專利名稱：一種抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法。
背景技術(shù)：
在藥物分析檢測中，常用的方法有高效液相色譜法(HPLC)、離子交換色譜一紫外檢測法、質(zhì)譜分析法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法將高效液相色譜的高分離效能力與質(zhì)譜的強(qiáng)大結(jié)構(gòu)測定功能組合起來，使其成為醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域中最重要的方法之一。氟萊哌素是一種I. I類新型抗癌藥物，具有高效、廣譜、低毒、低成本的特點(diǎn)，目前處于臨床I期研究階段，而國內(nèi)外文獻(xiàn)中對氟萊哌素檢測方法的報(bào)道很少見，在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析操作中將氟萊哌素稀釋液直接打進(jìn)質(zhì)譜無響應(yīng)，無法對氟萊哌素進(jìn)行定量測定。大鼠體內(nèi)藥動學(xué)(L. Gu, L. Li, Z. Chen, H. Pan, H. Jiang, S. Zeng, X. Xu, H. An. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. , 2008 (868) :77)研究報(bào)道過一種方法， 為高效液相色譜檢測方法，但是最低測定限(LOQ)為50ng/ml，靈敏度太低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，操作簡便，準(zhǔn)確度高，靈敏、可靠，檢測限低，結(jié)果重現(xiàn)性好。一種抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，包括對氟萊哌素的全血樣品依次進(jìn)行預(yù)處理和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測分析，所述的預(yù)處理為向氟萊哌素的全血樣品中加入乙醚、內(nèi)標(biāo)溶液和NaF飽和水溶液(室溫)，再進(jìn)行冷凍離心，取冷凍離心的上清液于室溫下氮?dú)獯蹈桑肁gNO3溶液復(fù)溶后進(jìn)行離心分離，取離心分離的上清液作為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的樣品。所述的全血樣品與內(nèi)標(biāo)溶液的體積比為10 : I。所述的全血樣品與NaF飽和水溶液的體積比為I : 1.5。在實(shí)際操作中，并不嚴(yán)格限定乙醚的用量，為使全血樣品中待測組分得到更好的分散，所述的全血樣品與乙醚的體積比優(yōu)選為I : 10。所述的冷凍離心的上清液與AgNO3溶液的體積比為10 I。所述的內(nèi)標(biāo)溶液為濃度為8. 600ng/ml的對苯三硫醚的甲醇溶液，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測分析的條件為(I)液相色譜分離液相色譜的流動相由體積比為85 15的流動相A與流動相B組成，流動相A為甲醇，流動相B為體積分?jǐn)?shù)為O. 05%的甲酸的水溶液，流速為O. 6ml/min ;色譜柱為ZORBAX SB-C18液相色譜柱；進(jìn)樣量為10 μ I ;
(2)質(zhì)譜檢測大氣壓電噴霧離子源，多重反應(yīng)選擇離子監(jiān)測，陽離子電離模式碰撞氣41. 38kPa，氣簾氣103. 45kPa，離子噴霧電壓4500V ;干燥氣溫度 4000C ;離子源氣體I :448. 28kPa，離子源氣體2 :275. 86kPa ；氟萊哌素母離子[MJAg]+及子離子測定為m/z 421. I — 357. 0，離子去簇電壓 72V，入口電壓10V，碰撞能27V，碰撞室出口電壓4V ；內(nèi)標(biāo)對苯三硫醚母離子[M2+Ag]+及子離子測定為m/z 384. 9 — 263. O,離子去簇電壓72V，入口電壓10V，碰撞能25V，碰撞室出口電壓10V ；所述的色譜柱為不銹鋼填充柱，內(nèi)徑為3. Omm,長度為150mm,粒徑為3. 5 μ m。所述的AgNO3溶液是由所述的流動相配制的，濃度為O. 01mol/L,以避免在后續(xù)的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測分析中基線不穩(wěn)造成無法判斷雜質(zhì)峰。本發(fā)明對全血樣品進(jìn)行預(yù)處理時(shí)所采用的乙醚如無特殊說明均為零攝氏度的乙醚。本發(fā)明建立了全血中氟萊哌素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，本發(fā)明方法對氟萊哌素樣品的檢測的專一性強(qiáng)，靈敏度高，操作方便，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均能達(dá)到中國藥典的相關(guān)技術(shù)要求；本發(fā)明方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測限低，可達(dá)到O. 4ng/ml。


