專利名稱：紫杉烷類化合物的分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從遍布于加拿大東部省份的加拿大紫杉(Taxus canadensis)粗提物中分離和生產(chǎn)紫杉烷類化合物的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)率色譜分離基本上純的紫杉醇(Paclitaxel)、三尖杉寧堿(cephalomannine)、和13-乙酰基-9-二氫-漿果赤霉素III(漿果赤霉素III(baccatin III))的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇是一種用于轉(zhuǎn)移性癌癥化學(xué)治療的重要活性藥物成分。紫杉醇抗腫瘤活性在于其對(duì)于有絲分裂的干擾作用。紫杉醇已被美國(guó)聯(lián)邦藥品管理局(FDA)和加拿大衛(wèi)生部門的健康保護(hù)分局批準(zhǔn)用于卵巢癌的治療。目前正在進(jìn)行的對(duì)治療其它諸如乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等癌癥的臨床試驗(yàn)的結(jié)果也是大有希望的。
紫杉醇是最初從太平洋紫杉樹紅豆杉(Taxus brevifolia)的樹皮中分離得到的一種天然產(chǎn)物，在包括加拿大紫杉(Taxus canadensis)的許多其它品種的紫杉樹種的樹皮、針葉和樹枝中，也發(fā)現(xiàn)含有紫杉醇。在各種植物原料中，紫杉醇的含量通常很低，小于0.1％，這使得從天然原料中分離紫杉醇的工藝變得非常復(fù)雜和困難。
相關(guān)
背景技術(shù)：
在Eisohly等人提出的加拿大專利申請(qǐng)No.2,108,265和Nair等人提出的加拿大專利申請(qǐng)No.2,126,698中，都公開了使用色譜方法分離紫杉醇和相關(guān)的紫杉烷類化合物的方法。然而，上述方法都只能用于分析級(jí)或?qū)嶒?yàn)室級(jí)的制備高效液相色譜(HPLC)，其成本高產(chǎn)量低。因此也就根本無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)。
其它的一些用于紫杉烷類化合物的分離制備方法還包括多步沉淀法、臨界萃取或近臨界萃取法、化學(xué)修飾法和反相色譜法。
在Zamir和Caron的加拿大專利No.2,213,952的所公開的多步沉淀法中，將紫杉烷類化合物溶解在極性有機(jī)溶劑中，然后逐步加入非極性有機(jī)溶劑進(jìn)行沉降。這種方法需要消耗大量的非極性有機(jī)溶劑，且難以回收，以致生產(chǎn)成本太高。
在Castor提出的加拿大專利申請(qǐng)No.2,158,050中，將臨界和近臨界萃取法用于紫杉烷類化合物的分離。但是，該方法需要使用昂貴的生產(chǎn)設(shè)備。
為提高紫杉醇類化合物的產(chǎn)率，Pandey和Yankov在其提出的加拿大專利申請(qǐng)No.2,210,972中公開了將化學(xué)修飾法用于紫杉醇和三尖杉寧堿的分離。三尖杉寧堿是紫杉醇的類似物，在其側(cè)鏈上有一雙鍵。在該方法中，通過化學(xué)方法將三尖杉寧堿不可逆地轉(zhuǎn)化成其溴衍生物。為了保證其反應(yīng)的選擇性，反應(yīng)必須在避光條件下進(jìn)行，但這樣又存在著破壞紫杉醇的可能。此外，化學(xué)修飾法中，色譜分離仍然是其必要步驟，化學(xué)修飾法就使得分離過程的成本和勞力消耗更高。
改進(jìn)色譜固定相的方法包括Rao在其提出的加拿大專利申請(qǐng)No.2,094,910中所述的烴包覆二氧化硅，以及Liu在其提出的加拿大專利申請(qǐng)No.2,258,066中所述的聚苯乙烯型樹脂。這些基于反相HPLC的方法在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模是有效的，但由于固定相成本較高及其低生產(chǎn)力，特別地，它還存在著嚴(yán)重的柱上吸附污染，因而也不能用于商業(yè)目的的大規(guī)模生產(chǎn)。
Liu在其提出的加拿大專利申請(qǐng)No.2,203,844中公開了一種用干柱色譜法分離紫杉烷類化合物的方法。該方法包括至少一種紫杉的粗提物的制備，其中粗提物是通過含水乙醇溶劑萃取得到的。后續(xù)的分離過程需要冗長(zhǎng)的初級(jí)溶劑分配過程，其中包括使用大量的揮發(fā)性有機(jī)溶劑。由于在該方法中，各步所使用的溶劑不能被容易地回收用于隨后的分離，這樣大大地增加了生產(chǎn)的成本。
