本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及含哌嗪結(jié)構(gòu)化合物在制備組蛋白賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶（lsd1）抑制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因的突變可能引起疾病，同樣基因活性的變異也可能導(dǎo)致疾病。表觀基因蛋白可以通過(guò)對(duì)dna甲基化狀態(tài)的改變或?qū)M蛋白后翻譯修飾狀態(tài)的改變，達(dá)到調(diào)控基因活性的目的。因此表觀基因蛋白的不正常表達(dá)或調(diào)控可以在不同程度上改變一些重要基因的正常活性，從而導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的很多疾病。已有報(bào)道證實(shí)，很多癌癥細(xì)胞組織的病變都涉及一個(gè)或多個(gè)表觀基因蛋白的非正常表達(dá)或調(diào)控。所以表觀基因蛋白作為藥物研發(fā)的靶標(biāo)越來(lái)越受到重視。

表觀基因蛋白lsd1（histonelysinespecificdemethylase1），即組蛋白賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶1，是一種依賴(lài)黃素腺嘌呤二核苷酸（flavinadeninedinulcleotide，fad）的胺氧化酶，它能夠去除組蛋白單、雙甲基化的h3k4和h3k9上的甲基（y.shietal.，cell,2004，119，941-953）。lsd1的嚴(yán)格調(diào)控是發(fā)揮機(jī)體正常功能所必需的，而lsd1的失調(diào)通常與疾病相關(guān)聯(lián)。研究表明lsd1的高表達(dá)可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增生、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，并與病人預(yù)后有顯著相關(guān)（lvetal.,plosone,2012，7：e35065）；lsd1的高表達(dá)在原發(fā)型肝癌病人也預(yù)示不良預(yù)后（zhaoetal.,worldj.gastroenterol,2012，18，6651-6626）。而失去lsd1會(huì)以不依賴(lài)于p53或dnmt1的方式，抑制人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的增生并改變基因表達(dá)（jinetal.,bio.chem.j.,2013，449，459-468）。事實(shí)上，lsd1在雌激素受體陰性乳腺癌中的高表達(dá)，是預(yù)示癌癥浸潤(rùn)性的生物標(biāo)記物（limetal.,carcinogenesis,2010，31，512-520）；而結(jié)合雄性激素受體復(fù)合激活子和fhl2（fourandahalflim-domainprotein2），利用lsd1的高表達(dá)可預(yù)測(cè)前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性（kahletal.,cancerres.,2006，66，11341-11347）。另外腸道癌細(xì)胞的研究還進(jìn)一步表明，對(duì)lsd1的抑制可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡（dingetal.,br.j.cancer,2013，109，994-1003）。這些結(jié)果都說(shuō)明，lsd1可以作為抗癌藥物研發(fā)的潛在靶標(biāo)。

在已公布的有關(guān)lsd1抑制劑的專(zhuān)利和文獻(xiàn)中，大多數(shù)早期發(fā)明都是利用反苯環(huán)丙胺作為分子的核心骨架，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出對(duì)lsd1有更好選擇性抑制效果的活性分子。其中尤以西班牙的oryzongenomics公司最為突出，他們所設(shè)計(jì)的以反苯環(huán)丙胺為核心骨架的抑制劑，極大的提升了其對(duì)lsd1抑制效果的選擇性，其分子中的反苯環(huán)丙胺官能團(tuán)與lsd1中的fad發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵。近年來(lái)，所發(fā)明的越來(lái)越多的lsd1抑制劑是基于非共價(jià)鍵設(shè)計(jì)，例如utah大學(xué)發(fā)明的含苯甲酰肼化合物系列，以及鄭州大學(xué)發(fā)明的含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物系列。本發(fā)明合成了一系列含哌嗪結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵抑制劑，對(duì)lsd1有較好的抑制效果，可以用于與組蛋白特異性去甲基化酶活性相關(guān)的疾病預(yù)防和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種含哌嗪結(jié)構(gòu)化合物在制備組蛋白賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶（lsd1）抑制劑中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種含哌嗪結(jié)構(gòu)化合物在制備lsd1抑制劑中的應(yīng)用，所述化合物為式ⅰ所示結(jié)構(gòu)或其藥用鹽：

（ⅰ）；

或結(jié)構(gòu)通式為式ⅱ的化合物或其構(gòu)型異構(gòu)體、藥用鹽：

（ⅱ）；

其中，a為氫、羰基或硫代羰基；

r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；

r2為氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；

r3為芳基或雜芳基；

上述取代基中含有0-3個(gè)c1-c6烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、?；?、羧基、苯基、芐基、醚基或羧酸酯基取代。

當(dāng)a為羰基時(shí)，所述化合物為式ⅲ所示結(jié)構(gòu)或其構(gòu)型異構(gòu)體、藥用鹽：

（ⅲ）；

當(dāng)r3為苯基取代時(shí)，所述化合物為式ⅳ所示結(jié)構(gòu)或其構(gòu)型異構(gòu)體、藥用鹽：

（ⅳ）；

其中，x為羥基、烷氧基或鹵素。

當(dāng)a為氫時(shí)，所述化合物為式ⅴ所示結(jié)構(gòu)或其構(gòu)型異構(gòu)體、藥用鹽：

（ⅴ）；

當(dāng)r3為苯基取代時(shí)，所述化合物為式ⅵ所示結(jié)構(gòu)或其構(gòu)型異構(gòu)體、藥用鹽：

（ⅵ）；

其中，x為羥基、烷氧基或鹵素。

所述藥用鹽包括醋酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、草酸鹽和磷酸鹽。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：經(jīng)lsd1體外活性試驗(yàn)表明，本發(fā)明所提供的含哌嗪結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)lsd1具有明顯抑制作用，可將其作為活性成分制備成lsd1抑制劑，用于與組蛋白特異性去甲基化酶活性相關(guān)的疾病預(yù)防和治療。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例所得化合物-4、10、11、14對(duì)hepg2和k562細(xì)胞中不同基因表達(dá)水平的影響，其中（a）為肝癌hepg2細(xì)胞，（b）為急性粒細(xì)胞白血病k562細(xì)胞。

