專利名稱：檢測維生素c工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種檢測維生素C工業(yè)混菌傳代培養(yǎng)不同代數(shù)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變化的方法。
背景技術(shù)：
目前，我國生產(chǎn)維生素C的方法為“二步發(fā)酵法”，第一步發(fā)酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，第二步發(fā)酵為巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌混合發(fā)酵，將山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸。通過混菌傳代培養(yǎng)，混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-酮-L-古龍酸的能力有提高，其作用機(jī)理尚不明確，對氧化葡糖桿菌進(jìn)行分子改造尚不能提供有利信息。蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞的重要組成部分，對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明細(xì)胞在不同生長條件下的變化機(jī)制。一方面可以對其上游的基因組學(xué)信息進(jìn)行驗(yàn)證，提供后續(xù)基因改造的依據(jù)，另一方面又可以對其下游的代謝物研究提供指導(dǎo)。蛋白組學(xué)的發(fā)展，主要依托高效的蛋白分離和鑒定技術(shù)，主要有二維凝膠電泳和液相色譜分離兩種分離方法，其中，液相色譜分離然后經(jīng)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)，具有高度自動化，高分辨率的優(yōu)勢，是目前蛋白組學(xué)發(fā)展的主流?；谝合嗌V分離，Q-TOF鑒定蛋白技術(shù)的使用，可以從整體水平上檢測細(xì)胞在發(fā)酵過程中各種結(jié)構(gòu)蛋白以及功能蛋白的變化水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過高通量的蛋白組學(xué)的手段來了解混菌傳代培養(yǎng)不同時(shí)期，巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌各自細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變化規(guī)律，進(jìn)一步揭示傳代培養(yǎng)對巨大芽孢桿菌以及氧化葡糖桿菌產(chǎn)生的影響，為揭示傳代培養(yǎng)促進(jìn)氧化葡糖桿菌生長及2-酮-L-古龍酸生產(chǎn)的作用機(jī)制提供有利信息，從而提高其生長及生產(chǎn)能力，提供一種檢測維生素C 工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種檢測維生素C工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的10-200 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和10-200 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28_35°C，培養(yǎng)24-48 小時(shí)；②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在 28-350C，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h_48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；
將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為 2 X 107-2 X 1010CFU/mL,使氧化葡糖桿菌的密度為 2 X 108-2 X 10nCFU/mL,在 28_35°C， 200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)，以24h_48h為傳代周期，以體積比為1% -10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天，選定3-4個(gè)取樣時(shí)間取3-4個(gè)樣；③分純將步驟(I)②獲得的3-4個(gè)樣的混菌細(xì)胞劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35°C培養(yǎng)24h-48h ;再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28_35°C，200_280rpm搖床振蕩培養(yǎng) 24h-48h，得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中；④不同進(jìn)化時(shí)期巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌分別接種到種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2X 107-2X 101(lCFU/mL，進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2X 108-2X 10nCFU/mL，在28-35 °C，200_280r/min搖床振蕩培養(yǎng) 10-15h ；(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定①細(xì)胞收集及淬滅分別將步驟(I)④獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)物，在4°C下， 以4000 6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集下層的細(xì)胞，并用pH為7. 2 7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗，用液氮淬滅，終止代謝反應(yīng)；用液氮研磨破碎細(xì)胞；②提取細(xì)胞內(nèi)蛋白取所述破碎細(xì)胞，每份80 IOOmg分別置于離心管中，每管加入O. 5 ImL細(xì)胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20 50s ;加入5 15 μ L質(zhì)量比為2 4 I的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應(yīng)10 30min ;加入5 15 μ L 80 120mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置I 3h ;15000rpm離心25 40min ;取上清，得到蛋白溶液；所述細(xì)胞裂解液為8mol噸―1尿素，質(zhì)量濃度為4%的3_[ (3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris,余量為水；③蛋白濃度測定采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中，測定步驟(2)②獲得的各個(gè)蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定各個(gè)蛋白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白分別取含50 IOOyg蛋白的步驟(2)②獲得的各個(gè)蛋白溶液，每份加入4 6 倍體積的-20°C _40°C的丙酮，在_20°C _40°C的條件下放置12 20h ;離心，棄上清， 沉淀用_20°C _40°C的體積濃度為70% -85%的丙酮水溶液洗滌；干燥得到蛋白干粉；⑤蛋白還原以及酶解分別向各個(gè)蛋白干粉中，添加20 40 μ L 40 60mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；再加入I 4yL三(2-羧乙基)膦，在50 60°C還原反應(yīng)1-1. 5h，再加入I 2μ L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應(yīng)10 15min，終止還原反應(yīng)；再加入20 30 μ L濃度為
