專利名稱：包含作為佐劑的甘油單酯或甘油二酯衍生物的抗原釋放系統(tǒng)的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是冰島專利申請(qǐng)4518(1997年7月9日遞交)的部分延續(xù)，這里引用了其所有涉及內(nèi)容并包含于本文中。
背景技術(shù)：
通常認(rèn)為，腸胃外給藥(肌內(nèi)和皮下)抗原或疫苗是最為有效的給藥途徑。然而，通過注射給藥有許多缺點(diǎn)。注射抗原或疫苗需要無菌注射器和經(jīng)過培訓(xùn)的人員來完成，并且有可能引起疼痛和刺激，尤其是在重復(fù)注射情況下。這種給藥途徑也具有感染的危險(xiǎn)。最為重要的是，很少有人能夠忍受肌內(nèi)注射，在注射部位可能引起硬結(jié)(組織硬化)，出血(流血)和/或壞死(組織局部壞死)。
粘膜包含大量的樹枝狀細(xì)胞，其是極好的抗原顯露細(xì)胞。粘膜也與淋巴器官(叫作粘膜相關(guān)淋巴組織)相連，相連的淋巴器官能夠加強(qiáng)對(duì)粘膜其它區(qū)域的免疫反應(yīng)。這種粘膜的例子如鼻上皮膜，其本質(zhì)上由一單層上皮細(xì)胞(假復(fù)層上皮)組成，該粘膜與兩淋巴組織，增殖腺(腺樣體)和扁桃體相連。鼻粘膜下擴(kuò)張的毛細(xì)血管網(wǎng)及高密度的T和B細(xì)胞，特別適合于快速識(shí)別抗原并快速作出免疫反應(yīng)。
曾經(jīng)嘗試鼻內(nèi)施用相對(duì)特定病原體的減毒病毒、細(xì)菌和寄生蟲(連同通過其它的粘膜表面給藥一起)，因抗原體通常通過這一途徑感染寄主。我們希望這些病原體能夠通過粘膜表面引起免疫反應(yīng)，因?yàn)橐呙缰薪?jīng)修飾的活病原體遵循野生型病原體的自然感染途徑，即通過亞臨床感染產(chǎn)生免疫反應(yīng)。由于粘膜給以免疫原組合物能夠刺激局部產(chǎn)生抗體(分泌IgA抗體)，并避免了通過腸道外給藥引起的問題，因此人們對(duì)此特別感興趣。而且，粘膜給藥甚至可由未經(jīng)培訓(xùn)的人來完成，包括接受治療的本人，以及典型的反對(duì)腸道外給藥甚于粘膜給藥的兒童。由于施用活的、減毒的、修飾病原體具有危險(xiǎn)性，因此通?？扇〉姆椒ㄊ鞘┯脕唵挝灰呙?。然而，通過粘膜施用亞單位疫苗中純化抗體通常只引起微弱的免疫反應(yīng)。
已開發(fā)了多種釋放抗原載體系統(tǒng)，利用這種載體系統(tǒng)存在的問題之一是，例如對(duì)于肌內(nèi)和粘膜給藥來說，抗原和/或疫苗在未經(jīng)識(shí)別情況下便被吸收或降解，因此也就未引起免疫反應(yīng)，特別是在鼻腔內(nèi)只有短時(shí)間接觸時(shí)這種情況容易發(fā)生。曾有報(bào)道一種聚乙二醇取代的辛酸/癸酸甘油酯和吐溫20的混合物，將用作為粘膜佐劑(Gizurarson等，毒理學(xué)Toxicology 10761-68(1996)；Gizurarson等，疫苗研究VaccineResearch 569-75(1996)；Gizurarson等，疫苗研究Vaccine Research641-47(1997))。然而，這種配方會(huì)在受者的給藥部位引起不舒服的刺痛感。這樣，就需求一種用于粘膜給以抗原的有效配方，以產(chǎn)生可接受的免疫反應(yīng)。
EP專利0544612A2公開了一種組合物，其含有能夠通過口腔或鼻腔給藥的免疫原和甘油三酯。該組合物能夠增強(qiáng)免疫原的效果。
在一篇參考文獻(xiàn)中(美國專利4,610,868，1986年9月9日授權(quán))，描述了一種脂質(zhì)基質(zhì)載體，將其用于藥物的粘膜給藥。這個(gè)系統(tǒng)要求脂質(zhì)基質(zhì)載體含有一種疏水化合物，一種具有球狀結(jié)構(gòu)(直徑為500-100000nm)的兩親性化合物生物活性劑。這里疏水化合物可能包含一種甘油酯混合物，兩親性化合物可能包含一種鞘脂。而且，這種配制物可能經(jīng)過鼻區(qū)施用。由于鼻腔內(nèi)會(huì)被快速清除掉及其較大的球狀結(jié)構(gòu)，這個(gè)系統(tǒng)作為鼻部配制藥，可能不會(huì)被接受。因此，該系統(tǒng)在釋放生物活性劑之前就會(huì)由纖毛將其轉(zhuǎn)移至胃部。該專利沒有描述使用根據(jù)本發(fā)明的佐劑物質(zhì)。
日本專利309347/91(優(yōu)先權(quán)日1991年11月25日)描述了一種口腔或鼻腔用免疫原組合物，其包含一種能夠免疫哺乳動(dòng)物的免疫原，使用了一種含有具有飽和或不飽和C6-26脂肪酸殘基的甘油三酯佐劑。根據(jù)本發(fā)明，使用飽和脂肪酸不能引起免疫反應(yīng)，使用甘油三酯不可能具有能夠溶于佐劑的親水集團(tuán)或者使抗原與佐劑接觸。
WO94/17827(優(yōu)先權(quán)日1993年2月15日)描述了一種藥物制劑，用于哺乳動(dòng)物的抗原局部施用(通過粘膜施用)。佐劑/載體制劑選自以下物組(a)聚氧乙烯脫水山梨糖醇單酯(b)聚氧乙烯蓖麻油(c)辛酸/癸酸甘油酯(d)神經(jīng)節(jié)苷脂。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了一種組合物，其能夠用作為抗原和疫苗施用時(shí)的佐劑，尤其是用作為粘膜施用的佐劑。本發(fā)明組合物加強(qiáng)了抗原與粘膜的粘連，也加強(qiáng)了通過粘膜對(duì)抗原的吸收。利用本發(fā)明的組合物，能夠引起受體全身(例如IgG同型抗體)和局部(例如IgG同型分泌抗體)的免疫反應(yīng)，并且不在上皮膜引起不能被接受的刺激。
本發(fā)明的組合物也可作為佐劑用于植物體，以刺激植物的免疫防護(hù)系統(tǒng)。本發(fā)明也提供了一種用于鼻內(nèi)施用法的控制釋放系統(tǒng)，其與粘膜具有生物相容性并且能夠在小體積量內(nèi)施用需求量的抗原。
本

發(fā)明內(nèi)容
是關(guān)于組合物的，所說組合物包含抗原和佐劑，佐劑中含有0.01-70％v/v的甘油酯，甘油酯選自由甘油單酯和甘油二酯及其混合物組成的組，所說的甘油酯具有分子式(1)

其中R1，R2和R3分別獨(dú)立地選自飽和或不飽和的C6-24脂肪酸，水溶性聚合物及其混合物，條件是甘油酯在R1，R2和R3位置至少含有一個(gè)水溶性聚合物。佐劑也可以包含少量的甘油三酯。在一特定的實(shí)施方案中，水溶性聚合物由具有2-30個(gè)聚氧乙烯單元的聚氧乙烯PEG2-30殘基或其衍生物組成。在另一實(shí)施方案中，基團(tuán)R1，R2和R3中的一個(gè)或兩個(gè)由結(jié)合抗原替代。
在本發(fā)明另一個(gè)的實(shí)施方案中，水溶性聚合物是有3到6個(gè)聚氧乙烯單元的聚氧乙烯PEG3-6殘基。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，甘油酯具有以下基團(tuán)結(jié)構(gòu)