圖2為實(shí)施例所得化合物-4、10、11、14對(duì)hepg2細(xì)胞中h3k4me1和h3k4me2表達(dá)的影響，其中（a）為h3k4me1，（b）為h3k4me2。

圖3為實(shí)施例所得化合物-4、10、11、14對(duì)k562細(xì)胞中h3k4me1和h3k4me2表達(dá)的影響，其中（a）為h3k4me1，（b）為h3k4me2。

圖4為實(shí)施例所得化合物-4、10、11、14對(duì)肝癌hepg2細(xì)胞的毒性作用。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明不僅限于此。

nmr：

儀器產(chǎn)家名稱(chēng)：bruker

儀器型號(hào)（model）：avanceⅱ400

儀器頻率：400mhz

測(cè)試常用的氘代試劑：cdcl3，d6-dmso

lc-ms：

儀器產(chǎn)家名稱(chēng)：waters

儀器型號(hào)（model）：uplc-sqd

測(cè)試常用的溶劑a：0.1%的甲酸水溶液，

測(cè)試常用的溶劑b：0.1%的甲酸乙腈溶液。

實(shí)施例1

（s）-4-（3-羥基-1-氫-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-1）的制備

化合物-1具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：

1）1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-2）的制備：將3-苯基丙醛（1-1）（5g，37.3mmol）溶在dmf（50ml）中，冷至0℃，磁力攪拌下加入三氯乙酸（9.1g，51.9mmol）和三氯乙酸鈉（10.4g，55.7mmol）；反應(yīng)混合液攪拌下慢慢升到室溫，lc-ms跟蹤檢測(cè)反應(yīng)，直到3-苯基丙醛（1-1）反應(yīng)完全后，加入乙酸乙酯（50ml）稀釋?zhuān)缓蠹尤胩妓釟溻c水溶液（50ml），濾除固體，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯（20ml）萃取兩次，合并兩次萃取液，用飽和食鹽水洗兩次，用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮溶劑后，用中壓快速硅膠柱層析純化后得到油狀1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-2）5g，收率53%，¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.34（dd，j=10.0，4.7hz，2h），7.29-7.20（m，3h），4.01（ddd，j=10.0，5.4，1.9hz，1h），3.03（ddd，j=13.9，9.1，4.8hz，1h），2.81（ddd，j=16.8，9.7，5.1hz，2h），2.48-2.34（m，1h），2.06-1.95（m，1h）；

2）1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-酮（1-3）的制備：將所得1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-2）（2g，7.9mmol）溶于二氯甲烷（50ml），冷至0℃，磁力攪拌下加入dess-martin試劑（5g，11.8mmol）；反應(yīng)混合液在0℃下攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入飽和碳酸氫鈉溶液和硫代硫酸鈉溶液，反應(yīng)液攪拌澄清后，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取兩次，合并兩次萃取液，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮溶劑后，用中壓快速硅膠柱層析純化后得到無(wú)色油狀1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-酮（1-3）1.5g，收率48%；

3）（r）-1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-4）的制備：將所得1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-酮（1-3）（1.1g，4.4mmol）、二氯雙（4-甲基異丙基苯基）釕（ii）（268mg，0.44mmol）和（1r,2r）-（-）-n-（對(duì)甲基苯磺?；?1,2-二苯基乙二胺（320mg，0.87mmol）懸浮在無(wú)水乙酸乙酯中（10ml）加入三乙胺（442mg，4.4mmol）；反應(yīng)液用氮?dú)庵脫Q三次后，在28℃下磁力攪拌30分鐘，然后加入甲酸（1.51ml），28℃下磁力攪拌過(guò)夜；反應(yīng)加水淬滅，用乙酸乙酯萃取三次，合并三次萃取液，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，溶劑減壓濃縮后用中壓快速硅膠柱層析純化，得到700mg無(wú)色油狀（r）-1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-4），收率64%，¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.37-7.31（m，2h），7.26（dd，j=12.5，7.1hz，3h），4.02（ddd，j=10.0，5.4，1.8hz，1h），3.03（ddd，j=13.9，9.1，4.8hz，1h），2.80（qd，j=11.9，8.5hz，2h），2.41（ddd，j=27.3，18.1，11.2hz，1h），2.09-1.94（m，1h）；

4）（s）-1-叔丁氧羰基-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-6）的制備：將所得（r）-1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-4）（100mg，0.4mmol）、乙二胺（24mg，0.4mmol）和芐基三乙基氯化銨（91mg，0.4mmol）溶于二氯甲烷（5ml）中，冷至0℃，加入氫氧化鈉（96mg，2.4mmol）的飽和溶液，反應(yīng)混合液在0℃下磁力攪拌反應(yīng)17小時(shí)后慢慢升到室溫，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，然后加入(boc)2o（87mg，0.4mmol）磁力攪拌反應(yīng)3小時(shí)；加入水（2ml），分液后，水相用二氯甲烷萃取兩次，合并兩次萃取液，用飽和食鹽水洗一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮后用制備薄層層析法純化得到無(wú)色油狀（s）-1-叔丁氧羰基3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-6）40mg，收率33%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）305.2；

