專利名稱：抗腫瘤活性成份多棘酸酯、制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一個(gè)從中國南海軟珊瑚中分離得到的甾醇類化合物多棘酸酯和它們的制備方法及用途。該化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株具有強(qiáng)烈的抑制作用，可作為一類研制新的抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，也可能作為治療各種臨床常見多發(fā)癌癥的藥物。
背景技術(shù)：
軟珊瑚屬腔腸動(dòng)物門珊瑚綱八放珊瑚亞綱軟珊瑚亞目動(dòng)物，過去把珊瑚蟲綱體軟的動(dòng)物統(tǒng)稱為軟珊瑚。軟珊瑚亞目又分6個(gè)科，即Paralcyoniidae，Alcyoniidae，Asterospiculariidae，Nephtheidae，Nidalii-dae和Xeniidae。軟珊瑚富含二萜、倍半萜、多羥基甾醇和前列腺素等多種類型的化合物。
軟珊瑚廣泛分布在我國南海，目前關(guān)于軟珊瑚Spongodes sp.化學(xué)成份的研究很少，主要分離得到是神經(jīng)酰胺和鯊肝醇類化合物。
多棘酸酯(Methyl Spongoate)是首次從我國南海Nephtheidae科軟珊瑚Spongodes sp.中提取分離出來的。目前未見此類化合物的類似物結(jié)構(gòu)及活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從軟珊瑚中提取分離一個(gè)21位甲基氧化成羧酸的甾體化合物；本發(fā)明的另一目的是提供該種軟珊瑚中提取分離21位甲基氧化成羧酸的甾體化合物的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供上述21位甲基氧化成羧酸的甾體化合物的用途。
本發(fā)明的21位甲基氧化成羧酸的甾體化合物具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)
該化合物系首次從我國海南軟珊瑚中提取得到，故命名為多棘酸酯。
本發(fā)明還提供了從軟珊瑚Spongodes sp.中提取分離多棘酸脂的方法，其步驟如下將我國南海軟珊瑚冰凍新鮮樣品剪碎后，用分析純丙酮超聲波提取數(shù)次，合并提取液減壓濃縮至無有機(jī)溶劑，得粗浸膏。用水溶解粗浸膏，然后用乙醚萃取數(shù)次，合并乙醚萃取液減壓濃縮得到乙醚浸膏，該浸膏經(jīng)硅膠柱層析，流動(dòng)相用石油醚/乙醚(99∶1，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50)梯度洗脫，石油醚/乙醚8∶2洗脫部分經(jīng)凝膠LH-20柱層析，以石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1洗脫，得到純化合物多棘酸酯。
多棘酸酯的理化性狀如下白色粉末，[α]D25+63°(c 0.34，CHCl3)；IRνmax(KBr)cm-12933，1729，1687，1153，775；LREIMS，m/z428(M+)，386，307，271，225；HREIMS m/z428.3295(calcd.for C28H44O3，Δ0.5mmu)；UVλmax(MeOH)228.5(ε12412)；1H-NMR(CHCl3，400MHz)7.11(d，J＝10.3，H-1)，5.84(d，J＝8.3，H-2)，2.36(dd，J＝17.8，14.3，H-4)，3.65(s，OCH3)2.20(dd，J＝17.8，4.0，H-4)，0.72(s，H-18)，0.98(s，H-19)，0.84(d，6.7，H-26)，0.83(d，6.7，H-27)；13C-NMR(CHCl3，100MHz)158.4(d，C-1)，127.4(d，C-2)，200.1(s，C-3)，41.0(t，C-4)，44.3(d，C-5)，27.1(t，C-6)，31.2(t，C-7)，35.7(d，C-8)，50.0(d，C-9)，38.9(s，C-10)，21.1(t，C-11)，37.3(t，C-12)，42.3(s，C-13)，55.7(d，C-14)，23.6(t，C-15)，27.6(t，C-16)，52.7(d，C-17)，12.3(q，C-18)，13.0(q，C-19)，47.4(d，C-20)，176.7(s，C-21)，32.2(t，C-22)，38.8(t，C-23)，25.1(t，C-24)，27.8(d，C-25)，22.3(q，C-26)，22.7(q，C-27)，50.9(q，OCH3)。同時(shí)，通過測定二維H-H相關(guān)譜(1H-1H COSY)，H-C相關(guān)譜和H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)，確定了所有碳原子和氫原子的信號(hào)歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明對(duì)化合物多棘酸酯進(jìn)行了抗腫瘤活性測試，表明具有明顯的抗腫瘤作用。
測試原理MTT法(Cancer Research 1988 Sep 1；48(17)4827-33.)按不同腫瘤生成速率，將一定數(shù)量處于對(duì)表數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞90μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)后加入藥液10μl/孔，對(duì)每個(gè)細(xì)胞株，每個(gè)濃度均為三個(gè)復(fù)孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理鹽水配制20μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，加入三聯(lián)液(10％SDS-5％異丁醇-0.01mol/LHCL)50μl/孔，于C～O2培養(yǎng)箱中過夜。然后在570nm用酶標(biāo)儀測定OD值。
觀測指標(biāo)按下列公式計(jì)算被測物對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制率，半數(shù)抑制量IC50值采用Logit法計(jì)算。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)判與解析對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的IC50(μM)BEL-7402 HL-60 HELA多棘酸酯0.14 2.00 4.具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