其中每一分子式中的R1，R2如以上的定義。
在本發(fā)明一特定的實(shí)施方案中，R1，R2和R3都選自飽和的C6-14脂肪酸，優(yōu)選飽和的C8-10脂肪酸。
本發(fā)明的組合物調(diào)控對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，也就是免疫原或疫苗組合物能夠在量上和/或質(zhì)上增強(qiáng)受免疫寄主的抗體反應(yīng)。這個(gè)可通過下面的過程完成，例如，通過增加產(chǎn)生于抗原免疫反應(yīng)中的抗體的數(shù)量(例如量上的增強(qiáng))，或者通過改變免疫反應(yīng)的模式，例如從Th1反應(yīng)到Th2反應(yīng)(例如質(zhì)上的增強(qiáng))。
本發(fā)明也涉及引起或增加寄主體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法。該方法包括給脊椎動(dòng)物寄主施用有效量的免疫原組合物的方法，免疫原組合物包含抗原和佐劑，佐劑含有0.01-70％v/v選自下列物組的甘油酯甘油單酯，甘油二酯及其混合物，所說的甘油酯具有上述的(I)到(V)的分子式。在一特定的實(shí)施方案中，通過粘膜給以組合物引起免疫反應(yīng)。
本發(fā)明也涉及引起或增加接種者的體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)免疫性的方法，免疫性指保護(hù)性的免疫反應(yīng)。該方法包括給脊椎動(dòng)物寄主施用有效量的免疫原組合物的方法，免疫原組合物包含抗原和佐劑，佐劑含有0.01-70％v/v選自下列物組的甘油酯甘油單酯，甘油二酯及其混合物，所說的甘油酯具有上述的(I)到(V)的分子式。在一特定的實(shí)施方案中，通過粘膜給以組合物引起免疫反應(yīng)。本發(fā)明的詳細(xì)描述免疫系統(tǒng)運(yùn)用許多機(jī)制防止病原體的侵襲，然而，并沒有必要在免疫后將所有這些機(jī)制都激活。由接種引起的保護(hù)性免疫，取決于疫苗引起適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)從而抵抗或消除病原體的能力。取決于病原體，這一過程需要細(xì)胞介導(dǎo)和/或體液免疫反應(yīng)。為了在受免疫的有機(jī)體內(nèi)獲得較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并加強(qiáng)寄主對(duì)抗原承受劑的抵抗力，經(jīng)?？扇〉霓k法是增強(qiáng)抗原的致免疫能力。通常來說，能夠增強(qiáng)抗原的致免疫能力并與抗原一起施用(或者同時(shí)或者時(shí)間上緊隨前后)的物質(zhì)，作為佐劑被人們所了解。如這里所使用的本發(fā)明組合物中的術(shù)語“佐劑”，意在包含具有傳統(tǒng)佐劑效果的組合物(例如，通過增加或改變上述的抗體反應(yīng)增強(qiáng)抗原的致免疫能力)，也包含增強(qiáng)抗原對(duì)適當(dāng)組織或細(xì)胞遞呈能力的組合物(例如抗原釋放載體)。
對(duì)于鼻內(nèi)施用方法來說，抗原必須施用于粘膜，以這種方式施用以致于抗原能夠進(jìn)入或通過被粘膜或淋巴組織吸收進(jìn)入免疫活性細(xì)胞，這樣抗原就不會(huì)在鼻分泌過程中被清洗掉。抗原也應(yīng)施用在鼻粘膜上，在這種方式下抗原遞呈細(xì)胞吸收抗原并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至局部淋巴系統(tǒng)。為了使抗原能夠進(jìn)入粘膜，釋放載體必須具有一定程度的生物相容性(與粘膜表面膜)，因此也必須具有一定程度的親水性和疏水性。
這里所描述的工藝過程涉及使用這里所說的組合物為粘膜佐劑。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及組合物，例如，免疫原或疫苗組合物。這些組合物包含一種抗原和一種佐劑，佐劑含有0.01-70％v/v選自下列物組的甘油酯甘油單酯，甘油二酯及其混合物。例如，甘油單酯和/或甘油二酯可以被替代。加入本發(fā)明組合物的甘油單酯和甘油二酯可用下列通式表示(I)

其中的R1，R2和R3獨(dú)立選自下列物質(zhì)組成的組飽和或不飽和的C6-24脂肪酸，水溶性聚合物及其混合物，條件是甘油酯含有至少一個(gè)水溶性聚合物。佐劑也可以包含少量的甘油三酯。
可以選擇任何飽和的或不飽和的C6-24脂肪酸，包括但不限于下列脂肪酸衍生而來的脂肪酸殘基己酸，癸酸，辛酸，花生四烯酸，丙酸，月桂酸，十四酸，棕櫚酸，油酸，亞油酸和亞麻酸。脂肪酸殘基可能是單個(gè)殘基或者兩個(gè)或多個(gè)殘基的混合體。它們可從天然的或合成的來源，如脂和油衍生而來。商業(yè)途徑獲得的甘油酯可以直接用，也可將其通過脂肪酶合成，包括特異性酶和非特異性酶，這些酶將脂肪酸放置在特定的位置(如1；2；1，2；1，3)和特定的外消旋結(jié)構(gòu)上等。例如，吸附在1g硅膠上的甘油(0.92g)懸浮在20ml叔丁基甲醚中。將乙烯辛酸酯(3.4g)和來自Rhizopus delemar的脂肪酶(50mg)加入懸浮液中。室溫下攪拌混合物96小時(shí)并通過TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。過濾除去固相成分和蒸發(fā)溶劑后，可得到粗的反應(yīng)混合物，其含有大約91％的1，3-雙辛酸甘油酯。
水溶性聚合物可以是這樣一些物質(zhì)，其可以使甘油酯在水性溶液中的親水性(優(yōu)選不使用表面活性劑即可完全溶解)，特別是用于疫苗給藥的生理上可接受載體。理想的水溶性聚合物與施用部位組織，特別是粘膜具有生物相容性。適合的具有這些特性的水溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇，聚乙二醇的衍生物(包括但不限于氨基-PEG，親核性-PEG，PEG-硫醇，PEG-琥珀酸酯，PEG-琥珀酰亞胺，PEG-tresylate，羧甲基化-PEG，PEG-丙酸，PEG-硅烷，PEG-磷脂，生物素-PEG，PEG-鄰吡啶基二硫化物，呋喃糖，丙二醇，葡聚糖和糖類。
優(yōu)選的是具有約2到30個(gè)聚乙二醇單元(PEG2-30)的聚乙二醇聚合物，其中最為優(yōu)選的是含3到6個(gè)單元聚乙二醇的聚合物。一份或兩份PEG，其它水溶性聚合物或化合物可以合并在甘油酯分子式中。水溶性部分可以在甘油酯的R1，R2和R3任一位置上。
聚合物可通過化學(xué)反應(yīng)或酶反應(yīng)形成的共價(jià)鍵掛接在甘油酯上。聚合物可以酰化或通過酯鍵連接在甘油酯上，例如，通過酯酶介導(dǎo)的合成。例如，溶解縮酮(solketal)可與在三乙醇胺和氯仿中的聚合物氯化物混合，隨后通過在稀醋酸溶液中加熱，使游離甘油鍵去保護(hù)。三乙胺和4-二甲基氨基吡啶中過量的己酰氯作為催化劑，促使脂肪酸與游離甘油鍵連接。結(jié)果是這種合成物為己酰/聚合物甘油酯。
在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，基團(tuán)R1，R2和R3中的一個(gè)或兩個(gè)由結(jié)合抗原所取代?？乖ㄟ^共價(jià)鍵結(jié)合于甘油酯部分。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，組合物包含甘油單酯和甘油二酯的混合物，兩者的體積比例(v/v％)在范圍0.1∶99.9到99.9∶0.1內(nèi)，優(yōu)選的范圍是從5∶95到95∶5。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，水溶性聚合物是聚氧乙烯的PEG3-6殘基(有3-6個(gè)聚氧乙烯單元)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所描述的組合物，其中的甘油酯的結(jié)構(gòu)選自下列分子式組