5）（s）-1-叔丁氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-7）的制備：將所得（s）-1-叔丁氧羰基3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-6）（40mg，0.13mmol）、對(duì)甲氧基碘苯（46mg，0.19mmol）和n,n-二甲基乙二胺（6mg，0.1mmol）溶于1,4-二氧六環(huán)（3ml）中，然后加入碳酸鉀（54mg，0.39mmol）和碘化亞銅（10mg，0.05mmol），反應(yīng)混合液用氮?dú)庵脫Q三次后，磁力攪拌下加熱到90℃，反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)液冷至室溫后過(guò)濾，濾液減壓濃縮后用制備薄層層析法純化得到36mg（s）-1-叔丁氧羰基4-（4-甲氧基苯基）-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-7），收率68%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）411.3；

6）（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮鹽酸鹽（1-8）的制備：將所得（s）-1-叔丁氧羰基4-（4-甲氧基苯基）-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-7）（36mg，0.088mmol）溶于1,4-二氧六環(huán)（1ml）中，加入鹽酸二氧六環(huán)（4n，4ml），反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌反應(yīng)1小時(shí)后，溶劑減壓濃縮得到白色固體（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮鹽酸鹽（1-8），收率100%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）311.3；

7）（s）-4-（3-羥基-1-氫-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-1）的制備：將3-羥基-1h-吡唑-5-羧酸（30mg，0.09mmol）和三乙胺（39mg，0.38mmol）溶于dmf（2ml）中，加入hobt（16mg，0.11mmol）和edci（46mg，0.24mmol），反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌20分鐘后，加入步驟6）所得（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮鹽酸鹽（1-8）（30mg，0.09mmol），反應(yīng)混合液磁力攪拌反應(yīng)48小時(shí)后加水淬滅；加入飽和碳酸氫鈉水溶液后，用二氯甲烷萃取三次，合并三次萃取液，用飽和食鹽水洗一次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后用制備hplc純化，得到白色固體（s）-4-（3-羥基-1-氫-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-1）7mg，收率19%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）421.1。

化合物-1：¹h-nmr（400mhz，dmso）δ：12.53（s，1h），7.46-7.07（m，7h），6.95（d，j=8.8hz，2h），5.72（s，1h），5.02（s，1h），3.94-3.67（m，5h），3.67-3.40（m，2h），2.76-2.61（m，2h），2.27-2.16（m，2h）。

實(shí)施例2

（s）-4-（3-羥基-1-氫-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-2）的制備

化合物-2具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：

1）化合物-2（r）-2-苯基-2-對(duì)甲苯磺酰氧基乙酸甲酯（2-2）的制備：將d-扁桃酸甲酯（2-1）（1g，6mmol）和三乙胺（1.82g，18mmol）溶于無(wú)水二氯甲烷中（20ml），反應(yīng)混合液冷至0℃后，加入對(duì)甲苯磺酰氯（1.4g，7.2mmol），反應(yīng)混合液在0℃反應(yīng)2小時(shí)后，加入水（10ml），分出有機(jī)相；有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后，用無(wú)水硫酸鈉干燥，溶劑減壓濃縮后得到粗產(chǎn)品，用快速硅膠柱層析純化，得到白色固體（r）-2-苯基-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（2-2）1.5g，收率為78%,lc-ms（esi）：m/z（m+1）321.1；

2）（s）-3-苯基哌嗪-2-酮（2-3）的制備：將所得（r）-2-苯基-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（2-2）（500mg，1.56mmol）和乙二胺（89mg，1.48mmol）溶于甲醇（50ml），反應(yīng)混合液加熱到50℃反應(yīng)24小時(shí)后，冷至室溫，溶劑加壓濃縮后，用快速硅膠柱層析分離純化得到66mg（r）-3-苯基哌嗪-2-酮（2-3），收率24%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）177.2；

3）（s）-1-（n-叔丁氧羰基哌啶-4-甲?；?2-苯基哌嗪-3-酮（2-4）的制備：將所得（r）-3-苯基哌嗪-2-酮（2-3）（66mg，0.37mmol）、1-boc-4-哌啶甲酸（95mg，0.41mmol）溶于無(wú)水dmf（2ml）中，再加入hbtu（174mg，0.45mmol）和diepa（145mg，1.1mmol）；反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌30分鐘后加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取，萃取液用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后用制備薄層層析板分離純化得到73mg（s）-1-（n-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-4），收率50%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）388.2；

4）（s）-1-（n-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-5）的制備：將所得（s）-1-（n-叔丁氧羰基哌啶-4-甲?；?2-苯基哌嗪-3-酮（2-4）（40mg，0.1mmol）、（4-溴苯氧基）-叔丁基二甲基硅醚（39mg，0.13mmol）溶于1,4-二氧六環(huán)（3ml）中，然后加入碳酸鉀（43mg，0.3mmol）、n,n’-二甲基乙二胺（9mg，0.1mmol）和碘化亞銅（8mg，0.04mmol），反應(yīng)混合液用氮?dú)庵脫Q三次后，磁力攪拌加熱到90℃，反應(yīng)24小時(shí)后，反應(yīng)液冷至室溫過(guò)濾，濾液減壓濃縮后用硅膠快速層析法純化得到20mg（s）-1-（n-叔丁氧羰基哌啶-4-甲?；?4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-5），收率34%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）594.4；

