫杉醇的純度(外標(biāo)法，參見《中華人民共和國藥典》2000年版二部附錄VD)實施例1A.制備浸膏取1Kg經(jīng)自然干燥至含水量為10重量％的加拿大紅豆杉莖葉，粉碎成粒度為1～2毫米的粉末，另取十只250ml的滲漉桶，每只滲漉桶裝入50g樹粉，按圖1所示，以間歇的方式往第一只滲漉捅中加入100ml95％的乙醇溶液，滲漉液在流經(jīng)第一只滲漉捅后流入第二只滲漉桶，依次類推，第一只滲漉桶中不斷加入100ml95％的乙醇溶液，直至第十只滲漉桶滲漉完畢，收集第十只滲漉桶的滲漉液直至達(dá)到100ml，停止向第一只滲漉桶中加入滲漉液，改成往第二只滲漉桶中加入100ml95％的乙醇溶液，第一只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹粉作為新的最后一級滲漉段，即將第十只滲漉桶的第二次滲漉液加入第一只滲漉桶，再收集第一只滲漉桶的第一次滲漉液，達(dá)到100ml后，停止向第二只滲漉桶加入滲漉液，改成往第三只滲漉桶中加入100ml95％的乙醇溶液，第二只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹粉，依次類推。合并500g樹粉的濃滲漉液共計1000ml，減壓回收至無醇味，加水稀釋至約500ml，以100ml氯仿萃取三次，水相以HPLC檢測基本無紫杉醇和10-脫乙酰巴卡亭III的峰。減壓回收氯仿萃取液，得浸膏30g。
用上述方法測定浸膏中紫杉烷類化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為99％。該浸膏提取過程共耗時約8小時。
B.分離7-β-木糖基紫杉醇對30克步驟A所得浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，使用的硅膠購自山東芝罘硅膠廠，以1∶1的正己烷-乙酸乙酯洗脫1柱體積后，再以乙酸乙酯洗脫至HPLC無明顯7-β-木糖基紫杉醇峰，收集乙酸乙酯洗脫部分，回收溶劑得干浸膏。干浸膏以8倍量的無水乙醇溶解，加水至乙醇達(dá)30％，5℃時放置6小時，析出沉淀，過濾，沉淀以40％乙醇溶解，然后進(jìn)行AB-8大孔樹脂柱色譜(購自西格瑪公司的discoveryF5(4.6*250mm))，依次以水，40％乙醇，95％乙醇洗脫3個柱體積，收集95％乙醇洗脫部分，減壓回收溶劑至干，殘余物以50％甲醇-水溶解，進(jìn)行反相中壓制備(反相硅膠為日本富士的C-18(40～65μm)，色譜儀為上海匯興儀器廠生產(chǎn)的LC高壓恒流泵，檢測器為上海匯興儀器廠生產(chǎn)的紫外檢測器)，以40％甲醇-水梯度洗脫，228nm在線檢測，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，減壓回收溶劑，制得0.1g產(chǎn)品。用上述方法測定，產(chǎn)品的純度為95％。用NMR確認(rèn)其為7-β-木糖基紫杉醇。
1H-NMR(CDCl3)δ16～19CH31.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。
13C-NMR(CDCl3)δ(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’171.3，73.6，54.5；Ph138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O166.8，133.9，127.1，131.8。
比較例1將500g與上述實施例1相同的紅豆杉枝葉粉末置于一容器中，每次以8倍樹粉重量的乙醇浸提，提取四次，每次5小時，得到95％的乙醇溶液16000mL，提取時間為20小時。用與實施例1相同的方法將該乙醇溶液減壓回收至無醇味，加水稀釋至約500ml，以100ml氯仿萃取三次，水相以HPLC檢測基本無紫杉醇和10-脫乙酰巴卡亭III的峰。減壓回收氯仿萃取液，得浸膏30g。用上述方法測定浸膏中紫杉烷類化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為95％。
實施例2A.制備浸膏取10Kg經(jīng)自然干燥至含水量為5重量％的加拿大紅豆杉莖葉，粉碎成粒度為2-5毫米的粉末，另取八只2500ml的滲漉桶，每只滲漉桶裝入500g樹粉，按圖1所示，以連續(xù)的方式緩慢地往第一只滲漉捅中加入95％的甲醇溶液，滲漉液加入第二只滲漉桶，依次類推，每次收集的滲漉液的體積為500ml，用與實施例1相同的方法，但是使用氯甲烷代替氯仿進(jìn)行萃取，共得浸膏320g。
用上述方法測定浸膏中紫杉烷類化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為99％。