1H-NMR用Varian Inova 600型儀測定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Finnigan-MAT-95型儀測定；所使用的硅膠，為青島海洋化工廠生產(chǎn)，葡聚糖凝膠為Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden產(chǎn)品，洗脫劑為石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1實(shí)施例一多棘酸酯的制備(1).提取中國南海軟珊瑚Spongodes sp.(干重456克)用丙酮反復(fù)超聲提取3次，提取液合并后減壓濃縮，所得粗浸膏用水溶解成水懸液，用乙醚萃取數(shù)次至乙醚層無色，合并萃取液減壓濃縮得到乙醚部分4.5克。
(2).分離乙醚部分4.5克以200-300目硅膠柱層析，石油醚/乙醚(99∶1，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50)梯度洗脫，石油醚/乙醚8∶2洗脫部分經(jīng)凝膠LH-20柱層析，以石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1洗脫，得到多棘酸酯(6.8mg，0.0149％wet weight)。多棘酸酯的理化性狀如下白色粉末，[α]D25+63°(c 0.34，CHCl3)；IRνmax(KBr)cm-12933，1729，1687，1153，775；LREIMS，m/z428(M+)，386，307，271，225；HREIMS m/z428.3295(calcd.for C28H44O3，Δ0.5mmu)；UVλmax(MeOH)228.5(ε12412)；1H-NMR(CHCl3，400MHz)7.11(d，J＝10.3，H-1)，5.84(d，J＝8.3，H-2)，2.36(dd，J＝17.8，14.3，H-4)，3.65(s，OCH3)2.20(dd，J＝17.8，4.0，H-4)，0.72(s，H-18)，0.98(s，H-19)，0.84(d，6.7，H-26)，0.83(d，6.7，H-27)；13C-NMR(CHCl3，100MHz)158.4(d，C-1)，127.4(d，C-2)，200.1(s，C-3)，41.0(t，C-4)，44.3(d，C-5)，27.1(t，C-6)，31.2(t，C-7)，35.7(d，C-8)，50.0(d，C-9)，38.9(s，C-10)，21.1(t，C-11)，37.3(t，C-12)，42.3(s，C-13)，55.7(d，C-14)，23.6(t，C-15)，27.6(t，C-16)，52.7(d，C-17)，12.3(q，C-18)，13.0(q，C-19)，47.4(d，C-20)，176.7(s，C-21)，32.2(t，C-22)，38.8(t，C-23)，25.1(t，C-24)，27.8(d，C-25)，22.3(q，C-26)，22.7(q，C-27)，50.9(q，OCH3)。同時(shí)，通過測定二維H-H相關(guān)譜(1H-1H COSY)，H-C相關(guān)譜和H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)，確定了所有碳原子和氫原子的信號(hào)歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
實(shí)例例二多棘酸酯的抗腫瘤活性測試實(shí)驗(yàn)方法MTT法按不同腫瘤生成速率，將一定數(shù)量處于對(duì)數(shù)生長期的A-549，HL-60腫瘤細(xì)胞90μl/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)后加入藥液10μl/孔，對(duì)每個(gè)細(xì)胞株，每個(gè)濃度均為三個(gè)復(fù)孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理鹽水配制20μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，加入三聯(lián)液(10％SDS-5％異丁醇-0.01mol/LHCL)50μl/孔，于CO2培養(yǎng)箱中過夜。然后在570nm用酶標(biāo)儀測定OD值。經(jīng)多次體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，該化合物具有顯著的抗腫瘤作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的IC50(μM)BEL-7402 HL-60 HELA多棘酸酯0.14 2.00 4.5權(quán)利要求
1.一種從軟珊瑚中提取獲得具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)的21位甲基氧化成羧酸的甾體化合物多棘酸酯
2.如權(quán)利要求1所述的化合物多棘酸酯的制備方法，其特征在于軟珊瑚用丙酮提取，提取液合并后減壓濃縮得粗浸膏，將所得浸膏溶于水中得水懸液用乙醚萃取，所得萃取液合并后減壓濃縮得到乙醚部分，經(jīng)硅膠柱層析分離流動(dòng)相為石油醚∶乙醚，再經(jīng)凝膠LH-20純化得到多棘酸酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多棘酸酯的制備方法，其特征在于乙醚部分經(jīng)硅膠柱層析，流動(dòng)相為石油醚/乙醚(99∶1，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50)梯度洗脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多棘酸酯的制備方法，其特征在于乙醚部分的石油醚/乙醚80∶20洗脫部分經(jīng)凝膠LH-20(石油醚/氯仿/甲醇2∶1∶1)純化。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物多棘酸酯的用途作為制備預(yù)防、治療腫瘤藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是從南海軟珊瑚Spongodes sp.中提取、分離獲得的新型的具有顯著抗腫瘤活性的化合物多棘酸酯，結(jié)構(gòu)如上，經(jīng)多次體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，該類化合物具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞活性，可望在制備抗癌癥藥物中應(yīng)用。本發(fā)明可為研制新的治療各種常見多發(fā)癌癥藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)開發(fā)利用中國的海洋生物資源具有重要意義。
文檔編號(hào)C07J9/00GK1704428SQ20041002493
公開日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者郭躍偉, 嚴(yán)小紅, 丁健, 林莉萍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海藥物研究所