O.2 O. 3 μ g/μ L的胰蛋白酶水溶液，37°C蛋白酶解12 18小時(shí)，得酶解液；
5
⑥蛋白標(biāo)記向步驟(2)⑤獲得的各個(gè)酶解液中分別加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的iTRAQ 標(biāo)記試劑，室溫反應(yīng)1-1. 5h ；⑦溶液混合將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自巨大芽孢桿菌的蛋白溶液混合；將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自氧化葡糖桿菌的蛋白溶液混合；于_40°C保存；⑧差異表達(dá)蛋白鑒定將(2)⑦中得到的兩組混合液，進(jìn)行Q-Tof質(zhì)譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達(dá)蛋白；(3)聚類分析采用EXpander4. O對步驟⑵⑧中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行K-means聚類， 得到具有不同變化規(guī)律的數(shù)據(jù)類別，獲得候選差異蛋白；⑷過程分析將步驟(3)獲得的候選差異蛋白含量按照時(shí)間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)混菌進(jìn)化培養(yǎng)在提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸過程中的作用。利用本發(fā)明的方法可以從揭示混菌傳代培養(yǎng)對巨大芽孢桿菌以及氧化葡糖桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白變化產(chǎn)生的影響，找到發(fā)酵過程中的重要蛋白，這些蛋白含量的變化規(guī)律為了解混菌發(fā)酵過程的內(nèi)在機(jī)理提供依據(jù)，從而為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產(chǎn)量提
供理論基礎(chǔ)。同時(shí)也為工業(yè)混菌發(fā)酵過程的研究提供新的思路和方法。


圖I為傳代培養(yǎng)0、50、100、150代的氧化葡糖桿菌蛋白聚類分析；
圖2為傳代培養(yǎng)0、50、100、150代的氧化葡糖桿菌細(xì)胞內(nèi)山梨糖/山梨酮脫氫酶相對表達(dá)量；
圖3為傳代培養(yǎng)0、50、100、150代的巨大芽孢桿菌蛋白聚類分析；
圖4為傳代培養(yǎng)0、50、100、150代的巨大芽孢桿菌聚類分析中類別2。
具體實(shí)施方式
下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明
實(shí)施例I
一種檢測維生素C工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法，包括如下步驟
(I)混菌傳代培養(yǎng)
①固體培養(yǎng)
取存于液氮的20 μ L保藏于體積濃度為15%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌
(Gluconobacter oxydans)和20 μ L保藏于體積濃度為15%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上,28°C,培養(yǎng)24小時(shí)；
②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在 28°C,200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107CFU/mL,使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 108CFU/mL,在28°C，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)，以24h為傳代周期，以體積比為1%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代150天，選定 4個(gè)取樣時(shí)間取4個(gè)樣，分別為O天、50天、100天、150天；③分純將步驟(I)②獲得的4個(gè)樣的混菌細(xì)胞劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上， 28°C培養(yǎng)24h ;再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)24h，得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15%的甘油水溶液中；④不同進(jìn)化時(shí)期巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌分別接種到種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107CFU/mL，進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2X 108CFU/mL，在28°C，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)IOh ；(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定①細(xì)胞收集及淬滅分別將步驟(I)④獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)物，在4°C下， 以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集下層的細(xì)胞，并用pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液清洗,用液氮淬滅，終止代謝反應(yīng)；用液氮研磨破碎細(xì)胞；②提取細(xì)胞內(nèi)蛋白取所述破碎細(xì)胞，每份SOmg分別置于離心管中，每管加入O. 