因此，現(xiàn)有技術(shù)中從原料或粗提物中分離和純化紫杉醇的方法都是有限的或者具有著工藝復(fù)雜、成本高和規(guī)模小等特性。因此需要開發(fā)一種比現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低和更有效的方法來分離純化有價(jià)值的化學(xué)治療化合物紫杉醇和相關(guān)的紫杉烷類化合物。
因此也就需要提供一種成本低效率高的用于生產(chǎn)基本上純的紫杉烷類化合物的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種從包含紫杉烷類化合物的混合物的粗提取物中分離純化紫杉醇的方法，該紫杉烷類化合物包括紫杉醇、三尖杉寧堿、和漿果赤霉素III。該方法包括在廉價(jià)的硅膠柱上對(duì)粗提物樣品進(jìn)行快速色譜分離，進(jìn)而得到精制濃縮的紫杉烷類化合物的混合物。然后對(duì)得到的混合物提供一系列的后續(xù)步驟進(jìn)行分離，該后續(xù)步驟選自在乙醇中結(jié)晶、用極性溶劑沉淀、以及在特定的二元溶劑體系中對(duì)紫杉醇和三尖杉寧堿精制分離。該方法不需進(jìn)行化學(xué)修飾而達(dá)到對(duì)紫杉烷類化合物的完全分離。
并且，所有使用的溶劑混合物可不經(jīng)分離，直接回收循環(huán)使用，這就大大降低了純的紫杉烷化合物的生產(chǎn)成本。在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于溶劑廢液的處理會(huì)消耗大量的成本，而本發(fā)明的方法則大大地降低了這方面的開銷。
更具體地，本發(fā)明提供了一種從天然加拿大紫杉的粗提物中分離得到高純度紫杉烷類化合物的改進(jìn)方法，該方法包括以下步驟a)使用液相柱色譜過濾粗提物；b)通過沉淀和結(jié)晶的方法富集步驟a)中所得到的紫杉烷類化合物；c)對(duì)步驟a)中所得到的紫杉烷類化合物進(jìn)行液相柱色譜分離；d)將分離的紫杉烷類化合物溶解于含有醇和非醇溶劑的極性有機(jī)溶劑混合物中，然后將上述溶液進(jìn)一步通過液相柱色譜分離，將基本上純的紫杉醇與三尖杉寧堿分離，并且所使用的所有溶劑混合物可被回收、純化以及不經(jīng)分離直接循環(huán)使用。
發(fā)明詳述附圖的簡(jiǎn)要說明在用以圖解說明本發(fā)明內(nèi)容的附圖中

圖1到3是本發(fā)明所述方法的詳細(xì)流程圖。
圖1到3所示的方法的流程圖提供了本發(fā)明方法的實(shí)施例。
本發(fā)明的方法開始于植物原料，如遍布于東加拿大的加拿大紫杉的樹皮、針葉和樹枝的粗提取物。優(yōu)選2至3年生紫杉樹的嫩樹皮或其新生樹枝、針葉為原料。在加拿大的魁北克北部的Maritime省，這些植物通常高達(dá)4英尺。通過HPLC(高效液相色譜)分析可知，在這些粗提物中紫杉醇的含量約為0.6％(w/w)。其它品種紫杉的提取過程也是基本相似的。下面將描述一種從加拿大紫杉制得其粗提物的典型方法。首先將加拿大紫杉的干燥的植物原料充分粉碎(通過常規(guī)方法)，然后在室溫和機(jī)械攪拌下，使用甲醇萃取4小時(shí)[流程圖中為50-60℃下攪拌6小時(shí)，重復(fù)2次]。過濾混合物，然后使用工業(yè)蒸發(fā)設(shè)備(蒸餾器)將濾液真空濃縮至原來體積的5％，得到粗提物。其它來源的粗提物也可使用，只要它們是從加拿大紫杉中獲取得的即可。必須指出的是，這些生長(zhǎng)在加拿大的紫杉在墨西哥、中國(guó)和美國(guó)也有。
將通過上述方法得到的粗提物溶解在極性有機(jī)溶劑中，優(yōu)選乙酸乙酯或乙酸乙酯-己烷(1∶1)。應(yīng)當(dāng)避免直接將粗提物上樣到色譜柱中，因?yàn)槠涓哒承詫?dǎo)致色譜柱的堵塞。工業(yè)玻璃色譜柱(15cm×100cm)的一端使用玻璃絨填充封閉并且將柱體垂直放置?？赏ㄟ^干粉或濕漿的形式填裝硅膠粉(1×250目)固定相，填充高度至多為柱高的70-80％。只要所使用的硅膠是新鮮或干凈的，使用干法和濕法裝柱都是可以接受的。色譜柱的高度并非關(guān)鍵，但是硅膠粉的粒徑必須保證通過該柱的流動(dòng)良好。然后將均勻的紫杉醇粗提物的溶液裝柱。推薦的粗提物溶液體積和總的裝柱體積的體積比為1∶4-1∶6，優(yōu)選較高的比例。