B.分離7-β-木糖基紫杉醇對30克步驟A所得浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，使用的硅膠購自山東芝罘硅膠廠，以1∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脫2柱體積后，再以乙酸乙酯洗脫至HPLC無明顯7-β-木糖基紫杉醇峰，收集乙酸乙酯洗脫部分，回收溶劑得干浸膏。將上面步驟所得浸膏以7倍量的甲醇溶解，加水至甲醇濃度達(dá)30％，5℃時放置6小時，析出沉淀，過濾，沉淀以50％甲醇溶解，然后進(jìn)行AB-8大孔樹脂柱色譜(西格瑪公司生產(chǎn)的discoveryF5(4.6*250mm))，依次以水，40％甲醇，98％甲醇洗脫3個柱體積，收集98％甲醇洗脫部分，減壓回收溶劑至干，殘余物以50％乙腈-水溶解，進(jìn)行反相中壓制備(反相硅膠為日本富士的C-18(40～65μm)，色譜儀為上海匯興儀器廠生產(chǎn)的LC高壓恒流泵，檢測器為上海匯興儀器廠生產(chǎn)的紫外檢測器)，以80％乙腈-水梯度洗脫，228nm在線檢測，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，減壓回收溶劑后得到1.2g產(chǎn)品。用色譜法分析產(chǎn)品純度為96％。NMR分析確認(rèn)其為7-β-木糖基紫杉醇。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’171.3，73.6，54.5；Ph138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O166.8，133.9，127.1，131.8。
實施例3A.制備浸膏取2000g經(jīng)自然干燥至含水量為10重量％的的加拿大紅豆杉莖葉，粉碎成粒度為0.5～2毫米的粉末，另取12只250ml的滲漉桶，每只滲漉桶裝入50g樹粉，按圖1所示，以間歇的方式往第一只滲漉捅中加入150ml70％的丙酮溶液，滲漉液在流經(jīng)第一只滲漉捅后流入第二只滲漉桶，依次類推，第一只滲漉桶中不斷加入150ml70％的丙酮溶液，直至第十二只滲漉桶滲漉完畢，收集第十二只滲漉桶的滲漉液直至達(dá)到150ml，然后往第二只滲漉桶中加入150ml70％的丙酮溶液，第一只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹粉，將第十二只滲漉桶的第二次滲漉液加入第一只滲漉桶，再收集第一只滲漉桶的第一次滲漉液，往第三只滲漉桶中加入150ml70％的丙酮溶液，第二只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹粉，依次類推。合并600g樹粉的濃滲漉液共計1800ml，減壓回收至氣相色譜無丙酮峰，加水稀釋至約500ml，以100ml 1，2-二氯乙烷萃取三次，水相以HPLC檢測基本無紫杉醇和7-β-木糖基紫杉醇的峰。減壓回收萃取液，得浸膏31.1g。
用上述方法測定浸膏中紫杉烷類化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為99％。。該浸膏提取過程共耗時約8小時。
B.分離7-β-木糖基紫杉醇對30克步驟A所得浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，使用的硅膠購自山東芝罘硅膠廠，以1∶1的正己烷-乙酸乙酯洗脫4個柱體積后，再以乙酸甲酯洗脫至HPLC無7-β-木糖基紫杉醇峰，收集乙酸甲酯洗脫部分，回收溶劑得11g干浸膏。干浸膏以10倍量的無水乙醇溶解，加水至乙醇達(dá)30％，3℃時放置6小時，析出沉淀，過濾，沉淀以30％丙醇溶解，然后進(jìn)行D101大孔樹脂柱色譜，依次以水，40％乙醇，95％丙醇洗脫3個柱體積，收集95％丙醇洗脫部分，減壓回收溶劑至干，殘余物以50％甲醇-水溶解，進(jìn)行反相中壓制備(反相硅膠為日本富士的C-18(40～65μm)，色譜儀為上海匯興儀器廠生產(chǎn)的LC高壓恒流泵，檢測器為上海匯興儀器廠生產(chǎn)的紫外檢測器)，以60％甲醇-水梯度洗脫，228nm在線檢測，收集7-β-木糖基紫杉醇部分，減壓回收溶劑，制得0.1g產(chǎn)品。用上述方法測定，產(chǎn)品的純度大于95％。用NMR確認(rèn)其為7-β-木糖基紫杉醇。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’171.3，73.6，54.5；Ph138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O166.8，133.9，127.1，131.8。
實施例4A.制備浸膏用與實施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用90％乙醚作為浸提液，使用1，1-二氯乙烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為98.5％。該浸膏提取過程共耗時約8.5小時。
B.分離7-β-木糖基紫杉醇用與實施例1相同方法分離7-β-木糖基紫杉醇，制得0.11g產(chǎn)品，產(chǎn)品的純度為95.2％。用NMR確認(rèn)其為7-β-木糖基紫杉醇。