5mL細(xì)胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20s ;加入5μ L質(zhì)量比為2 I的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻， 4°C靜置反應(yīng)IOmin ;加入5 μ L 80mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置Ih ;15000rpm離心25min ;取上清，得到蛋白溶液；所述細(xì)胞裂解液為8mol噸―1尿素，質(zhì)量濃度為4%的3_[ (3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris,余量為水；③蛋白濃度測定采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中，測定步驟(2)②獲得的各個(gè)蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定各個(gè)蛋白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白分別取含50 μ g蛋白的步驟⑵②獲得的各個(gè)蛋白溶液，每份加入4倍體積的_20°C的丙酮，在_20°C的條件下放置12h ;離心，棄上清，沉淀用_20°C的體積濃度為 70%的丙酮水溶液洗滌；干燥得到蛋白干粉；⑤蛋白還原以及酶解分別向各個(gè)蛋白干粉中，添加20μ L 40mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；再加入I μ L三(2-羧乙基)膦，在50°C還原反應(yīng)lh，再加入I μ L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應(yīng)lOmin，終止還原反應(yīng)；再加入20 μ L濃度為O. 2 μ g/μ L的胰蛋白酶水溶液，37°C蛋白酶解12小時(shí)，得酶解液；⑥蛋白標(biāo)記向步驟(2)⑤獲得的各個(gè)酶解液中分別加入一管用60 μ L乙醇溶解的iTRAQ標(biāo)記試劑，室溫反應(yīng)Ih ；⑦溶液混合將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自巨大芽孢桿菌的蛋白溶液混合；將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自氧化葡糖桿菌的蛋白溶液混合；于_40°C保存；⑧差異表達(dá)蛋白鑒定將(2)⑦中得到的兩組混合液，進(jìn)行Q-Tof質(zhì)譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達(dá)蛋白；(3)聚類分析采用Expanded. O對步驟(2)⑧中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行K-means聚類， 得到具有不同變化規(guī)律的數(shù)據(jù)類別，獲得候選差異蛋白；(4)過程分析將步驟(3)獲得的候選差異蛋白含量按照時(shí)間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)混菌進(jìn)化培養(yǎng)在提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸過程中的作用。在混菌傳代培養(yǎng)過程，氧化葡糖桿菌產(chǎn)生了多種進(jìn)化方向，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)蛋白在不同代數(shù)呈現(xiàn)不同表達(dá)規(guī)律，見圖I。通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量變化可以分為6類， 其中，類別I、類別3以及類別5表現(xiàn)為各代蛋白表達(dá)變化不大；類別2與類別4表現(xiàn)為進(jìn)化后蛋白表達(dá)有不同程度提高，其中包括負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化山梨糖為2-酮-L-古龍酸的山梨糖/山梨酮脫氫酶。此酶在各代的表達(dá)情況如圖2所示，在50代有輕微的表達(dá)下調(diào)，在100代和150 代有逐漸提高的表達(dá)量。此現(xiàn)象的原因，可能為50代時(shí)，混菌之間發(fā)生劇烈的相互作用，進(jìn)行適應(yīng)性選擇，隨著相互配合作用的增強(qiáng)，氧化葡糖桿菌越來越適應(yīng)混菌環(huán)境，具有了更強(qiáng)的生產(chǎn)能力。同時(shí)，對不同傳代時(shí)期的巨大芽孢桿菌進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。類別I 中131種蛋白表達(dá)量無明顯變化；類別2中9種蛋白表達(dá)量隨著傳代數(shù)增加呈現(xiàn)上調(diào)趨勢；類別3中88種蛋白表達(dá)量隨著傳代數(shù)增加有微弱上調(diào)趨勢；類別4中25種蛋白在50 代有輕度下調(diào)，而后在100代、150代輕度上調(diào)。此四類中，變化最明顯的為類別2，具體蛋白表達(dá)情況，如圖4所示。在類別2的9個(gè)蛋白中,4個(gè)與immune inhibitor A (immune inhibitor A ；immune inhibitor A metalloprotease ；immune inhibitor A precursor ； peptide M6 immune inhibitor A)有關(guān)，一個(gè)與寡月太轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)(oligopeptide bingding protein oppA),此外還有抵抗活性氧的過氧化物歧化酶(superoxide dismutase, Mn)。 Immune inhibitor A為芽孢桿菌中降解抗菌肽的蛋白，對芽孢桿菌抵抗外部免疫系統(tǒng)有重要作用，此外，它還是芽孢桿菌孢外壁的重要組成部分。其表達(dá)量隨傳代培養(yǎng)代數(shù)增加，呈現(xiàn)上調(diào)，表明巨大芽孢桿菌芽孢的抗逆性有了提高。同時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽能力也有所提高，利于自身的生長需要。綜上所述，混菌傳代培養(yǎng)對氧化葡糖桿菌以及巨大芽孢桿菌均產(chǎn)生了利于雙方生長的影響，表現(xiàn)為氧化葡糖桿菌生產(chǎn)能力的提高，以及巨大芽孢桿菌抗逆性的提高。這一發(fā)現(xiàn)，為后續(xù)對氧化葡糖桿菌進(jìn)行基因改造提供了依據(jù)，也為工業(yè)混菌過程研究及控制提供了基礎(chǔ)。實(shí)施例2一種檢測維生素C工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的10 μ L保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌 (Gluconobacter oxydans)和10 μ L保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，30°C,培養(yǎng)36小時(shí)；②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在 30°C,250r/min搖床振蕩培養(yǎng)36h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2 X 108CFU/mL,使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 109CFU/mL,在30°C，250r/min搖床振蕩培養(yǎng)，以36h為傳代周期，以體積比為5%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100天，選定 