盡管在柱的直徑和柱高比為1∶6時(shí)可達(dá)到最佳的分離效果，但使用更大的1∶4的比例將更有利于增加上樣量。這將能夠在預(yù)分離中最大限度利用該柱。在粗提物溶液被裝柱后，對(duì)色譜柱溫和地加壓，以使得溶液能完全地裝載在硅膠層的頂部。然后洗脫該柱。也可在柱中使用相似粒徑的氧化鋁作為固定相，或?qū)⑵渥鳛椴糠只蛉抗潭ㄏ唷?br> 在25±5psi壓力下，使用乙酸乙酯-己烷(1∶1，v/v)混合物洗脫該柱。該混合物的其它優(yōu)選比例也可以為7∶3至5∶5，更優(yōu)選6∶4。如果有穩(wěn)定連續(xù)的溶劑泵送系統(tǒng)，也可以使用梯度洗脫。在這種情況下，乙酸乙酯-己烷的體積比可從2∶8開始到8∶2結(jié)束。但梯度洗脫不建議用于不穩(wěn)定的間斷的泵送操作，因?yàn)橛捎谕衔渤煞謺?huì)降低分離效果。柱過濾操作在100-150mL/min的流速進(jìn)行?？墒褂帽右合嗌VTLC或高效液相色譜HPLC對(duì)洗脫物進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析，并對(duì)含有紫杉烷類化合物的部分分別收集。對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的操作人員來說，也可直接通過玻璃柱上的色譜帶來監(jiān)測(cè)紫杉烷部分。通過TLC檢測(cè)確定含有紫杉烷類化合物的部分被完全洗脫后，停止洗脫。收集到的洗脫部分可在50±5℃和25±10mmHg的真空下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，當(dāng)高溫時(shí)(如＞60℃)，將會(huì)引發(fā)紫杉烷類化合物的副反應(yīng)。濃縮后的部分含約10％的紫杉醇。根據(jù)粗提物中紫杉烷類化合物的濃度可以對(duì)柱過濾過程重復(fù)一次。一般來講，二次柱過濾后，紫杉醇的含量可富集到30％左右。
當(dāng)通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)基本上除去所有溶劑后，將富集后的殘留物溶解于醇溶劑(甲醇或乙醇)中，其量為原體積的3-5倍。將所得溶液靜置過夜，9-二氫-13-乙?；?漿果赤霉素III作為結(jié)晶沉淀，將其從醇溶液中濾出。9-二氫-13-乙?；?漿果赤霉素III晶體的純度約為90％，可以容易地通過重結(jié)晶將其進(jìn)一步純化。
向紫杉烷化合物的醇溶液中滴加相當(dāng)于原有體積約40％的去離子水或蒸餾水。并且優(yōu)選在機(jī)械攪拌或磁力攪拌條件下進(jìn)行操作。將所得溶液靜置過夜。將所得到的沉淀過濾并用乙酸乙酯-己烷(1∶2 v/v)混合物洗滌。通過HPLC分析可知該固體基本上是含有紫杉醇(～70％)、三尖杉寧堿(～25％)和少量的其它紫杉烷類化合物(5％)的混合物。
如前所述，為了分離紫杉醇和三尖杉寧堿，傳統(tǒng)方法使用化學(xué)修飾法。在本發(fā)明方法中，將該固體混合物溶解于極性有機(jī)溶劑中，如二氯甲烷，然后將其載于硅膠柱(100cm×10cm)中。上樣體積與柱體積的比最好為1∶10至1∶20。使用醇溶劑和極性有機(jī)溶劑的混合物進(jìn)行洗脫。該特定的二元溶劑系統(tǒng)由醇溶劑(選自甲醇、乙醇或異丙醇)和非醇溶劑(選自氯仿、二氯甲烷、二甲苯或甲苯)構(gòu)成。例如，甲醇(5％)和二氯甲烷(95％)的混合物是合適的。可使用TLC或HPLC對(duì)洗脫物進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析。并對(duì)含有紫杉醇和三尖杉寧堿的部分分別收集。由于使用了合適的二元溶劑系統(tǒng)，可以簡(jiǎn)單直接地達(dá)到分離。收集到的紫杉烷類化合物部分在丙酮-己烷(4∶6)溶劑混合物中重結(jié)晶進(jìn)一步純化以得到純的化合物。所得的結(jié)晶在50℃下在真空下、在爐中干燥過夜。經(jīng)HPLC分析可知，所得紫杉醇的純度為～100％，三尖杉寧堿的純度～99％。
很明顯，所使用的溶劑混合物可在回收后直接循環(huán)使用，而無需將其分離為單獨(dú)的溶劑，本發(fā)明方法之所以可行的一方面的原因是因?yàn)槭褂昧硕軇┗旌衔铩?br> 以下實(shí)施例可進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明容。根據(jù)實(shí)施例的指引，該方法可容易地放大以用于商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。