其中的R1和R2如上所定義。
在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，R1，R2和R3選自飽和C6-14脂肪酸，優(yōu)選飽和C8-10脂肪酸。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，甘油酯的重量百分含量從大約0.1％到大約99％，優(yōu)選從大約0.5到大約20％，更優(yōu)選從大約1％到大約15％。在本發(fā)明的一特定實(shí)施方案中，甘油酯中的手性碳為S-或R-型。
本發(fā)明佐劑組合物調(diào)控對(duì)抗原的免疫反應(yīng)，也就是說，免疫原或疫苗組合物能夠激發(fā)接種寄主體內(nèi)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。例如，對(duì)病原體抗原的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明涉及抗原可以與一種或多種佐劑結(jié)合，這種配制物可用于引起脊椎動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)體內(nèi)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。例如，抗原可從包括下列物質(zhì)(但不限于這些物質(zhì))的群組中選擇破傷風(fēng)毒素(tetanus toxin)，流行性感冒病毒，白喉類毒素，IIIVgp 120，IgA-蛋白酶，胰島素肽B，弧菌糖(vibriose)，沙門氏菌，Spongosporasubterranea，呼吸道合胞病毒(RSV)(例如RSV亞單位疫苗)，Haemophilusinfluenza外膜蛋白質(zhì)，Helicobacter pylori脲酶，Neisseriameningitidis和N.gonorrohoeae重組菌毛蛋白或者其中保留有刺激免疫反應(yīng)能力的部分。給定抗原一部分的激發(fā)免疫反應(yīng)能力，可通過本領(lǐng)域已知的方法測定，例如針對(duì)某部分中特定肽的酶免疫分析，檢測能夠識(shí)別特定部分(體液反應(yīng))的抗體；或者針對(duì)該部分中特定肽的延遲類型過敏性分析，檢測其中的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
術(shù)語“抗原”意在包括含有一個(gè)或多個(gè)抗原決定部位的分子，抗原決定部位刺激寄主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液，細(xì)胞和/或分泌性免疫學(xué)反應(yīng)。本發(fā)明抗原可以是抗原的一亞單位，也可以是殺死的，減毒的或滅活的細(xì)菌，病毒，原生動(dòng)物，真菌，寄生蟲或其它的微生物?？乖赡苁牵绲鞍踪|(zhì)，肽，多糖，脂類或DNA抗原。合適的抗原可從以下物質(zhì)分離例如，巴斯德氏菌屬(Pasteurella)，放線菌屬(Actinobacillus)，衣原體屬(Chlamydia)，Morasella，奈瑟氏菌屬(Neisseria)，鏈球菌屬(Streptococcus)，嗜血桿菌屬(Haemophilus)，沙門氏菌NTK(Salmonella)，艾美球蟲屬(Eimeria)的物種，以及輪狀病毒，皰疹病毒(例如BHV-1，EHV-1)，PRV，細(xì)小病毒、狂犬病病毒，流感病毒，副流感病毒，肝炎病毒，HIV，細(xì)小核糖核酸病毒，腫瘤抗原，激素，激素類似物等等。
在按照本發(fā)明的配方中的抗原適于誘導(dǎo)接種疫苗、免疫、變態(tài)反應(yīng)治療、癌癥治療、傳染性疾病治療、自身免疫疾病治療和受免疫系統(tǒng)影響的疾病的治療。因此，抗原可以是疫苗，如抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗蛋白感染素(朊病毒)、抗寄生蟲疫苗或組分，這樣的疫苗可以由諸如IgA-蛋白酶、蛋白質(zhì)p38、蛋白質(zhì)p43或粘多糖酶之類的微生物產(chǎn)生?？乖部梢允亲儜?yīng)原，如房塵微粒(house dust mite)、馴養(yǎng)貓變應(yīng)原、黑麥草花粉、短豚草花粉、蠓、卵白、牛奶蛋白質(zhì)、蜜蜂毒液、白面大黃蜂變應(yīng)原等或負(fù)責(zé)誘導(dǎo)自免疫疾病(如髓磷脂、胰島素肽B等等)的組分?？乖部梢杂米鳛橹委熤T如皰疹、HIV、乳頭狀瘤(pappiloma)、念珠菌屬、多發(fā)性硬化癥之類的傳染性疾病，治療諸如糖尿病、甲狀腺機(jī)能減退和甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、牛皮癬、關(guān)節(jié)炎之類的自身免疫疾病或治療癌癥的疫苗。
適用于本發(fā)明疫苗組合物的抗原包括任何能夠產(chǎn)生抗體或特異性定向該脊椎動(dòng)物體(暴露于抗原中)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的實(shí)體?？梢允褂靡换蚨喾N抗原。抗原可以得自包括病毒、細(xì)菌、支原體、真菌、原生動(dòng)物和其它寄生物的病原微生物。此外，抗原也可以得自微生物以外的其它源，如癌細(xì)胞或變應(yīng)原?？乖梢允侨炕虿糠植≡⑸?，或有機(jī)體有關(guān)的全部或部分蛋白質(zhì)、糖蛋白、糖脂、多糖或與脂多糖。
抗原可以得自其中或抗原為疫苗目的產(chǎn)生自其中的病原微生物是傳染性疾病領(lǐng)域所熟知的，例如《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》Medical Microbiology(1990年第二版，J.C.Sherris編輯，Elsevier科學(xué)出版公司，紐約)所列的病原微生物。
可以以顆粒形式或溶解形式利用抗原。制劑尤其適于溶解的抗原，然而，顆粒形式也易于制備成制劑。就接種和免疫來說，顆粒形式常常是有利的，然而，對(duì)于誘導(dǎo)耐受性(例如，對(duì)于治療變應(yīng)性和自身免疫疾病)來說，溶解形式的抗原是優(yōu)選的。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法，如ELISAs、血細(xì)胞凝集測定和中和測定，可以評(píng)價(jià)按照本發(fā)明的、單獨(dú)或于顆?？乖Y(jié)合的佐劑的免疫輔助活性。正如本文所使用的，“免疫輔助活性”旨在于意指在佐劑和抗原施用于其中的宿主中加強(qiáng)免疫反應(yīng)的能力。典型地，佐劑以相同的混合物或組合物形式(參見，例如國際公開號(hào)WO93/05789)，或者在同一時(shí)間以分開的組合物或制劑形式與抗原一起施用?？乖梢耘c佐劑結(jié)合(例如共價(jià)結(jié)合)或僅僅與佐劑混合。佐劑也可以在施用抗原之前或之后施用。佐劑活性包含但不限于加強(qiáng)抗原的免疫反應(yīng)的能力(通過增加抗原的免疫原性或通過減少產(chǎn)生免疫反應(yīng)所需的抗原劑量和水平來加強(qiáng))。
正如本文所使用的，與特定抗原的“免疫反應(yīng)”或“免疫性反應(yīng)”旨在于包含分泌物、細(xì)胞、體液的產(chǎn)生或抗體介導(dǎo)的與抗原的反應(yīng)(或一般性反應(yīng))。在免疫的宿主中的反應(yīng)的表現(xiàn)可以包含抗體(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體)的產(chǎn)生，B和/或T淋巴細(xì)胞的增殖，識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的刺激，T細(xì)胞群的暴露和導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的分化、激活或生長的信號(hào)的加強(qiáng)。
典型地，本發(fā)明的佐劑的施用將導(dǎo)致或產(chǎn)生與感興趣抗原之間的加強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在本上下文中，“加強(qiáng)的”旨在于意指在有佐劑的情況下，與抗原之間的免疫反應(yīng)在數(shù)量上大于和/或在質(zhì)量上好于缺少佐劑時(shí)的免疫反應(yīng)。利用常規(guī)方法，例如利用制劑(包含佐劑和抗原)與適當(dāng)對(duì)照之間的放射免疫測定或ELISA的抗體滴度比較，可以實(shí)現(xiàn)存在或缺少佐劑的免疫反應(yīng)的比較。加強(qiáng)的免疫反應(yīng)可能是對(duì)個(gè)體的免疫系統(tǒng)的直接影響的結(jié)果(例如加強(qiáng)與抗原之間的反應(yīng)的T和B細(xì)胞引導(dǎo))，或者可能是由于抗原向粘膜的更有利呈遞(例如通過提供與粘膜之間的更好的粘連以使抗原和粘膜之間能長期地接觸，或者增強(qiáng)抗原通過粘膜的吸收作用，如通過增加粘膜的透過性)所致。
正如本文所描述的，本發(fā)明的佐劑可以用作為增強(qiáng)抗原的免疫反應(yīng)的佐劑。在特定具體實(shí)施方案中，佐劑是粘膜佐劑。例如，佐劑可以用于使哺乳動(dòng)物受到免疫而抗具體的病原體或亞抗原的組合物、或者引導(dǎo)特定抗原的免疫反應(yīng)的組合物中。
本發(fā)明方法包含向哺乳動(dòng)物(尤其是人或靈長類動(dòng)物)施用免疫學(xué)有效劑量的、包含抗原和佐劑量的本發(fā)明佐劑的免疫原性或疫苗組合物。正如本文所使用的，“佐劑量”或“有效量”的佐劑旨在于意指加強(qiáng)共施用的抗原的免疫反應(yīng)的量。例如，典型地，大約0.01％至大約40％(尤其是大約0.1％至大約20％)的劑量將有效地提供佐劑效應(yīng)；然而，這些劑量范圍的變化將取決于具體的佐劑。此外，具體的劑量將取決于接受治療的哺乳動(dòng)物的年齡、重量和治療狀況以及施藥方法。合適的劑量易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
疫苗或免疫原性組合物可隨意地以藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體(例如生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水、水、葡萄糖、乙醇諸如丙三醇或丙二醇之類的多元醇或其組合物)施用。按照本發(fā)明的制劑可以是懸液、乳劑或分散劑，并且可以提供與分散劑或濕潤劑、懸浮試劑和/或一或多種防腐劑混合的佐劑。例如，合適的分散劑或濕潤劑是天然產(chǎn)生的磷脂(如卵磷脂或大豆卵磷脂)，氧化乙烯與例如脂肪酸、長鏈脂肪醇或偏酯(得自脂肪酸)和己糖醇或己糖醇酐的縮合產(chǎn)物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇一油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯等)。例如，合適的懸浮試劑是天然產(chǎn)生的樹膠(如阿拉伯膠、黃原膠或黃蓍膠)；纖維素，如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素(如AvicelRC 591)、甲基纖維素；藻酸鹽，如藻酸鈉等。用于按照本發(fā)明的制劑中的防腐劑的合適例子是對(duì)羥基苯甲酸酯類，如對(duì)-羥基苯甲酸甲基或丙基酯和苯扎氯銨。
對(duì)于在直腸或陰道粘膜方面的應(yīng)用，按照本發(fā)明使用的合適制劑包含栓劑(乳劑或懸液類型)、灌腸劑和直腸明膠膠囊(溶液或懸液)。藥學(xué)上可接受的合適栓劑基質(zhì)包含可可豆脂、酯化的脂肪酸、用甘油處理過的明膠和各種如聚乙二醇和聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯一樣的水溶性或水?dāng)U散性基質(zhì)。也可以摻入各種添加劑，如增強(qiáng)劑或表面活性劑。
對(duì)于在鼻粘膜方面的應(yīng)用，鼻噴霧和用于吸入的氣霧劑是按照本發(fā)明使用的合適組合物。在典型的鼻用制劑中，活性物質(zhì)以可選分散于合適載體中的顆粒制劑形式存在。存在于組合物中的藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑以及可有可無的藥學(xué)上可接受的其它物質(zhì)(如稀釋劑、增強(qiáng)劑、調(diào)味劑、防腐劑等等)，均可以本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法按照常規(guī)藥學(xué)實(shí)踐選得。在施用按照本發(fā)明的鼻用制劑之后，抗體可以吸附在鼻粘膜上。一般認(rèn)為，相比于例如使用液體載體(如包含穿透增強(qiáng)劑或促進(jìn)劑的液體載體)來說，抗體在粘膜上的吸附將產(chǎn)生較少的刺激效應(yīng)。適于施用本發(fā)明制劑的其它粘膜表面是鼻、肺、口、眼、耳、胃腸道、生殖道、陰道、直腸或皮膚或魚的鰓。這樣的制劑也適于在植物的種子或葉上使用。