3個(gè)取樣時(shí)間取3個(gè)樣，分別為O天、50天、100天；③分純將步驟(I)②獲得的3個(gè)樣的混菌細(xì)胞劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上， 30°C培養(yǎng)36h ;再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在30°C，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)36h，得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中；④不同進(jìn)化時(shí)期巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌分別接種到種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2X108CFU/mL，進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2X 109CFU/mL，在30°C，250r/min搖床振蕩培養(yǎng)12h ；(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定①細(xì)胞收集及淬滅分別將步驟⑴④獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)物，在4°C下， 以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集下層的細(xì)胞，并用pH為7. 3的磷酸鹽緩沖液清洗,用液氮淬滅，終止代謝反應(yīng)；用液氮研磨破碎細(xì)胞；②提取細(xì)胞內(nèi)蛋白取所述破碎細(xì)胞，每份90mg分別置于離心管中，每管加入O. SmL細(xì)胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎40s ;加入10 μ L質(zhì)量比為3 : I的DNase I/RNaseA酶混合溶液， 混勻，4 °C靜置反應(yīng)2 O m i η ;加入IO μ L IO O mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4 °C靜置2 h ; 15000rpm離心30min ;取上清,得到蛋白溶液；所述細(xì)胞裂解液為8mol噸―1尿素，質(zhì)量濃度為4%的3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris,余量為水；③蛋白濃度測定
采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中，測定步驟(2)②獲得的各個(gè)蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定各個(gè)蛋白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白分別取含80 μ g蛋白的步驟⑵②獲得的各個(gè)蛋白溶液，每份加入5倍體積的_40°C的丙酮，在_40°C的條件下放置15h ;離心，棄上清，沉淀用_40°C的體積濃度為 80%的丙酮水溶液洗滌；干燥得到蛋白干粉；⑤蛋白還原以及酶解分別向各個(gè)蛋白干粉中，添加20μ L 50mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；再加入2 μ L三(2-羧乙基)膦，在55°C還原反應(yīng)I. 2h，再加入I μ L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應(yīng)lOmin，終止還原反應(yīng)；再加入25 μ L濃度為O. 25 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液，37°C蛋白酶解16小時(shí),得酶解液；⑥蛋白標(biāo)記向步驟(2)⑤獲得的各個(gè)酶解液中分別加入一管用70 μ L乙醇溶解的iTRAQ標(biāo)記試劑，室溫反應(yīng)I. 2h ;⑦溶液混合將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自巨大芽孢桿菌的蛋白溶液混合；將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自氧化葡糖桿菌的蛋白溶液混合；于_40°C保存；⑧差異表達(dá)蛋白鑒定將(2)⑦中得到的兩組混合液，進(jìn)行Q-Tof質(zhì)譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達(dá)蛋白；(3)聚類分析采用EXpander4. O對步驟(2)⑧中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行K-means聚類， 得到具有不同變化規(guī)律的數(shù)據(jù)類別，獲得候選差異蛋白；(4)過程分析將步驟(3)獲得的候選差異蛋白含量按照時(shí)間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)混菌進(jìn)化培養(yǎng)在提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸過程中的作用。實(shí)施例3一種檢測維生素C工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的200 μ L保藏于體積濃度為30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌 (Gluconobacter oxydans)和200 μ L保藏于體積濃度為30 %的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上,35°C,培養(yǎng)48小時(shí)；②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在 350C，280r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密
10度為2X 101(lCFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 10nCFU/mL，在35°C，280r/min搖床振蕩培養(yǎng)，以48h為傳代周期，以體積比為10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代150天，選定4個(gè)取樣時(shí)間取4個(gè)樣，分別為O天、50天、100天、150天；③分純將步驟(I)②獲得的4個(gè)樣的混菌細(xì)胞劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上， 35°C培養(yǎng)48h ;再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在35°C，280rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h，得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為30%的甘油水溶液中；④不同進(jìn)化時(shí)期巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌分別接種到種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2X 