實(shí)施例所有使用的化學(xué)品均為市售，并且在使用前經(jīng)分析檢測(cè)。所有玻璃色譜柱和硅膠均從中國(guó)遠(yuǎn)東醫(yī)藥儀器有限公司購(gòu)得，工業(yè)溶劑從加拿大的Stanchen公司購(gòu)得，HPLC所使用的標(biāo)準(zhǔn)品，如紫杉醇、三尖杉寧堿、9-二氫-13-乙?；?漿果赤霉素III從美國(guó)Hauser公司購(gòu)得，熒光硅膠TLC薄板從美國(guó)Waters公司購(gòu)得，Dionex 500型HPLC系統(tǒng)被用于分析本發(fā)明方法中的各成分。
將源自加拿大紫杉針葉的粗提物(0.5kg)溶解于4L乙酸乙酯中。將該溶液裝載于工業(yè)級(jí)玻璃色譜柱(15cm×100cm)中，柱中此前已填裝了約70％柱高的硅膠粉(1×250目)。在25±5psi壓力下，使用乙酸乙酯-己烷(1∶1，v/v)進(jìn)行洗脫。流速控制在約100-150mL/min。
利用TLC監(jiān)測(cè)并將含有紫杉烷化合物的部分合并，其總體積共15升。將其真空(50±5℃，15～25mmHg)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，所得殘留物為第一次分離物，將其再次溶解在乙酸乙酯中，然后對(duì)其進(jìn)行第二次色譜分離，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。將所得的富集后的紫杉烷類化合物殘留物溶解在甲醇(200mL)，在室溫下靜置過夜，得到13-乙?；?9-二氫-漿果赤霉素III晶體(15g)。
劇烈攪拌下向紫杉烷類化合物的甲醇溶液中加入蒸餾水(～40％體積)。將溶液在室溫下靜置過夜。過濾所形成的沉淀(5g，～70％紫杉醇、～25％三尖杉寧堿、～5％雜質(zhì))。
將所得的紫杉烷化合物的混合物溶于50mL的二氯甲烷中，然后將其置于硅膠柱(10cm×100cm)中，使用含甲醇(5％)和二氯甲烷的混合物洗脫。洗脫物使用TLC或HPLC分析。含有紫杉醇和三尖杉寧堿的部分被分別收集。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后，將分離出的紫杉醇和三尖杉寧堿用純的丙酮-己烷(4∶6v/v)混合物進(jìn)一步重結(jié)晶，得到白色針狀結(jié)晶的紫杉醇(3g，～100％)和三尖杉寧堿(1g，～99％)。
對(duì)本發(fā)明所述的內(nèi)容可進(jìn)行各種改變對(duì)任何一個(gè)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員都是顯而易見的，并且所有顯而易見的等同物和類似物均落入本申請(qǐng)說明書和權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。說明書僅用于解釋權(quán)利要求而不是對(duì)其限制。
權(quán)利要求
1.一種從天然加拿大紫杉的粗提取物中分離高純度紫杉烷類化合物的改進(jìn)方法，該方法包括以下步驟a)使用液相柱色譜過濾該粗提物；b)通過沉淀和結(jié)晶的方法富集步驟a)中所得到的紫杉烷類化合物；c)對(duì)步驟a)中所得到的紫杉烷類化合物進(jìn)行液相柱色譜分離；和d)將分離的紫杉烷類化合物溶解于含有醇和非醇溶劑的極性有機(jī)溶劑混合物中，然后將該溶液通過液相柱色譜進(jìn)一步分離，將基本上純的紫杉醇與三尖杉寧堿分離；并且所使用的所有溶劑混合物可被回收、純化以及不經(jīng)分離直接循環(huán)使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)粗提物的過濾(a)至少經(jīng)過一次柱分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的柱分離是在約25±5psi壓力下，約100-約150ml/min流速條件下進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的柱分離還包括如下步驟將粗提物加至已填裝好的色譜柱中，將該柱用有機(jī)溶劑洗脫，收集含有紫杉烷類化合物的部分并濃縮該部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