對(duì)于在皮膚上的使用，按照本發(fā)明的制劑可以包含常規(guī)的、無毒的、藥學(xué)上可接受的、包括微囊和脂質(zhì)體的載體和賦形劑。制劑包括乳膏、軟膏、洗液、搽劑、凝膠、水凝膠、溶液、懸液、棒狀物、噴霧、糊劑、膏藥和其它種類的透皮的藥物釋放系統(tǒng)(transdermal drug deliverysystems)。在實(shí)施方案中，制劑可以以鼻用噴霧劑、鼻用粉劑、鼻滴劑鼻用泡沫或鼻用軟膏形式施用于粘膜表面或鼻腺樣增殖體上，或者以口用噴霧劑、口用滴劑、口用粉劑、口用泡沫或口用軟膏直接地施用于口腔或口部的扁桃體上。制劑也可以是滴眼劑形式。
藥學(xué)上可接受的賦形劑可以包括乳化劑、抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、穿透增強(qiáng)劑、螯合劑、凝膠形成劑、軟膏基質(zhì)、香料和皮膚防護(hù)劑。乳化劑的例子是天然產(chǎn)生的樹膠(如阿拉伯膠或黃蓍膠)、天然產(chǎn)生的磷脂(如大豆卵磷脂)和脫水山梨糖醇一油酸酯衍生物?？寡趸瘎┑睦邮莃urylated羥基苯甲醚(BHA)、抗壞血酸及其衍生物，生育酚及其衍生物，丁基化羥基苯甲醚和半胱氨酸。防腐劑的例子是對(duì)羥基苯甲酸酯類(如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯)和潔而滅。濕潤劑的例子是甘油、丙二醇、山梨醇和尿素。穿透增強(qiáng)劑的例子是丙二醇、DMSO、三乙醇胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮及其衍生物，四氫呋喃甲醇和Azone。螯合劑的例子是EDTA鈉鹽、檸檬酸和磷酸。其它賦形劑的例子是食用油，如杏仁油、蓖麻油、可可豆脂、椰子油、玉蜀黍油、棉籽油、亞麻籽油、橄欖油、棕桐油、花生油、罌粟籽油、菜籽油、芝麻油、豆油、向日葵籽油和茶籽油；和聚合物類的食用油，如carmelose、sodium carmelose、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、脫乙酰殼多糖、果膠、黃原膠、角叉菜膠、槐樹豆膠、阿拉伯樹膠、明膠和藻酸鹽。軟膏基質(zhì)的例子是蜂蠟、石蠟、鯨蠟素、植物油、脂肪酸的脫水山梨糖醇酯(Span)、聚乙二醇和脂肪酸的脫水山梨糖醇酯與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物(如聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯(吐溫))。以上提到的用于局部施用的制劑也可以應(yīng)用于皮膚、魚腮或植物外表上或植物種子中。本發(fā)明的制劑也適于直接使用或適于引入身體的有關(guān)管孔中，如直腸、尿道、陰道或口腔。制劑可以簡單地直接施用于將要免疫的部分上，如粘膜。
許多粘膜制劑需要一些專用的賦形劑混合物。因此，許多制劑可以包含一或多種表面活性劑和/或吸收促進(jìn)劑和/或吸水聚合物和/或抑制酶促降解物質(zhì)和/或醇、有機(jī)溶劑、油、pH控制劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、HLB控制劑、粘度控制劑、防腐劑、滲透壓控制劑、噴射劑、排氣劑、水及其混合物。表面活性劑可以選自壬苯聚醇、辛苯聚醇、吐溫、司盤鈉、月桂基硫酸酯、脫水山梨糖醇一棕櫚酸酯；吸收促進(jìn)劑可以選自聚氧乙烯醇醚、膽汁酸鹽及其衍生物、梭鏈孢酸及其衍生物、油酸、卵磷脂、溶血卵磷脂、吐溫20-85、單-/雙-和三甘油酯、shitosan、環(huán)糊精；吸水聚合物可以選自glycofurol及其衍生物、聚乙二醇200-7500及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、丙二醇、明膠、纖維素及其衍生物；抑制酶促降解的物質(zhì)可以選自抑肽酶、DFP、聚羰乙烯；油可以選自植物油、豆油、花生油、椰子油、玉米油、橄欖油、向日葵籽油、Miglyols；pH控制劑可以選自乙酸、鹽酸、硝酸、偏磷酸鉀、磷酸鉀、乙酸鈉、氨、碳酸鈉、氫氧化鈉、硼酸鈉、三乙醇胺；增溶劑可以選自乙醇、異丙醇、water glycofurol、聚乙二醇200-7500；穩(wěn)定劑如環(huán)糊精；HLB控制劑可以選自吐溫20-85、司盤20-80、Brij30-98、阿拉伯膠；粘度控制劑可以選自纖維素及其衍生物、吐溫及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、鯨蠟醇、甘油、丙二醇、山梨醇、明膠；防腐劑可以選自苯扎銨鹽、苯甲醇、苯酚、硫柳汞、硝酸苯汞、苯乙醇、氯丁醇、氯化十六烷基吡啶；滲透壓控制劑可以選自右旋糖、氯化鈉、甘露醇；以及噴射劑可以選自二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、三氯氟甲烷和其它無臭氧損害的噴射劑(如丁烷)；排氣劑可以是氮。
對(duì)于液體組合物來說，最本質(zhì)的問題是有效量的抗原可通過適量體積施用。對(duì)于人類受體，通過鼻腔施用的體積應(yīng)不超過約300μl。過量體積將不能被患者接受，并且提前從鼻孔或從后面的咽部排出。結(jié)果是一部分抗原和/或疫苗在吸收部位損失掉了。體積量優(yōu)選是從大約20μl到大約125μl而且最好是施用到一個(gè)鼻孔中。在口腔或直腸處施用，用藥體積應(yīng)不超過10ml。施用于眼部或耳部時(shí)，用藥體積應(yīng)不超過300μl。肺部施用，體積應(yīng)不超過2ml。陰道內(nèi)施用，用藥體積不超過30ml。腸胃道內(nèi)施用，用藥體積不超過100ml。
疫苗組合物也可選擇性的包含其它附加的組分，如緩沖劑，防腐劑，乳化劑，佐劑；佐劑如植物油或其乳液；表面活性物質(zhì)，如十六胺，十八烷氨基酸酯，十八胺，溶血卵磷脂，溴化二甲基雙十八基銨，N，N-dicoctadecyl-N′-N′bis(2-羥乙基-丙二胺)，甲基十六基甘油；多胺，如吡喃，葡萄糖硫酸酯，聚IC，carbopol；肽，如胞壁酰基二肽，二甲基甘氨酸，他福新；刺激免疫復(fù)合物，油乳劑，脂多糖類，如MPL(3-O-脫?；鶈瘟柞Ｖ珹(RIBI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，蒙大拿)；礦物膠，以及免疫刺激性寡核苷酸。本發(fā)明的抗原也可混入下列物質(zhì)脂質(zhì)體，cochleates，能進(jìn)行生物降解的聚合物如聚乳酸，聚糖脂以及聚乳酸-連-聚糖脂，或者ISCOKS(免疫刺激性復(fù)合物)，也可能是使用的補(bǔ)充的活性成分。
本發(fā)明抗原也可和細(xì)菌類毒素以及他們的減毒衍生物(作為佐劑或載體分子)一起施用。其它適合的載體分子包括血清白蛋白，鍵孔糾纏(keyholelimpet)血藍(lán)蛋白，免疫球蛋白分子，免疫球蛋白，卵清蛋白，多糖(瓊脂糖凝膠，瓊脂糖，纖維素)，滅活病毒微粒，氨基酸共聚體。本發(fā)明抗原也可和淋巴因子一起施用，包括但不限于，白介素-2，IFN-γ和GM-CSF。在施入這些DNA編碼的抗原后，其也可在活體內(nèi)得到表達(dá)。
疫苗可通過不同的途徑施用給人或動(dòng)物，包括但不限于，腸胃外，動(dòng)脈內(nèi)，皮內(nèi)，透皮(例如施用緩釋聚合物)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，舌下，靜脈內(nèi)，皮下，口腔或鼻內(nèi)施用途徑。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過粘膜施用組合物。在這種疫苗中抗原的用量根據(jù)抗原不同而不同。調(diào)節(jié)和人為控制所用的傳統(tǒng)載體抗原的劑量范圍，以適應(yīng)本發(fā)明疫苗，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的事情。本發(fā)明疫苗可用于治療未成年或成年的溫血?jiǎng)游铮貏e是人。施用本發(fā)明的免疫原或疫苗組合物也可使用基因治療方法完成(參見，如美國專利5,580,859和已公開的PCT申請(qǐng)公開WO93/19183(Robinson等)和WO97/44446(Malone等))。
本發(fā)明以粘膜佐劑為佐劑具有許多重要的潛在意義。粘膜的輔助性可增加免疫體中產(chǎn)生的保護(hù)抗原的濃度，該保護(hù)抗原是抵抗粘膜給予的抗原的。作為結(jié)果，有效的疫苗對(duì)抗原的需求要少于通常的需求量。這種抗原需求量的減少可導(dǎo)致配制十分困難和昂貴疫苗的廣泛應(yīng)用。另外，若抗原是弱抗原或弱免疫原，利用本發(fā)明的佐劑可增強(qiáng)其引起免疫反應(yīng)的能力，尤其是通過粘膜施用時(shí)。當(dāng)在正常有效粘膜免疫法需要濃度下抗原有毒時(shí)，它也可提供安全的接種疫苗。通過減少抗原的量，也就減小了發(fā)生毒性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。它也可通過另一途徑提供安全的接種疫苗，就是使抗原或疫苗配制物通過粘膜施用途徑是安全的，而通過腸道外施用途徑則是毒性的。
典型地，為了刺激“保護(hù)性”免疫反應(yīng)，接種規(guī)定要求在一段時(shí)期(幾星期或幾個(gè)月)內(nèi)施用疫苗。“保護(hù)性”免疫反應(yīng)是足夠阻止疫苗所針對(duì)特定的某種或某些病原體的感染或減少感染的嚴(yán)重程度(與沒有免疫反應(yīng)時(shí)的感染嚴(yán)重性相比)的免疫反應(yīng)。利用本發(fā)明佐劑可能減少有效接種規(guī)定的時(shí)間過程。在一些情況下，單一劑量的本發(fā)明佐劑就可能導(dǎo)致產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)。本發(fā)明疫苗組合物在治療疾病上也是有用的，可減小已受感染患者中發(fā)作癥狀人數(shù)數(shù)量和發(fā)作癥狀的嚴(yán)重程度。本發(fā)明疫苗組合物也可用作為腸道外施用抗原的口腔輔助劑免疫。
根據(jù)本發(fā)明描述的配制物特別適用于人，包括幼兒，兒童，青年，成年人和老人。該配制物的性質(zhì)就是增強(qiáng)對(duì)各種病原體的免疫反應(yīng)，因此它可用于不同條件下的受驗(yàn)者，比如患病的人，例如脾切除患者，癌癥患者，使用抗癌藥物的患者，使用平喘藥物的患者，使用消炎藥物的患者，甲亢或甲狀腺功能衰退的患者。
本發(fā)明的配制物也適用于動(dòng)物，如馬，羊，狗，貓，牛，豬，山羊，兔子；野生動(dòng)物如小鼠，大鼠，豚鼠，倉鼠，野兔，野狗，野貓或者猴子；鳥類如雞，火雞，鴨子，鴕鳥，熱帶鳥或野生鳥；或者魚類，比如飼養(yǎng)魚類，例如鮭魚或水族館魚類。對(duì)于動(dòng)物，每一組分濃度需要調(diào)配。例如對(duì)于羊來說，鼻腔濕度很大，配制物中就需要增加有吸水賦形劑；對(duì)于魚來說，配制物需要微囊包封，或者是能夠被魚腮吸收的其它形式。
本發(fā)明也可用于增加植物體內(nèi)的生物活性(例如致免疫性)和/或吸收生物活性劑(例如抗原)。能夠和本發(fā)明佐劑組合物協(xié)同使用的生物活性劑可能是，例如，除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，植物生長調(diào)節(jié)劑，肥料和疫苗。需要適合的生物活性劑可通過商業(yè)渠道獲得，通常可按照商家建議的比例使用。用于本發(fā)明配制物中的特定量生物活性劑成分，隨以下條件不同而變化，與生物活性劑接觸的特定植物或植物生長介質(zhì)，通常使用的場所(也就是被遮蓋地域(如溫室)相對(duì)的外露地域(如田間))，以及配制物的類型氣溶膠、溶劑、固體制劑。該配制物可用于任何類型植物，包括但不限于，草類(例如，黑草，雀麥草，馬唐曹，稗草，牛筋草，黑麥草(Italian grass))，谷類植物(例如小麥，燕麥，高梁，玉米，甜菜，canola，大豆，棉花，煙草，馬鈴薯，果樹，黃瓜，番茄，香蕉，豆類，辣椒，甜瓜類)以及觀賞植物(灌木，樹，花)。配制物可施用于葉，種子，果實(shí)，樹皮或樹干，或者可以與生長培養(yǎng)基(泥炭或土壤)混合在一起。配制物可以單獨(dú)施用(例如用噴霧器)或集中施用(例如從飛機(jī)上)。利用本發(fā)明的佐劑配制物給植物釋放抗原，可使植物對(duì)病原體具有免疫性(例如，通過產(chǎn)生植物抗體或激活局部或全身的獲得的抗性(參見，例如，Agrios，植物病理學(xué)P1ant Pathology，第四版(學(xué)術(shù)出版社Academic Press，1997)，108-114頁，以及其中引用的參考文獻(xiàn)))。
提供下面的實(shí)施例是為了解釋本發(fā)明，并不是構(gòu)造對(duì)本發(fā)明的限制范圍。貫穿在本申請(qǐng)中的所有引用(參考文獻(xiàn)，專利及公開的專利申請(qǐng))內(nèi)容，在這里都合并于此作為參考。實(shí)施例實(shí)施例I-破傷風(fēng)類毒素對(duì)小鼠(Balb/c)進(jìn)行鼻內(nèi)施用5μl的含1.5μl破傷風(fēng)類毒素(Lyfjathroun，冰島雷克雅末克)的配制物，配制物配方如下(I)等滲鹽水；(II)20％PEG6-CCG(Softigen；Hüls AG，Witten，德國)，是在等滲鹽水中的含6個(gè)聚氧乙烯(PEG6)單元的辛酸和癸酸單甘油酯/甘油二酯混合物；(III)20％的用吐溫20(22∶78)溶解在等滲鹽水中的辛酸和癸酸甘油單酯/甘油二酯混合物(CCG-多乙氧基醚20(CCG-PS)；WO94/17827)(Imwitor)。在第一次接種后四周，小鼠再次接受疫苗含量相同的接種。一周后，提取血液樣品，獲得如下的血清IgG反應(yīng)表1