5）（s）-1-（4-羥基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-甲?；┻哙?2-酮（化合物-2）的制備：將所得（s）-1-（n-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-5）（40mg，0.07mmol）溶于二氯甲烷（3ml）中，加入4n的鹽酸二氧六環(huán)（3ml）后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜，溶劑減壓濃縮后用制備hplc分離純化得到14mg（s）-1-（4-羥基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-甲酰基）哌嗪-2-酮（化合物-2），收率54%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）379.5。化合物-2：¹h-nmr（400mhz，dmso）δ：7.49-7.27（m，5h），7.14（d，j=8.6hz，2h），6.77（d，j=8.5hz，2h），6.01（s，1h），5.76（s，1h），4.19-4.04（m，1h），3.86-3.64（m，2h），3.57-3.50（m，1h），3.00-2.90（m，2h），2.85-2.77（m，1h），2.70-2.55（m，2h），1.68-1.37（m，4h）。

實(shí)施例3

（r）-1-（4-羥基苯基）-4-（4-羥基-2-氨基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（化合物-3）的制備

化合物-3具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：

1）（s）-2-苯基-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（3-2）的制備：將l-扁桃酸甲酯（3-1）（1g，6mmol）和三乙胺（1.82g，18mmol）溶于無(wú)水二氯甲烷中（20ml），反應(yīng)混合液冷至0℃后，加入對(duì)甲苯磺酰氯（1.4g，7.2mmol），反應(yīng)混合液在0℃下反應(yīng)2小時(shí)后，加入水（10ml），分出有機(jī)相；有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后，用無(wú)水硫酸鈉干燥，溶劑減壓濃縮后得到粗產(chǎn)品，用快速硅膠柱層析純化，得到白色固體（s）-2-苯基-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（3-2）1.2g，收率為41%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）321.1；

2）（r）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-3）的制備：將所得（s）-2-苯基-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（3-2）（950mg，2.97mmol）和乙二胺（175mg，2.9mmol）溶于甲醇（50ml）中，反應(yīng)混合液加熱到50℃后反應(yīng)24小時(shí)，冷至室溫，溶劑減壓濃縮，用快速硅膠柱層析分離純化得到150mg（r）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-3），收率29%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）177.2；

3）（r）-1-n-叔丁氧羰基-2-苯基哌嗪-3-酮（3-4）的制備：將所得（r）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-3）（150mg，0.85mmol）和三乙胺（172mg，1.7mmol）溶于二氯甲烷（5ml）中，加入(boc)2o（278mg，1.5mmol），反應(yīng)混合液室溫?cái)嚢?小時(shí)后，減壓濃縮，硅膠柱層析分離純化得到220mg（r）-1-n-叔丁氧羰基-2-苯基哌嗪-3-酮（3-4），收率94%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）277.2；

4）（r）-1-n-叔丁氧羰基-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（3-5）的制備：將所得（r）-1-n-叔丁氧羰基-2-苯基哌嗪-3-酮（3-4）（160mg，0.58mmol）、（4-溴苯氧基）叔丁基二甲基硅醚（216mg，0.75mmol）溶于1,4-二氧六環(huán)（3ml）中，然后加入碳酸鉀（239mg，1.73mmol）、n,n-二甲基乙二胺（51mg，0.58mmol）和碘化亞銅（44mg，0.23mmol），反應(yīng)混合液用氮?dú)庵脫Q三次后，磁力攪拌加熱到90℃反應(yīng)24小時(shí)后，反應(yīng)液冷至室溫過(guò)濾，濾液減壓濃縮后用硅膠快速層析法純化得到150mg（r）-1-n-叔丁氧羰基-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（3-5），收率54%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）483.2；

5）（r）-1-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-6）的制備：將所得（r）-1-n-叔丁氧羰基-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（3-5）（50mg，0.1mmol）溶于二氯甲烷（3ml）中，加入4n的鹽酸二氧六環(huán)（3ml），反應(yīng)混合液室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20分鐘后，溶劑減壓旋干得到（r）-1-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-3-苯基哌嗪-2-酮的鹽酸鹽（3-6），收率100%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）383.2；

6）4-羥基-2-硝基-苯甲酸（3-8）的制備：將500mg4-羥基-2-硝基-苯甲酸（3-7）懸浮在40%氫溴酸（5ml）和醋酸（5ml）的溶液中，反應(yīng)混合液加熱到120℃，反應(yīng)36小時(shí)，冷至室溫后，減壓濃縮得到粗品；將粗品溶于二氯甲烷中，加飽和碳酸氫鈉水溶液攪拌后，分出水相，用1n的鹽酸調(diào)ph值到2左右，然后用乙酸乙酯萃取，合并的萃取液用飽和的食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮干燥后得到350mg4-羥基-2-硝基-苯甲酸（3-8），收率75%；

7）4-（叔丁基二甲基硅氧基）-2-硝基-苯甲酸（3-9）的制備：將所得4-羥基-2-硝基-苯甲酸（3-8）（120mg，0.656mmol）和咪唑（179mg，2.62mmol）溶于無(wú)水dmf（2ml）中，加入tbscl（297mg，1.97mmol），反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌過(guò)夜后，在反應(yīng)液中加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮，用硅膠柱層析分離純化得到20mg4-（叔丁基二甲基硅氧基）-2-硝基-苯甲酸（3-9），收率69%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）298.2；