圖I為本發(fā)明氟萊哌素標(biāo)準(zhǔn)樣品的一級全掃描質(zhì)譜圖。圖2為本發(fā)明內(nèi)標(biāo)對苯三硫醚的一級全掃描質(zhì)譜圖。圖3為本發(fā)明氟萊哌素標(biāo)準(zhǔn)樣品的二級全掃描質(zhì)譜圖。圖4為本發(fā)明內(nèi)標(biāo)對苯三硫醚的二級全掃描質(zhì)譜圖。圖5a為本發(fā)明實(shí)施例2測試空白全血中氟萊哌素的色譜圖。圖5b為本發(fā)明實(shí)施例2測試空白全血中內(nèi)標(biāo)的色譜圖。圖5c為本發(fā)明實(shí)施例2測試空白全血加氟萊哌素(40ng/ml)和內(nèi)標(biāo)(8. 600ng/ ml)后的樣品中氟萊哌素的色譜圖。圖5d為本發(fā)明實(shí)施例2測試空白全血加氟萊哌素(40ng/ml)和內(nèi)標(biāo)后的樣品中內(nèi)標(biāo)(8. 600ng/ml)的色譜圖。圖5e為本發(fā)明實(shí)施例2測試病人給藥后的病人全血中氟萊哌素的色譜圖。圖5f為本發(fā)明實(shí)施例2測試病人給藥后的病人全血中內(nèi)標(biāo)的色譜圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例2氟萊哌素在全血中的降解率圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5、實(shí)施例6、實(shí)施例7、實(shí)施例8氟萊哌素在病人全血中的血藥濃度曲線圖。圖8為本發(fā)明實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5、實(shí)施例6、實(shí)施例7、實(shí)施例8中氟萊哌素在病人全血中的血藥濃度曲線圖的局部放大圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I(I)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
4
精密稱取氟萊哌素標(biāo)準(zhǔn)樣品8. 350mg，置5ml容量瓶中，加甲醇溶解、定容，得標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，置_20°C冰箱中備用。精密稱取對苯三硫醚對照品8. 600mg,置5ml的容量瓶中，加甲醇溶解、定容，得濃度為1.720mg/ml的母液，即內(nèi)標(biāo)儲備液，置_20°C冰箱中備用；使用前加甲醇稀釋，配成濃度為8. 600ng/ml的對苯三硫醚溶液。(2)樣品的預(yù)處理從超低溫(_80°C左右)冰箱中取出氟萊哌素的全血樣品I. 7ml，直接加入乙醚 (0°C )，震蕩融化，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，再次加入乙醚((TC )，乙醚總量為17ml，再依次加入170 μ I對苯三硫醚溶液、2550 μ I NaF飽和溶液(室溫狀態(tài)的飽和溶液)，渦旋震蕩 2min,4°C下4000rpm冷凍離心5min,取上清液5ml室溫下氮?dú)獯蹈?用O. 01mol/L流動相 (具體組成可參見步驟⑷)配制的AgNO3溶液500 μ I復(fù)融，震蕩I. 5min,轉(zhuǎn)移到I. 5ml微量離心管中10900rpm離心lOmin，取上清液200 μ I置進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣分析；(3)液相色譜分離儀器:Agilent RRLC1200安捷倫超高速高分離液相色譜儀。流動相由體積比為85 15的流動相A與流動相B組成，流動相A為甲醇，流動相B為甲酸的水溶液(甲酸的體積分?jǐn)?shù)為O. 05% )，流速為O. 6ml/min ;色譜柱為ZORBAX SB-C18液相色譜柱，內(nèi)徑為3. Omm,長度為150mm，粒徑為3. 5 μ m ;進(jìn)樣量為10 μ I ;(4)質(zhì)譜檢測儀器API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(AB)公司，美國)； Analyst software 工作站 VL 4. 2 ;離子源大氣壓電噴霧離子源(ESI)；掃描方式陽離子MRM掃描；離子源參數(shù)離子源氣體I :65psi (448. 28kPa);離子源氣體2 : 40psi(275. 86kPa);碰撞氣6psi (41. 38kPa);氣簾氣15psi (103. 45kPa);離子噴霧電壓: 4500V ;干燥氣溫度400°C ；定性離子對、定量離子對和相關(guān)參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，包括對氟萊哌素的全血樣品依次進(jìn)行預(yù)處理和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測分析，其特征在于，所述的預(yù)處理為向氟萊哌素的全血樣品中加入乙醚、內(nèi)標(biāo)溶液和NaF飽和水溶液，再進(jìn)行冷凍離心，取冷凍離心的上清液于室溫下氮?dú)獯蹈桑肁gNO3溶液復(fù)溶后進(jìn)行離心分離，取離心分離的上清液作為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的樣品。