這些結(jié)果表明，與WO94/17827中描述的疫苗配制物(配制物III)相比，無毒的PEG5-CCG(配制物II)產(chǎn)生了顯著增強(qiáng)的IgG反應(yīng)。實(shí)施例II流感病毒用流行性感冒病毒疫苗(來自Harbin株的HA分子)對(duì)二十只Balb/c小鼠免疫。用0％，1％，5％和20％根據(jù)本發(fā)明的PEG6-CCG配合流行性感冒HA分子。在首次免疫后四周再次對(duì)小鼠進(jìn)行疫苗含量相同的注射接種。注射接種一周后，得到以下結(jié)果％佐劑Cone.IgG(血清)0％ 1.11％ 4.25％ 6.820％ 8.4實(shí)施例III對(duì)小鼠(Balb/c)進(jìn)行鼻內(nèi)施用5μl配制物，配制物含20％PEG6-CCG，是在等滲鹽水中的含6個(gè)聚氧乙烯(PEG6)單元的辛酸和癸酸甘油單酯/甘油二酯混合物，加入的抗原如下(I)1μg HA流行性感冒病毒疫苗/小鼠；(II)1.5Lf(絮狀反應(yīng)單位)破傷風(fēng)類毒素疫苗；(III)1.5Lf白喉類毒素疫苗；(IV)1μg rgp 120HIV疫苗；(V)1μg作為疫苗的IgA-蛋白酶；以及(VI)1μg胰島素肽B。在第一次接種后四周，小鼠接受疫苗含量相同的輔助劑。一周后，提取血液樣品并分析。實(shí)施例IV破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素對(duì)人類志愿者從鼻內(nèi)施用100μl的配制物，配制物含12Lf破傷風(fēng)類毒素和12Lf白喉類毒素疫苗，各配方如下(I)等滲鹽水；(II)PEG6-CCG，是在等滲鹽水中的含6個(gè)聚氧乙烯(PEG6)單元的辛酸和癸酸甘油單酯/甘油二酯混合物；(III)等滲鹽水中5％的PEG-CCG；(IV)等滲鹽水中1％的PEG-CCG。在第一次接種后四周，參與者再次接受疫苗含量相同的接種。在研究期間，每周從每一志愿者身上取樣(血液和唾液樣品)，進(jìn)行IgG和IgA分析。實(shí)施例V對(duì)小鼠(Balb/c)施用在20％PEG6-CCG中的1.5Lf的破傷風(fēng)類毒素疫苗，PEG6-CCG是在等滲鹽水中的含6個(gè)聚氧乙烯(PEG6)單元的辛酸和癸酸甘油單酯/甘油二酯混合物。配制物施用過程如下(I)5μl鼻內(nèi)施入；(II)5μl口腔粘膜施入；(III)5μl陰道施入；(IV)5μl直腸施入；以及(V)5μl皮膚施入。在第一次接種后四周，小鼠接受疫苗含量相同的輔助劑。一周后，提取血液樣品。
對(duì)十五只小鼠(Balb/c)用流行性感冒疫苗(來自Nanchang株的HA分子)接種。流行性感冒分子用5％根據(jù)本發(fā)明的PEG6-CCG配制，通過鼻腔，口腔和直腸途徑施用。在首次接種后四周，再次以相同的配制物含量及相同的施用途徑為小鼠注射接種。一周后，得到以下結(jié)果途徑吸光度(OD 492nm)鼻腔 0.300口腔 0.334
直腸 0.155實(shí)施例VI一種配制物含10％的PEG6-CCG，是在等滲鹽水中的含6個(gè)聚氧乙烯(PEG6)單元的辛酸和癸酸甘油單酯/甘油二酯混合物，選定的疫苗組合物施用方法如下(I)5Lf破傷風(fēng)類毒素施用給小鼠；(II)6Lf破傷風(fēng)類毒素施用給兔子；(III)20Lf破傷風(fēng)類毒素施用給綿羊；(IV)12Lf破傷風(fēng)類毒素施用給人類志愿者；(V)3μg弧菌糖(vibriose)疫苗施用給鮭魚；(VI)3μg沙門氏菌疫苗施用給小雞；以及(VII)3μg Spongosporasubterranea抗原施用給馬鈴薯植株。在第一次接種后四周，施用疫苗含量相同的輔助劑。一周后，抽取血液樣品(除了(VII)中的植物樣品)，對(duì)于(VII)中的植物，在施用輔助劑一個(gè)月后用真菌對(duì)其進(jìn)行感染。實(shí)施例VII對(duì)小鼠(Balb/c)進(jìn)行鼻腔施用5μl的配制物，配制物含有(I)破傷風(fēng)類毒素或(II)肺炎球菌，協(xié)同辛酸和癸酸的甘油單酯和甘油二酯。這種前疫苗的施用濃度為20％。在第一次接種后四周，小鼠接受疫苗含量相同的輔助劑。一周后，抽取血液樣品。
為了估計(jì)通過鼻腔施用之后PEG6-CCG對(duì)疫苗抗原的作用，利用一定量的病毒和細(xì)菌抗原作實(shí)驗(yàn)，這些抗原包括流行性感冒疫苗，呼吸道合胞病毒(RSV)亞單位疫苗，未分類的Hemophilus influenta外膜蛋白(OMPs)，Helicobacter pylori脲酶，Neisseria meningitides與N.gonorrhoeae的重組菌毛蛋白。該分析的結(jié)果在下列實(shí)施例中闡明。實(shí)施例VIII流行性感冒疫苗該實(shí)施例總結(jié)對(duì)佐劑輔助效果的評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)CCG-PS和PEG-CCG對(duì)A/Udorn疫苗(monopool分裂流行性感冒疫苗，Wyeth Lederle疫苗以及兒科學(xué)West Henrietta，NY)免疫反應(yīng)的輔助作用，評(píng)價(jià)局部免疫反應(yīng)對(duì)呼吸道的保護(hù)作用(免受遞減疾病感染)。
表2