8）（r）-1-（（4-叔丁基二甲基硅氧基）苯基）-4-（4-羥基-2-硝基-苯甲?；?3-苯基哌嗪-2-酮（3-10）的制備：將所得4-（叔丁基二甲基硅氧基）-2-硝基-苯甲酸（3-9）（34mg，0.1mmol），（r）-1-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-6）（39mg，0.1mmol）溶于無(wú)水dmf（2ml）中，加入hbtu（60mg，0.15mmol）和三乙胺（43μl，0.3mmol），室溫磁力攪拌反應(yīng)30分鐘后加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后用制備薄層層析板分離純化得到32mg（r）-1-（（4-叔丁基二甲基硅氧基）苯基）-4-（4-羥基-2-硝基-苯甲?；?3-苯基哌嗪-2-酮（3-10），收率61%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）548.2；

9）（r）-1-（4-羥基苯基）-4-（4-羥基-2-硝基-苯甲?；?3-苯基哌嗪-2-酮（3-11）的制備：將所得（r）-1-（（4-叔丁基二甲基硅氧基）苯基）-4-（4-羥基-2-硝基-苯甲?；?3-苯基哌嗪-2-酮（3-10）（32mg，0.06mmol）溶于thf（2ml）中，加入四丁基氟化胺（50mg，0.16mmol），反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌1小時(shí)后，加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，有機(jī)相用水洗滌3次，飽和食鹽水洗一次后，用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮干燥得到20mg（r）-1-（4-羥基苯基）-4-（4-羥基-2-硝基-苯甲?；?3-苯基哌嗪-2-酮（3-11），收率80%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）434.2；

10）（r）-1-（4-羥基苯基）-4-（4-羥基-2-氨基-苯甲?；?3-苯基哌嗪-2-酮（化合物-3）的制備：將所得（r）-1-（4-羥基苯基）-4-（4-羥基-2-硝基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-11）（20mg，0.046mmol）和pd/c（3mg）懸浮在乙酸乙酯（5ml）中，反應(yīng)液用氫氣置換三次后，在氫氣球下反應(yīng)1小時(shí)，濾除鈀碳后，減壓濃縮，用制備hplc分離純化得到6mg（r）-1-（4-羥基苯基）-4-（4-羥基-2-氨基-苯甲?；?3-苯基哌嗪-2-酮（化合物-3），收率33%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）404.2。

化合物-3：¹h-nmr（400mhz，dmso）δ=9.54（s，1h），9.43（s，1h），7.59-7.37（m，4h），7.37-7.30（m，1h），7.16（d，j=8.7hz，2h），6.90（d，j=8.4hz，1h），6.78（d，j=8.8hz，2h），6.16（d，j=2.2hz，1h），6.01（d，j=8.2hz，1h），5.90（s，1h），5.32（s，2h），4.01-3.85（m，2h），3.58-3.45（m，2h）。

實(shí)施例4

1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（1-甲基-4-羰基咪唑）哌嗪-2-酮（化合物-4）的制備

化合物-4具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體步驟包括：將1-甲基-4-咪唑甲酸（4-1）（265mg，2.1mmol）用n,n-二甲基甲酰胺（12ml）溶解，攪拌下加入n-甲基嗎啡啉（850mg，8.4mmol），反應(yīng)液置于冰水浴下慢慢攪拌10分鐘，然后慢慢滴入三甲基乙酰氯（277mg，2.3mmol），加畢保持冰水浴下攪拌反應(yīng)30分鐘；酸酐完全形成后，冰水浴下慢慢滴入溶解于n,n-二甲基甲酰胺（10ml）的1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-2-哌嗪酮鹽酸鹽（4-2）（462mg，1.8mmol）溶液，加畢，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，跟蹤監(jiān)測(cè)反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，加水淬滅，將反應(yīng)體系真空濃縮，濃縮物用二氯甲烷萃取，然后用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物進(jìn)行柱層析分離得到白色固體1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（1-甲基-4-羰基咪唑）哌嗪-2-酮（化合物-4），產(chǎn)率70%，熔點(diǎn)：179-180℃。

化合物-4：¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.57（s，1h），7.37（s，1h），7.16（d，j=8.8hz，1h），6.88（d，j=8.9hz，1h），3.87-4.02（bs，1h），3.77（s，1h），3.69（s，1h），3.40-3.65（m，2h），2.82-3.35（m，2h），1.16（d，j=15.2hz，1h）；¹³c-nmr（100mhz，cdcl3）δ：180.0，168.3，158.2，137.5，136.8，134.8，127.0，126.5，114.4，55.4，40.3，38.5，33.6，27.4，27.1；ir（film）υmax：3467，3114，2945，2357，1651，1610，1545，1510，1429，1366，1322，1247，1167，1074，1030，970，927，835，795，748，664，547；esi-ms：m/z329[m+h]⁺。

實(shí)施例5

4-（4-甲氧基苯甲?；?1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-5）的制備

化合物-5具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體步驟包括：將對(duì)甲氧基苯甲酸（5-1）（76mg，0.5mmol）用n,n-二甲基甲酰胺（4ml）溶解，隨后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（pybop，422mg，0.9mmol）和n,n-二異丙基乙胺（0.3ml，1.8mmol），加畢室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30~40分鐘，然后冰水浴下慢慢滴加溶解于n,n-二甲基甲酰胺（10ml）的1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-2-哌嗪酮鹽酸鹽（4-2）（116mg，0.45mmol）溶液，加畢室溫?cái)嚢?小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系真空濃縮，濃縮物溶解于二氯甲烷中，分別用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物進(jìn)行柱層析，分離得到為白色固體4-（4-甲氧基苯甲酰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-5），產(chǎn)率90%，熔點(diǎn)：156-158℃。