101(lCFU/mL，進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2X 10nCFU/mL，在35°C，280r/min搖床振蕩培養(yǎng)15h ；(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定①細(xì)胞收集及淬滅分別將步驟(I)④獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)物，在4°C下， 以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集下層的細(xì)胞，并用pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗,用液氮淬滅，終止代謝反應(yīng)；用液氮研磨破碎細(xì)胞；②提取細(xì)胞內(nèi)蛋白取所述破碎細(xì)胞，每份IOOmg分別置于離心管中，每管加入ImL細(xì)胞裂解液，混勻， 冰上間歇超聲破碎50s ;加入15 μ L質(zhì)量比為4 : I的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻， 4°C靜置反應(yīng)30min ;加入15 μ L 120mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置3h ；15000rpm 離心40min ;取上清,得到蛋白溶液；所述細(xì)胞裂解液為8mol噸―1尿素，質(zhì)量濃度為4%的3_[ (3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris,余量為水；③蛋白濃度測定采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中，測定步驟(2)②獲得的各個(gè)蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定各個(gè)蛋白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白分別取含100μ g蛋白的步驟⑵②獲得的各個(gè)蛋白溶液，每份加入6倍體積的_40°C的丙酮，在_40°C的條件下放置20h ;離心，棄上清，沉淀用_40°C的體積濃度為 85%的丙酮水溶液洗滌；干燥得到蛋白干粉；⑤蛋白還原以及酶解分別向各個(gè)蛋白干粉中，添加40μ L 60mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；再加入4 μ L三(2-羧乙基)膦，在60°C還原反應(yīng)I. 5h，再加入2 μ L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應(yīng)15min，終止還原反應(yīng)；再加入30 μ L濃度為O. 3 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液，37°C蛋白酶解18小時(shí)，得酶解液；⑥蛋白標(biāo)記向步驟(2)⑤獲得的各個(gè)酶解液中分別加入一管用80 μ L乙醇溶解的iTRAQ標(biāo)記試劑，室溫反應(yīng)I. 5h ；⑦溶液混合將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自巨大芽孢桿菌的蛋白溶液混合；將步驟⑵⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自氧化葡糖桿菌的蛋白溶液混合；于_40°C保存；⑧差異表達(dá)蛋白鑒定將(2)⑦中得到的兩組混合液，進(jìn)行Q-Tof質(zhì)譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達(dá)蛋白；(3)聚類分析采用EXpander4. O對步驟⑵⑧中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行K-means聚類， 得到具有不同變化規(guī)律的數(shù)據(jù)類別，獲得候選差異蛋白；(4)過程分析將步驟(3)獲得的候選差異蛋白含量按照時(shí)間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)混菌進(jìn)化培養(yǎng)在提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸過程中的作用。實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例2和實(shí)施例3與實(shí)施例I的結(jié)果類似。本發(fā)明所采用的固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基的組成選自中國專利申請?zhí)枮?201110314740. 9公開的培養(yǎng)基，例如固體培養(yǎng)基按比例稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g，瓊脂 20g，KH2PO4 lg, MgSO4 O. 2g, CaCO3 lg，加水至 1L，調(diào) pH = 6· 8，121°C 滅菌20min，制成固體培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基按比例稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g，KH2PO4 IgjMgSO4 O. 2g, CaCO3 lg，加水至 1L，調(diào) pH = 6· 8，121°C滅菌 20min， 制成種子培養(yǎng)基。本發(fā)明所米用的菌株巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)CGMCC No I. 1483和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No I. 110只用于說明本發(fā)明，但并不用于限定本發(fā)明，實(shí)驗(yàn)證明，巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌的其它菌株也可以用于本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種檢測維生素C工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法，其特征是包括如下步驟(1)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的10-200 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌 (Gluconobacter oxydans)和10-200 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上,28_35°C,培養(yǎng)24-48小時(shí)；②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在 28-35°C，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h_48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為 2X107-2X1010CFU/mL,使氧化葡糖桿菌的密度為 