的色譜柱為工業(yè)級(jí)玻璃柱(15cm×100cm)，其內(nèi)部填裝1×250目的干硅膠微粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯和己烷以約5∶5至約7∶3體積比的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的含有紫杉烷類化合物的部分的濃縮是通過低于約50℃的溫度、減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的沉淀和結(jié)晶(b)還包括以下步驟配備紫杉烷類化合物的醇溶液，向該紫杉烷類化合物的醇溶液中加入極性溶劑，將該溶液靜置過夜，過濾沉淀，洗滌所得結(jié)晶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述紫杉烷類化合物的醇溶液是甲醇或乙醇溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的極性溶劑為去離子水或蒸餾水。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述結(jié)晶的洗滌使用乙酸乙酯-己烷(1∶2)來進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述對(duì)紫杉烷類化合物的分離(c)還包括以下步驟將洗滌后的結(jié)晶的溶液加至色譜柱中，使用二元有機(jī)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，分別收集含有紫杉醇、三尖杉寧堿、13-乙?；?9-二氫-漿果赤霉素III的部分，濃縮這些部分，對(duì)該紫杉烷類化合物重結(jié)晶，干燥該晶體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的色譜柱為工業(yè)級(jí)玻璃柱(10cm×100cm)，其內(nèi)部填裝1×250目的干硅膠微粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述二元有機(jī)溶劑系統(tǒng)由醇溶劑和非醇溶劑組成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的二元有機(jī)溶劑體系中醇與非醇溶劑的體積比為約2∶98至約10∶90。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的醇溶劑為選自甲醇、乙醇和異丙醇的有機(jī)溶劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述的非醇溶劑是選自氯仿、二氯甲烷、甲苯和二甲苯的有機(jī)溶劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述對(duì)各部分的濃縮在低于約50℃溫度下、約25mmHg減壓下、使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述紫杉烷類化合物的重結(jié)晶在體積比約為2∶3的丙酮-己烷混合物中進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述對(duì)晶體的干燥是在約50℃溫度下和約10cmHg壓力下在真空爐中進(jìn)行的。
全文摘要
一種從天然加拿大紫杉(Taxus canadensis)粗提物中分離高純度紫杉烷類化合物的改進(jìn)方法，該方法包括以下步驟a)使用液相柱色譜過濾粗提物；b)通過沉淀和結(jié)晶的方法富集步驟a)中所得到的紫杉烷類化合物；c)對(duì)步驟a)中所得到的紫杉烷類化合物進(jìn)行液相柱色譜分離；以及d)將分離的紫杉烷類化合物溶解于含有醇和非醇溶劑的極性有機(jī)溶劑混合物中，然后將該溶液進(jìn)一步通過液相柱色譜分離，將基本上純的紫杉醇與三尖杉寧堿分離，并且所使用的所有溶劑混合物可被回收、純化以及不經(jīng)分離直接循環(huán)使用。
文檔編號(hào)C07D305/14GK1486306SQ01821917
公開日2004年3月31日 申請(qǐng)日期2001年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月13日
發(fā)明者拉胡·塞吉, 拉胡 塞吉 申請(qǐng)人:拉胡·塞吉, 拉胡 塞吉