1H-NMR(CDCl3)δ16～19CH31.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。
13C-NMR(CDCl3)δ(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’171.3，73.6，54.5；Ph138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O166.8，133.9，127.1，131.8。
實施例5A.制備浸膏用與實施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用乙酸乙酯作為浸提液，使用二氯甲烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為98.0％。該浸膏提取過程共耗時約9小時。
B.分離7-β-木糖基紫杉醇用與實施例1相同方法分離7-β-木糖基紫杉醇，制得0.11g產(chǎn)品，產(chǎn)品的純度為95.2％。用NMR確認(rèn)其為7-β-木糖基紫杉醇。
1H-NMR(CDCl3)δ16～19CH31.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。
13C-NMR(CDCl3)δ(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’171.3，73.6，54.5；Ph138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O166.8，133.9，127.1，131.8。
實施例6A.制備浸膏用與實施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用98％甲基乙基醚水溶液作為浸提液，使用氯乙烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為98.0％。該浸膏提取過程共耗時約9小時。
B.分離7-β-木糖基紫杉醇用與實施例1相同方法分離7-β-木糖基紫杉醇，制得0.11g產(chǎn)品，產(chǎn)品的純度為95.2％。用NMR確認(rèn)其為7-β-木糖基紫杉醇。
1H-NMR(CDCl3)δ16～19CH31.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。
13C-NMR(CDCl3)δ(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xy1(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’1713，73.6，54.5；Ph138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O166.8，133.9，127.1，131.8。
實施例7A.制備浸膏用與實施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用98％甲乙酮作為浸提液，使用1，1-二氯乙烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類化合物的提取率為98.5％。該浸膏提取過程共耗時約8.5小時。
B.分離7-β-木糖基紫杉醇用與實施例1相同方法分離7-β-木糖基紫杉醇，制得0.11g產(chǎn)品，產(chǎn)品的純度為95.2％。用NMR確認(rèn)其為7-β-木糖基紫杉醇。
1H-NMR(CDCl3)δ16～19CH31.6(3H，S)，1.2(3H，S)，1.7(3H，S)，1.8(3H，S)；Xyl(1～5)4.7(1H，d，J＝7.5Hz)，3.7(1H，dd，J＝7.5，8.7Hz)，3.9(1H，t)，4.0(1H，m)，4.1(1H，dd，J＝5.1，11.3Hz)，3.5(1H，dd，J＝10.1，11.3Hz)。
13C-NMR(CDCl3)δ(1～20)78.3，73.2，46.8，82.9，84.0，37.8，82.6，57.3，210.9，76.3，135.3，138.3，76.8，35.7，43.1，22.3，28.3，14.9，12.7，76.7；Xyl(1～5)100.6，72.3，74.3，70.4，62.0；OBzC＝O166.7，129.2，130.1，128.7，133.8，1’～3’171.3，73.6，54.5；Ph138.4，127.3，128.7，128.1；NBzC＝O166.8，133.9，127.1，131.8。
由上面描述可見，以實施例1和比較例1為例，用本發(fā)明方法提取500g樹粉約需1000mL95％的乙醇，提取時間約需8小時；如果按傳統(tǒng)浸提法操作，則需95％的乙醇16000mL，提取時間為20小時。即其溶劑用量為本發(fā)明方法的16倍。因此，與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明方法可顯著提高浸提效率，減少溶劑用量，有助于降低成本并減輕對環(huán)境的壓力。