BALB/c小鼠，每組8只Vax0天，19天和38天感染第70天病毒滴定第74天HA-血細(xì)胞凝集素從ELISA和血細(xì)胞凝集抑制分析的血清學(xué)數(shù)據(jù)表明，與CCG-PS配制物相比，PEG6-CCG配制物引起的血清IgGI和HI滴度較高。與腸道外施用標(biāo)準(zhǔn)疫苗比較，從鼻腔施用PEG6-CCG配制物產(chǎn)生了全身抗體反應(yīng)。
ELISPOT數(shù)據(jù)證明了PEG6-CCG象第一代CCG-PS配制物的能力，增強(qiáng)對(duì)流行性感冒疫苗的局部免疫反應(yīng)，這一結(jié)論同樣可通過下列事實(shí)得到證明與僅通過鼻腔施用疫苗相比，發(fā)現(xiàn)通過PEG6-CCG施用疫苗的受體鼻腔淋巴組織中分泌IgA的B細(xì)胞數(shù)量增加。通過肌內(nèi)施用疫苗并不產(chǎn)生高于未免疫小鼠背景值的局部免疫反應(yīng)。
表3 PEG6-CCG配制物促進(jìn)對(duì)鼻腔施入的流行性感冒疫苗的體液抗體反應(yīng)