2.如權(quán)利要求I所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的全血樣品與內(nèi)標(biāo)溶液的體積比為10 I。
3.如權(quán)利要求I所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的全血樣品與NaF飽和水溶液的體積比為I : 1.5。
4.如權(quán)利要求I所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的全血樣品與乙醚的體積比為I : 10。
5.如權(quán)利要求I所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的冷凍離心的上清液與AgNO3溶液的體積比為10 I。
6.如權(quán)利要求I或2所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的內(nèi)標(biāo)溶液為濃度為8. 600ng/ml的對苯三硫醚的甲醇溶液。
7.如權(quán)利要求I所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測分析的條件為(1)液相色譜分離液相色譜的流動相由體積比為85 15的流動相A與流動相B組成，流動相A為甲醇，流動相B為體積分?jǐn)?shù)為O. 05%的甲酸的水溶液，流速為O. 6ml/min ;色譜柱為ZORBAX SB-C18液相色譜柱；進(jìn)樣量10為μ I ;(2)質(zhì)譜檢測大氣壓電噴霧離子源，多重反應(yīng)選擇離子監(jiān)測，陽離子電離模式碰撞氣41. 38kPa，氣簾氣:103. 45kPa，離子噴霧電壓4500V ;干燥氣溫度400°C ’離子源氣體I :448. 28kPa，離子源氣體2 :275. 86kPa ；氟萊哌素母離子[MfAg] +及子離子測定為m/z 421. I — 357. 0，離子去簇電壓72V，入口電壓10V，碰撞能27V，碰撞室出口電壓4V ；內(nèi)標(biāo)對苯三硫醚母離子[M2+Ag] +及子離子測定為m/z 384. 9 — 263. O,離子去簇電壓 72V，入口電壓:10V，碰撞能:25V，碰撞室出口電壓10V。
8.如權(quán)利要求7所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的色譜柱為不銹鋼填充柱，內(nèi)徑為3. Omm,長度為150mm,粒徑為3. 5 μ m。
9.如權(quán)利要求7所述的抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，其特征在于，所述的AgNO3 溶液是由流動相配制的，濃度為O. 01mol/Lo
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗癌新藥氟萊哌素的定量測定方法，包括對氟萊哌素的全血樣品依次進(jìn)行預(yù)處理和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測分析，其特征在于，所述的預(yù)處理為向氟萊哌素的全血樣品中加入乙醚、內(nèi)標(biāo)溶液和NaF飽和水溶液，再進(jìn)行冷凍離心，取冷凍離心的上清液于室溫下氮?dú)獯蹈?，用AgNO3溶液復(fù)溶后進(jìn)行離心分離，取離心分離的上清液作為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的樣品。本發(fā)明方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測限低，氟萊哌素的最低測定限為0.4ng/ml，本發(fā)明方法對氟萊哌素樣品的檢測的專一性強(qiáng)，靈敏度高，操作方便，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均能達(dá)到中國藥典的相關(guān)技術(shù)要求。
文檔編號G01N30/02GK102590390SQ201210049748
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者付立智, 朱梅湘, 王 華, 申屠建中, 胡興江 申請人:浙江大學(xué)