化合物-5：¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.43（d，j=8.7hz，2h），7.17（d，j=8.9hz，2h），6.93（d，j=8.6hz，2h），6.91（d，j=8.8hz，2h），4.66-5.12（bs，1h），3.86-3.99（m，1h），3.84（s，3h），3.80-3.83（m，1h），3.796（s，3h），3.43-3.63（m，2h），1.63（d，j=7.1hz，1h）；¹³c-nmr（100mhz，cdcl3）δ：168.7，161.2，158.4，134.6，128.9，127.0，114.6，113.96，55.4，55.4，55.3，50.3；ir（film）υmax：3480，2943，2842，2551，2239，2045，1649，1510，1461，1421，1307，1251，1175，1079，1028，948，916，836，799，732，634，595，522；esi-ms：m/z377[m+na]⁺。

實(shí)施例6

4-（2,4-二甲氧基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-6）的制備

化合物-6具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體步驟包括：將2,4-二甲基噻唑-5-羧酸（6-1）（121mg，0.77mmol）用n,n-二甲基甲酰胺（5ml）溶解，隨后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（pybop，729mg，1.4mmol）和n,n-二異丙基乙胺（0.46ml，2.8mmol），加畢室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30~40分鐘，然后冰水浴下慢慢滴加溶解于n,n-二甲基甲酰胺（10ml）的1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-2-哌嗪酮鹽酸鹽（4-2）（180mg，0.7mmol）溶液，加畢室溫?cái)嚢?小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系真空濃縮，濃縮物溶解于二氯甲烷（15ml）中，分別用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物進(jìn)行柱層析分離得到4-（2,4-二甲氧基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-6），產(chǎn)率88%。

化合物-6：¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.17（d，j=8.4hz，2h），6.92（d，j=8.4hz，2h），4.76-5.13（m，1h），4.14-4.54（m，1h），3.82-3.96（m，1h），3.72-3.82（s，3h），3.43-3.71（m，2h），2.69（s，3h），2.45（s，3h），1.63（d，j=6.9hz，3h）；¹³c-nmr（100mhz，cdcl3）δ：168.1，166.1，162.3，158.5，152.6，134.3，126.9，122.4，114.5，55.4，50.3，29.6，29.2，18.96，17.9，16.2；esi-ms：m/z360[m+h]⁺。

實(shí)施例7

4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-7）的制備

化合物-7具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：

1）3-苯基-哌嗪-2-酮（7-2）的制備：將α-溴苯基乙酸（7-1）（20g，93mmol）溶解在無(wú)水乙醇（150ml）中，磁力攪拌下慢慢加入濃鹽酸（5ml），加畢，加熱回流反應(yīng)過(guò)夜；將反應(yīng)液冷卻至室溫后，減壓濃縮得到棕黃色油狀物α-溴苯基乙酸乙酯；所得產(chǎn)物直接溶解在無(wú)水乙醇（60ml）中并通過(guò)恒壓滴液漏斗慢慢加入溶解有乙二胺（11.18g，186mmol）的無(wú)水乙醇（90ml）中，加畢，將溶解在無(wú)水乙醇（60ml）中的乙醇鈉（185mmol）加到反應(yīng)液中，并加熱回流16小時(shí)；冷卻后，通過(guò)減壓濃縮除去乙醇和過(guò)量的乙二胺，濃縮物溶解在水中并用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物進(jìn)行柱層析分離（洗脫劑：ch2cl2：meoh：nh4oh=20：1：0.2），得白色固體3-苯基-哌嗪-2-酮（7-2）5.736g，產(chǎn)率35%；

2）4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-3）的制備：將所得3-苯基-2-哌嗪酮（7-2）（2.3936g，13.58mmol）溶解在無(wú)水二氯甲烷（65ml）中，攪拌下加入三乙胺（3.1ml，22.2mmol），攪拌10分鐘后置于冰水浴下繼續(xù)攪拌，并加入二碳酸二叔丁酯(boc)2o（3.26g，14.9mmol），加畢，攪拌5分鐘后撤去冰水浴，繼續(xù)在室溫下攪拌至反應(yīng)結(jié)束；將反應(yīng)混合物進(jìn)行減壓濃縮，濃縮物加入乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行分層，去除有機(jī)相，水相再用乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液后用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得到白色固體4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-3），產(chǎn)率99%，無(wú)需純化，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)，¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.27-7.47（m，5h），6.40（bs，1h），5.72（bs，1h），4.05（bs，1h），3.46-3.57（m，1h），3.21-3.40（m，2h），1.60（s，3h），1.45（s，9h）；

3）1-（4-甲氧基苯基）-4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-4）的制備：將對(duì)碘苯甲醚（3.095g，13.2mmol），所得4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-3）（3.0381g，11mmol），無(wú)水磷酸鉀（4.6657g，22mmol）和碘化亞銅（423mg，2.2mmol）加入100ml干燥的圓底燒瓶中，加入磁力攪拌子并用螺紋翻口橡膠塞進(jìn)行密封；使用真空泵交換氮?dú)夂螅ㄟ^(guò)注射器加入無(wú)水dmf（30ml），再加入n,n-二甲基乙二胺溶液（0.47ml）后，將反應(yīng)混合液油浴加熱至70℃，反應(yīng)24小時(shí)后冷卻至室溫，加壓濃縮除去溶劑，加入水溶解濃縮物中的無(wú)機(jī)鹽，并用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物經(jīng)柱層析分離純化得到淡黃色固體1-（4-甲氧基苯基）-4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-4）2.167g，產(chǎn)率60%；