如下表所示，先前暴露于感染病毒的小鼠，在隨后用同種病毒侵染時(shí)得到完全保護(hù)。從肺或鼻組織不能再回收病毒。相反的，在未免疫小鼠肺或鼻組織，很容易用A/Udorn病毒感染。小鼠在接受腸胃外或無佐劑施用鼻內(nèi)疫苗后，可從所有小鼠的鼻組織中回收病毒。這些數(shù)據(jù)表明，由CCG-PS和PEG6-CCG輔助的疫苗引起的免疫反應(yīng)，保護(hù)上呼吸道免受病毒的侵染。那些接受有CCG-PS和PEG6-CCG輔助的疫苗(鼻腔施入)動(dòng)物，從其鼻腔組織回收的病毒數(shù)量大大減少。對(duì)下呼吸道的保護(hù)作用明顯獨(dú)立于疫苗組合物及其施用途徑。表4 CCG-PS和PEG6-CCG輔助的鼻內(nèi)流感疫苗引起免疫反應(yīng)保護(hù)上呼吸道免受病毒侵染

200ICID50≤400(檢測時(shí)的分析限制)，所有的陰性樣品都賦值200實(shí)施例IX RSV F蛋白該實(shí)施例總結(jié)對(duì)佐劑輔助效果的評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)CCG-PS和PEG-CCG對(duì)RSV F蛋白免疫反應(yīng)的輔助作用，評(píng)價(jià)局部免疫反應(yīng)對(duì)呼吸道的保護(hù)作用(免受下降疾病感染)。
表5

BALB/c小鼠，每組10只F蛋白特異性血清抗體反應(yīng)-鼻內(nèi)施用帶有F蛋白/PBS的疫苗，引起滴度大約為26,000的循環(huán)IgG抗F反應(yīng)。然而，通過F蛋白與CCG-PS或者PEG6-CCG結(jié)合，在統(tǒng)計(jì)上提高了整個(gè)IgG，IgG1和IgG2a的滴度值(P＜0.05)(見表6)。此外，只有用PEG6-CCG配制的疫苗才引起顯著的血清IgA滴度值。連續(xù)進(jìn)行此項(xiàng)觀察，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)PEG6-CCG的不同免疫屬性。
F蛋白特異性粘膜lg反應(yīng)-IgA，通過對(duì)用F/PEG6-CCG免疫的小鼠的鼻腔和陰道清洗物進(jìn)行觀察，其反映這種疫苗復(fù)合物引起了血清IgA激活(見表6)。本次實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)小鼠鼻腔清洗物中的IgA水平，要高于用活體RSV感染的小鼠水平。
表6用F蛋白和CCG-PS和PEG6-CCG化合物鼻內(nèi)接種的BALB/c小鼠的免疫反應(yīng)<

27天時(shí)抽取小鼠血液樣品，對(duì)每一小鼠樣品通過ELISA分析血清抗體滴度。類似地，在28天的時(shí)候，接取粘膜清洗物樣品并分析抗F蛋白特異性IgG和IgA。IgA在支氣管肺泡清洗(BAW)中檢測。VW＝陰道清洗物，NW＝鼻腔清洗物實(shí)施例X-無分類的Haemophilus influenzae(NTHi)外膜蛋白(OMP)rP4這個(gè)實(shí)驗(yàn)是在BALB/c小鼠體內(nèi)通過鼻腔施入NTHi重組P4蛋白之后，比較CCG-PS和PEG6-CCG粘膜佐劑對(duì)其的活性。
在第0天和21天通過鼻內(nèi)施入疫苗總體積為5μl。在0，21和28天時(shí)抽取小鼠血液樣品。進(jìn)行支氣管肺泡清洗(BAW)和陰道清洗(VW)并在28天時(shí)收集唾液樣品。
釋放在CCG-PS或PEG6-CCG中的重組NTHi外膜P4蛋白，明顯增強(qiáng)了血清IgG抗體滴度(對(duì)重組P4蛋白)。在兩種釋放載體之間，血清IgA和IgG滴度(對(duì)重組P4蛋白)無明顯差別(28天時(shí)p為0.05)。而且，在CCG-PS或PEG6-CCG中的1μg的重組P4蛋白的釋放引起了唾液和陰道清洗物中很好的IgA抗體對(duì)重組P4蛋白滴度值。
很明顯，在特異性抗體滴度方面，PEG6-CCG等于CCG-PS。然而，值得注意的是，只有PEG6-CCG配制物引起了可證實(shí)的rP4特異性鼻內(nèi)IgA抗體反應(yīng)。
表7

，1μg在CCG-PS或PEG6-CCG中的重組P4蛋白的釋放，明顯增加了有反應(yīng)的小鼠數(shù)量(與僅在鹽水中釋放的相比較)。
表8

<p>28天時(shí)的IgG反應(yīng)，滴度值動(dòng)大到小排列。實(shí)施例XI-H.pylori r脲酶這個(gè)實(shí)驗(yàn)是在BALB/c小鼠體內(nèi)通過鼻腔施入10μl重組H.pylori脲酶之后，比較CCG-PS和PEG6-CCG粘膜佐劑對(duì)其的活性。
在0天和21天通過鼻內(nèi)施入疫苗。在0，21和28天時(shí)抽取小鼠血液樣品。進(jìn)行支氣管肺泡清洗(BAW)和陰道清洗(VW)并在28天時(shí)收集唾液樣品。
釋放在CCG-PS或PEG6-CCG載體中的重組H.pylori脲酶蛋白，明顯增強(qiáng)了繼發(fā)的血清IgG抗體滴度(對(duì)重組脲酶蛋白)。兩者在對(duì)重組脲酶蛋白的血清IgG滴度方面無明顯差別。在兩釋放載體之間，對(duì)重組脲酶蛋白的血清IgG滴度無明顯差別(P＞0.05)。然而，在本實(shí)驗(yàn)分析的任一粘膜分泌物中，從CCG-PS或PEG6-CCG中釋放的重組脲酶蛋白，沒有引起可檢測的IgA抗體(對(duì)重組脲酶蛋白)。
表9

血清IgG抗重組脲酶ELISA終點(diǎn)滴度，用在28天時(shí)收集的個(gè)體血清樣品(每組5只)測定。實(shí)施例XII-N.meningiridis r菌毛蛋白在本實(shí)驗(yàn)中，利用N.meningiridis菌毛蛋白作為疫苗抗原研究PEG6-CCG的粘膜佐劑活性。
對(duì)每組(5只)BALB/c小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)接種總體積為10μl，疫苗為5μg的重組N.meningiridis菌毛蛋白(r菌毛蛋白)釋放在20％CCG-PS或5％PEG6-CCG或鹽水中，在0，14，21和28天時(shí)抽取血樣。在30天時(shí)進(jìn)行支氣管肺泡清洗(BAW)和陰道清洗(VW)并收集唾液樣品。
當(dāng)疫苗用PEG6-CCG為載體施用IN后，可證明其明顯的粘膜佐劑效果。28天時(shí)，相對(duì)于空白對(duì)照組(用鹽水配制疫苗的)，對(duì)于接受5μg r菌毛蛋白釋放于PEG6-CCG中配制成的疫苗的小鼠來說，其鼻腔和陰道清洗物中sIgA增加了16和32倍。相對(duì)于PEG6-CCG，CCG-PS配制物鼻腔清洗物中sIgA滴度僅增加了2倍，而陰道清洗物中增加了11倍。這些數(shù)據(jù)表明PEG6-CCG對(duì)于重組N.meningiridis菌毛蛋白蛋白來說，可能是一種改善了的釋放載體。
表10

實(shí)施例XIII-GC r菌毛蛋白在本實(shí)驗(yàn)中，用重組GC菌毛蛋白作為疫苗抗原調(diào)查PEG6-CCG的粘膜佐劑活性。
對(duì)每組(5只)BALB/c小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)接種體積為10μl，疫苗中有10μg重組GC菌毛蛋白(r菌毛蛋白)及有或沒有5％PEG6-CCG，在0，14和28天時(shí)抽取血樣。在29天時(shí)進(jìn)行陰道清洗。
當(dāng)疫苗用PEG6-CCG為載體施用IN后，可證明其明顯的粘膜佐劑效果。28天時(shí)，接受10μg r菌毛蛋白釋放于PEG6-CCG中配制成的疫苗的小鼠，其血清抗r菌毛蛋白IgA和IgG分剮增加了2和5倍。整體細(xì)胞ELISA滴度也稍有增加(10,570對(duì)6,843)。陰道清洗物中sIgA增加4倍以上。
表11

本實(shí)驗(yàn)中未收集鼻腔清洗物本實(shí)驗(yàn)不包括CCG-PS實(shí)施例XIV-評(píng)價(jià)粘膜佐劑的接受和耐受能力在一臨床研究中評(píng)價(jià)兩種粘膜佐劑(CCG-PS和PEG6-CCG)的接受能力和忍受能力。本次研究包括了二十九個(gè)健康個(gè)體(15男，14女)，年齡都在18歲或以上。
處理方法包括五種不同的鼻腔噴射藥劑。前兩種含等滲鹽水的藥劑對(duì)于調(diào)查者和受驗(yàn)者都是明確的。將這兩種鹽水藥劑立即用于兩鼻孔，作為受驗(yàn)者和調(diào)查者評(píng)價(jià)檢測佐劑的比較基礎(chǔ)。其它的藥劑，含有鹽水(NS)，CCG-PS(RV)和PEG6-CCG(SG)，對(duì)于調(diào)查者和受驗(yàn)者都是盲目的。將三種藥劑施用于鼻腔內(nèi)，每種之間間隔30分鐘，施用順序如下表12藥劑1-藥劑2-藥劑3