2X 108_2X 10nCFU/mL，在 28-35°C， 200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)，以24h_48h為傳代周期，以體積比為1% -10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天，選定3-4個(gè)取樣時(shí)間取3-4個(gè)樣；③分純將步驟(I)②獲得的3-4個(gè)樣的混菌細(xì)胞劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上， 28-35 °C培養(yǎng)24h-48h ;再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28-35 °C，200_280rpm搖床振蕩培養(yǎng) 24h-48h，得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中；④不同進(jìn)化時(shí)期巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌分別接種到種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107-2 X 101(lCFU/mL，進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為 2X 108-2X 10nCFU/mL，在 28-35°C，200-280r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 10_15h ；(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定①細(xì)胞收集及淬滅分別將步驟(I)④獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物和氧化葡糖桿菌培養(yǎng)物，在4°C下，以 4000 6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集下層的細(xì)胞，并用pH為7. 2 7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗， 用液氮淬滅，終止代謝反應(yīng)；用液氮研磨破碎細(xì)胞；②提取細(xì)胞內(nèi)蛋白取所述破碎細(xì)胞，每份80 IOOmg分別置于離心管中，每管加入O. 5 ImL細(xì)胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20 50s ;加入5 15 μ L質(zhì)量比為2 4 I的DNase I/ RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應(yīng)10 30min ;加入5 15 μ L 80 120mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置I 3h ;15000rpm離心25 40min ;取上清，得到蛋白溶液；所述細(xì)胞裂解液為8mol · L—1尿素，質(zhì)量濃度為4%的3-[(3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris,余量為水；③蛋白濃度測定采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中，測定步驟(2)②獲得的各個(gè)蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定各個(gè)蛋2/2頁白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白分別取含50 IOOyg蛋白的步驟(2)②獲得的各個(gè)蛋白溶液，每份加入4 6倍體積的-20°C _40°C的丙酮，在_20°C _40°C的條件下放置12 20h ;離心，棄上清，沉淀用-20°C _40°C的體積濃度為70% -85%的丙酮水溶液洗滌；干燥得到蛋白干粉；⑤蛋白還原以及酶解分別向各個(gè)蛋白干粉中，添加20 40 μ L 40 60mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；再加入I 4yL三(2-羧乙基)膦，在50 60°C還原反應(yīng)1-1. 5h，再加入I 2 μ L 甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應(yīng)10 15min，終止還原反應(yīng)；再加入20 30 μ L濃度為O. 2 O.3 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液，37°C蛋白酶解12 18小時(shí)，得酶解液；⑥蛋白標(biāo)記向步驟(2)⑤獲得的各個(gè)酶解液中分別加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的iTRAQ標(biāo)記試劑，室溫反應(yīng)1-1. 5h ；⑦溶液混合將步驟(2)⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自巨大芽孢桿菌的蛋白溶液混合；將步驟(2)⑥標(biāo)記后的各個(gè)來自氧化葡糖桿菌的蛋白溶液混合；于_40°C保存；⑧差異表達(dá)蛋白鑒定將(2)⑦中得到的兩組混合液，進(jìn)行Q-Tof質(zhì)譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達(dá)蛋白；(3)聚類分析采用EXpander4. O對步驟(2)⑧中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行K-means聚類，得到具有不同變化規(guī)律的數(shù)據(jù)類別，獲得候選差異蛋白；(4)過程分析將步驟(3)獲得的候選差異蛋白含量按照時(shí)間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規(guī)律，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)混菌進(jìn)化培養(yǎng)在提高氧化葡糖桿菌產(chǎn)2-酮-L-古龍酸過程中的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測維生素C工業(yè)混菌傳代不同代數(shù)蛋白質(zhì)變化的方法，包括如下步驟(1)混菌傳代培養(yǎng)；(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的測定；(3)聚類分析；(4)過程分析，利用本發(fā)明的方法可以從揭示混菌傳代培養(yǎng)對巨大芽孢桿菌以及氧化葡糖桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白變化產(chǎn)生的影響，找到發(fā)酵過程中的重要蛋白，這些蛋白含量的變化規(guī)律為了解混菌發(fā)酵過程的內(nèi)在機(jī)理提供依據(jù)，從而進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產(chǎn)量。
文檔編號G01N21/31GK102590324SQ201210049440
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者元英進(jìn), 呂亞金, 鄒旸, 馬倩 申請人:天津大學(xué)