4）1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）的制備：將所得1-（4-甲氧基苯基）-4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-4）（2.167g，6.6mmol）溶解在干燥的二氯甲烷（9ml）中，冰水浴下慢慢加入三氟乙酸（3ml），混合液在室溫下攪拌，tlc檢測(cè)跟蹤至反應(yīng)完成，然后減壓濃縮除去溶劑，濃縮物加入飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和，加入二氯甲烷進(jìn)行分液并萃取三次，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物經(jīng)柱層析分離純化得到白色固體1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）1.49g，產(chǎn)率80%；

5）4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-7）的制備：將所得2,4-二甲基噻唑-5-羧酸（7-6）（168.7mg，1.07mmol）溶解于n,n-二甲基甲酰胺（3ml）中，隨后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（pybop，773.8mg，1.49mmol）和n,n-二異丙基乙胺（0.4ml，2.3mmol），加畢室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘，然后冰水浴下慢慢滴加溶解于n,n-二甲基甲酰胺（2ml）的1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基--哌嗪-2-酮（7-5）（268.4mg，0.95mmol）溶液，加畢室溫?cái)嚢?小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系真空濃縮，濃縮物溶解于二氯甲烷中，分別用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物進(jìn)行柱層析分離得到黃色固體4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-7），產(chǎn)率76%。

化合物-7：¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.32-7.50（m，5h），7.19（d，j=8.3hz，2h），6.93（d，j=8.3hz，2h），5.65-6.40（bs，1h），4.05-4.23（bs，1h），3.81-3.88（m，1h），3.80（s，3h），3.66-3.76（m，1h），3.56-3.65（m，1h），2.63（s，3h），2.42（s，3h）；esi-ms：m/z422[m+h]⁺。

實(shí)施例8

4-（1-氫-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-8）的制備

化合物-8具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：將1h-咪唑-4-甲酸（8-1）（175mg，1.56mmol）超聲溶解于n,n-二甲基甲酰胺（5ml）中，隨后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（pybop，822mg，1.58mmol）和n,n-二異丙基乙胺（0.54ml，3.12mmol），加畢室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘，然后冰水浴下慢慢加入1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮鹽酸鹽（4-2）（203mg，0.79mmol），加畢室溫?cái)嚢?小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系真空濃縮，濃縮物溶解于二氯甲烷中，分別用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物進(jìn)行柱層析分離得到白色固體4-（1-氫-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-8），產(chǎn)率87%。

化合物-8：¹h-nmr（400mhz，dmso-d6）δ：12.59（bs，1h），7.77（s，1h），7.73（s，1h），7.24（d，j=8.7hz，2h），6.94（d，j=8.7hz，2h），4.25-6.34（m，2h），3.76-3.88（m，2h），3.75（s，3h），3.51-3.59（m，1h），1.51（bs，3h）；esi-ms：m/z315[m+h]⁺。

實(shí)施例9

4-（1-氫-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-9）的制備

化合物-9具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：將1h-咪唑-4-甲酸（9-1）（175mg，1.56mmol）超聲溶解于n,n-二甲基甲酰胺（5ml）中，隨后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（pybop，822mg，1.58mmol）和n,n-二異丙基乙胺（0.54ml，3.12mmol），加畢室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘，然后冰水浴下慢慢加入1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）（223mg，0.79mmol），加畢室溫?cái)嚢?小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系真空濃縮，濃縮物溶解于二氯甲烷中，分別用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物進(jìn)行柱層析分離得到白色固體4-（1-氫-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-9），產(chǎn)率78%。

化合物-9：¹h-nmr（400mhz，dmso-d6）δ：12.69（bs，1h），7.79（s，2h），7.49-7.53（m，2h），7.40（dd，j=7.5，7.5hz，2h），7.34（d，j=7.4hz，2h），7.31（d，j=8.8hz，2h），6.97（d，j=8.8hz，2h），5.23-6.36（m，1h），3.77-4.57（m，2h），3.76（s，3h），3.27-3.67（m，2h）；esi-ms：m/z375[m-h]^-。

實(shí)施例10

1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-l-脯氨?；哙?2-酮（化合物-10）的制備

化合物-10具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：將1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（4-2）（0.30g，1.37mmol）于100ml單口圓底燒瓶中，加入dmf（15ml）攪拌至全溶后加入n,n-二異丙基乙胺（2.0ml，10.96mmol），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5分鐘后加入fmoc-l-pro-osu（10-1）（2.38g，5.48mmol），室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，體系變渾濁，有白色固體析出，繼續(xù)攪拌反應(yīng)過(guò)夜；向該反應(yīng)體系中逐滴加入二乙胺（7.5ml）以脫除fmoc，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，體系析出更多白色固體，tlc跟蹤，反應(yīng)結(jié)束；反應(yīng)液減壓濃縮，得微黃色稠狀物，硅膠柱層析分離，得白色固體1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-l-脯氨?；哙?2-酮（化合物-10）0.315g，產(chǎn)率72.5%。

化合物-10：熔點(diǎn)88-89℃。ir（kbr，cm^-1）ν：3434，2941，2830，1779，1708，1427，1306，1217，1077，815；¹h-nmr（400mhz，acetonitrile-d6）δ：7.52（d，j=8.0hz，2h），6.91（d，j=8.0hz，2h），5.58~5.54（t，j=8.0hz，2h），4.01~3.83（m，4h），3.79（s，3h），3.06~2.83（m，2h），2.11~1.77（m，4h），1.64（s，1h），1.44（d，j=8.0hz，3h）；¹³c-nmr（100mhz，acetonitrile-d6）δ：172.38，164.43，158.02，136.53，125.86，115.53，59.36，56.08，53.07，48.29，43.07，42.72，31.28，25.02，17.33；ms（esi）m/z：318.35[m+h]⁺。