收集調(diào)查者和受驗(yàn)者兩方的評(píng)價(jià)。調(diào)查者的評(píng)價(jià)，通過調(diào)查者在每次用藥后的三十分鐘內(nèi)給鼻腔內(nèi)打分，對(duì)鼻腔紅色程度、鼻腔分泌的增加和目視副反應(yīng)進(jìn)行綜合判斷。
受驗(yàn)者的評(píng)價(jià)通過說明刺激性給出，將每一藥劑施用后0，5，10，20和30分鐘后的刺激性與已知的鹽水佐劑藥劑相比較。受驗(yàn)者也將每次處理后的刺激感程度按大小排列。
總結(jié)調(diào)查者給定每種佐劑的評(píng)分?？偨Y(jié)受驗(yàn)者在每一時(shí)間點(diǎn)給定每種佐劑的刺激性評(píng)分，每一時(shí)間點(diǎn)受驗(yàn)者的評(píng)分總和起來代表總的刺激性評(píng)分(受驗(yàn)者給定的)。統(tǒng)計(jì)方法是Mantel-Haenszel x2檢驗(yàn)法(MH)。分析中統(tǒng)計(jì)顯著性水平是0.05。
二十三位受驗(yàn)者評(píng)價(jià)CCG-PS為“比鹽水確切具有更大刺激性或更不舒服”(施藥后立即感覺)(見表13)。對(duì)23位受驗(yàn)者中的20位來說，在20分鐘內(nèi)，明顯的刺激性減小到最輕或沒有，其他三人在施藥后30分鐘仍感到強(qiáng)烈刺激性。同時(shí)，調(diào)查者匯報(bào)相對(duì)于這三位受驗(yàn)者的，與CCG-PS有關(guān)的次要(2/3)或主要(1/3)刺激性。
相反的，12位受驗(yàn)者(統(tǒng)計(jì)顯著性不同于CCG-PS)評(píng)價(jià)PEG6-CCG為“比鹽水確切具有更大刺激性或更不舒服”(施藥后立即感覺)(見表13)。對(duì)12位受驗(yàn)者中的9位來說，在20分鐘內(nèi)，明顯的刺激性減輕。12中其他三人及另外一附加的受驗(yàn)者在施藥后30分鐘末仍感到與PEG6-CCG有關(guān)的強(qiáng)烈刺激性。
總結(jié)每一時(shí)間點(diǎn)對(duì)佐劑的刺激性評(píng)分。在0和5分鐘時(shí)間點(diǎn)上，CCG-PS明顯比PEG6-CCG更具有刺激性(P＜0.01，表13)。對(duì)兩種佐劑刺激性的評(píng)分在最終時(shí)間點(diǎn)上并無差別。
在所有與接受3種未知藥劑的刺激性之間進(jìn)行直接比較(也就是，互相比較，不是與鹽水比較)，CCG-PS是最具刺激性的佐劑。根據(jù)受驗(yàn)者中76％的人反映，CCG-PS是最刺激的佐劑。
表15

注意與鹽水比較的差別代碼0＝無不同；1＝略有不同；2＝十分不同注意RS＝先接受CCG-PS再接受Softigen；SR＝先接受PEG6-CCG再接受CCG-PS。
當(dāng)就優(yōu)選的實(shí)施方案特別解釋和描述本發(fā)明時(shí)，應(yīng)由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，其中在形式和細(xì)節(jié)上作出的各種變化，并未偏離本發(fā)明的精神和范圍(附加權(quán)利要求書中限定的)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含i)佐劑，含0.01-70％v/v甘油酯，甘油酯選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組取代甘油單酯，取代甘油二酯和兩者的混合物，這些物質(zhì)具有分子式(I)
其中的R1，R2和R3選自下列物質(zhì)組成的組飽和或不飽和C6-24脂肪酸，水溶性聚合物及其混合物，條件是甘油酯含有至少一個(gè)水溶性聚合物；ii)至少一種抗原；以及iii)可選的生理上可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中脂肪酸選自飽和和不飽和C6-14脂肪酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中脂肪酸選自飽和C8-10脂肪酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中水溶性聚合物是具有2-30個(gè)聚氧乙烯單元的聚氧乙烯PEG2-30殘基，或者其衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中的水溶性聚合物是具有3-6個(gè)聚氧乙烯單元的聚氧乙烯PEG3-6殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中的甘油酯具有選自以下化合物組的結(jié)構(gòu)
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其中取代甘油單酯和取代甘油二酯的％-v/v比例從大約0.1∶99.9到大約99.9∶0.1，優(yōu)選從大約5∶95到大約95∶5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物，其中的甘油酯濃度以重量幾從大約0.1％到大約99％，優(yōu)選從大約0.5％到大約20％，更優(yōu)選從大約1％到大約15％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的組合物，其中甘油酯中的手性碳是S-或R-型，或者兩者的混合形式。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物，其中的抗原以顆粒狀形式存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物，其中的抗原以溶解形式存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步包含一種或多種選自下列的組分表面活性劑，吸收促進(jìn)劑，吸水聚合物，抑制酶降解的物質(zhì)，醇，有機(jī)溶劑，油，pH調(diào)節(jié)劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，HLB調(diào)節(jié)劑，粘度調(diào)節(jié)劑，防腐劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑，噴射劑，空氣交換劑，水及其混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的組合物，其中抗原結(jié)合于佐劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的組合物，其中的R1，R2和R3基團(tuán)中的一個(gè)由結(jié)合抗原替代。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的組合物，是一種藥物組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的組合物，是一種植物用組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16中的組合物，是一種免疫原性的組合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16中的組合物，是一種疫苗組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求15或16中的組合物，其中的抗原用于治療自身免疫疾病。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的組合物在制造施用于人類的藥物中的應(yīng)用。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中所說的施用指通過皮膚表面或粘膜表面施用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中的粘膜表面選自以下粘膜表面鼻，肺，口，眼，耳，胃腸道，gential道，陰道，直腸。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的組合物在施用于植物上的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中的施用指施用于植物，種子的外部表面或生長的培養(yǎng)基。
25.一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引起對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的方法，包括給哺乳動(dòng)物寄主施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-19的組合物。
26.一種釋放抗原至哺乳動(dòng)物粘膜表面的方法，包括給哺乳動(dòng)物寄主施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-19的組合物。
27.一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引起對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的方法，包括給哺乳動(dòng)物寄主施用抗原和有效量的組合物，該組合物中包括含有0.01-70％v/v的甘油酯的佐劑，甘油酯選自下列物質(zhì)組取代甘油單酯，取代甘油二酯及其混合物，所說的甘油酯具有分子式(I)
其中R1，R2和R3選自飽和或不飽和C6-24脂肪酸，水溶性聚合物及其混合物，條件是甘油酯含有至少一個(gè)水溶性聚合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中甘油酯具有選自下列結(jié)構(gòu)式組的結(jié)構(gòu)
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中的抗原和包含佐劑的組合物依次施用。
30.一種向植物釋放生物活性劑的方法，包括給植物施用生物活性劑和有效量的組合物，該組合物中包括含有0.01-70％v/v的甘油酯的佐劑，甘油酯選自下列物質(zhì)取代甘油單酯，取代甘油二酯及其混合物，所說的甘油酯具有分子式(I)
其中R1，R2和R3選自飽和或不飽和C6-24脂肪酸，水溶性聚合物及其混合物，條件是甘油酯含有至少一個(gè)水溶性聚合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中甘油酯具有選自下列結(jié)構(gòu)式組的結(jié)構(gòu)
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中生物活性劑選自除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，植物生長調(diào)節(jié)劑，肥料，抗原和疫苗。
全文摘要
用于施用抗原,特別是用于粘膜施用抗原的佐劑,以及含有與抗原結(jié)合的上述佐劑以及生理上可接受的載體的組合物。利用本發(fā)明佐劑組合物引起和加強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法。佐劑包含甘油單或二酯,甘油酯含有至少一種水溶性聚合物,例如聚氧乙烯(PEG
文檔編號(hào)A61K39/39GK1262626SQ98806966
公開日2000年8月9日 申請(qǐng)日期1998年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月9日
發(fā)明者S·吉蘇拉森, V·古德穆德斯多特 申請(qǐng)人:藥物發(fā)展有限公司,冰島生物制藥集團(tuán)