權(quán)利要求
1.一種紫杉烷類化合物的提取方法，它包括(1)用多級連續(xù)滲漉提取法用有機浸提液對紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到含紫杉烷類化合物的有機浸提溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于它還包括(2)除去所述有機浸提溶液中的有機溶劑，得到水性浸提液；(3)用極性有機溶劑對所述水性浸提液進(jìn)行萃取，得到有機萃取液；(4)除去萃取液中的有機溶劑，得到含所述紫杉烷類化合物的浸膏。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有機浸提液選自C1-4脂肪醇或其50-100％水溶液；丙酮或其50-100％水溶液、甲乙酮或其50-100％水溶液、乙醚或其50-100％水溶液、甲基乙基醚或其50-100％水溶液、乙酸C1-4烷酯。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于用于萃取的有機極性溶劑選自氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氯乙烷，1，1-二氯乙烷或1，2-二氯乙烷。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述多級連續(xù)滲漉提取法為4-15級，所述有機浸提液為50-100％乙醇，并且所述用于萃取的有機極性溶劑為三氯甲烷。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于紅豆枝葉原料平均放置在各個滲漉段，當(dāng)流經(jīng)最后一級滲漉段而收集得到的浸提液以毫升為單位的體積達(dá)到每一個滲漉段所含紅豆杉枝葉以克為單位的重量的1-3倍，較好為2倍時，停止向第一級滲漉段加入提取液，并在最后一級再增加一個滲漉段，隨后向第二級滲漉段加入提取液。
7.一種從紅豆杉中提取7-β-木糖基紫杉醇的方法，它包括如下步驟(1)用權(quán)利要求1-6中任何一項所述方法制得含紫杉烷類化合物的浸膏；(2)對所述浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以乙酸C1-C6烷酯洗脫，得到含7-β-木糖基紫杉醇的粗溶液；(3)除去所述粗溶液中的乙酸低級烷酯，得到干浸膏；(4)將干浸膏溶解在C1-C6脂肪醇溶劑中，隨后對其進(jìn)行大孔樹脂柱色譜分離，以C1-C6脂肪醇作為洗脫液，得到7-β-木糖基紫杉醇的醇溶液；(5)除去低級脂肪醇溶劑，得到7-β-木糖基紫杉醇。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述乙酸C1-C6烷酯選自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸異丙酯；所述用于溶解干浸膏的C1-C6脂肪醇溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇的水溶液；在大孔樹脂柱色譜分離中作為洗脫液的C1-C6脂肪醇選自95％甲醇或乙醇。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于在進(jìn)行大孔樹脂柱色譜分離步驟前它還包括將所述干浸膏溶解在5-10倍的無水乙醇或甲醇中，加水至乙醇或甲醇濃度達(dá)20～60％，隨后將其在3-6℃時放置2～10小時，析出沉淀，過濾，得到經(jīng)沉淀純化的干浸膏。
10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于它還包括將得到的產(chǎn)物溶解在50％甲醇-水或乙腈-水混合溶劑中，進(jìn)行反相中壓制備，以40～80％甲醇-水或乙腈-水梯度洗脫，228nm在線檢測，收集7-β-木糖基紫杉醇部分的步驟。
全文摘要
公開了一種紫杉烷類化合物的提取方法，它包括(1)用多級連續(xù)滲漉提取法用有機浸提液對紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到含紫杉烷類化合物的有機浸提溶液；(2)除去所述有機浸提溶液中的有機溶劑，得到水性浸提液；(3)用極性有機溶劑對所述水性浸提液進(jìn)行萃取，得到有機萃取液；(4)除去萃取液中的有機溶劑，得到含所述紫杉烷類化合物的浸膏。還公開了由所述紫杉烷類化合物提取7－β－木糖基紫杉醇的方法。
文檔編號C07H17/04GK1613863SQ200410053870
公開日2005年5月11日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者徐從立, 許付, 周長江, 黃先進(jìn) 申請人:魏紅