實(shí)施例11

4-（3-羥基-1h-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-11）的分析數(shù)據(jù)

化合物-11具有如下結(jié)構(gòu)：

化合物-11購(gòu)自chembridge試劑公司，cas：1350985-38-4，zinc：71774935?；衔餅榘咨腆w，熔點(diǎn)：219-221℃。¹h-nmr（400mhz，dmso-d6）δ：12.03-12.91（m，1h），9.47-11.29（m，1h），7.25（d，j=8.7hz，2h），6.95（d，j=8.6hz，2h），5.52-6.06（m，1h），3.81-5.33（m，3h），3.76（s，3h），3.27-3.72（m，2h），1.27-1.74（m，3h）；¹³c-nmr（100mhz，dmso-d6）δ：168.4，161.8，158.1，154.6，146.7，135.6，127.8，114.5，88.8，55.7，55.5，52.4，49.9，17.0；ir（film）υmax：3429，3154，2975，2735，1623，1511，1434，1384，1235，1087，1045，938，823，629；esi-ms：m/z331[m+h]⁺，353[m+na]⁺。

實(shí)施例12

（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（n-正丙基-四氫吡咯）-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-12）的制備

化合物-12具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：

1）化合物-12（s）-2-芐氧羰基氨基丁酸（12-2）的制備：將（s）-2-（芐氧羰基氨基）丁酸（12-1）（2g，8.4mmol），2,2-二甲氧基乙胺（886mg，8.4mmol）溶于無(wú)水dmf（45ml）中，加入hbtu（3950mg，10.21mmol）和diepa（3292mg，25.0mmol），反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌30分鐘后加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后用制備薄層層析板分離純化得到（s）-2-芐氧羰基氨基丁酸（12-2）2.7g，收率98%.lc-ms（esi）：m/z（m+1）325.2；

2）（s）-1-芐氧羰基-2-乙基-3,4-二氫哌嗪-3-酮（12-3）的制備：在0℃時(shí)，將所得（s）-2-芐氧羰基氨基丁酸（12-2）（500mg，1.54mmol）分批加入到70%三氟乙酸的水溶液（8ml）中，反應(yīng)混合液慢慢升到室溫，并磁力攪拌過(guò)夜，然后緩慢倒入攪拌中的碳酸鈉水溶液中，使溶液ph值大于8，并用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后得到（s）-1-芐氧羰基-2-乙基-3,4-二氫哌嗪-3-酮（12-3）350mg，收率87%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）261.2；

3）（s）-1-芐氧羰基-2-乙基哌嗪-3-酮（12-4）的制備：將所得（s）-1-芐氧羰基-2-乙基-3,4-二氫哌嗪-3-酮（12-3）（100mg，0.38mmol）溶于1,2-二氯乙烷中，加入tfa（175mg，1.54mmol）和三乙基硅烷（112mg，0.96mmol）；反應(yīng)混合液氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)36小時(shí)后，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，粗品溶于二氯甲烷中，慢慢加入飽和碳酸氫鈉溶液，并用二氯甲烷萃取，合并萃取液用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后用硅膠柱層析純化得到60mg（s）-1-芐氧羰基-2-乙基哌嗪-3-酮（12-4），收率62%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）263.2；

4）（s）-1-芐氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-2-乙基哌嗪-3-酮（12-5）的制備：將所得（s）-1-芐氧羰基-2-乙基哌嗪-3-酮（12-4）（56mg，0.2mmol），4-甲氧基碘苯（65mg，0.28mmol）溶于1,4-二氧六環(huán)（6ml）中，然后加入碳酸鉀（86mg，0.6mmol），n,n-二甲基乙二胺（18mg，0.2mmol）和碘化亞銅（16mg，0.08mmol），反應(yīng)混合液用氮?dú)庵脫Q三次后，磁力攪拌加熱到90℃后反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)液冷至室溫，過(guò)濾，濾液減壓濃縮后用硅膠快速層析法純化得到52mg（s）-1-芐氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-2-乙基哌嗪-3-酮（12-5），收率67%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）369.2；

5）（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-6）的制備：將所得（s）-1-芐氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-2-乙基哌嗪-3-酮（12-5）（52mg，0.14mmol）和鈀碳（5mg）懸浮在乙酸乙酯（5ml）中，用氫氣置換三次后，在氫氣的條件下室溫磁力攪拌2小時(shí)，濾除鈀碳后，加壓濃縮得到（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-6），收率100%。lc-ms（esi）：m/z（m+1）235.2；

6）（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（n-叔丁氧羰基-四氫吡咯）-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-7）的制備：將所得（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-6）（43mg，0.184mmol）和n-boc-d-脯氨醛（37mg，0.184mmol）溶于二氯甲烷（2ml）中，加入三乙?；饸浠c（117mg，0.552mmol），反應(yīng)混合液室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，加入飽和碳酸氫鈉溶液，用二氯甲烷萃取，合并萃取液用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，然后用硅膠柱層析分離純化，得到40mg（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（n-叔丁氧羰基-四氫吡咯）-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-7），收率53%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）418.3；

7）（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（四氫吡咯-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-8）的制備：將所得（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（n-叔丁氧羰基-四氫吡咯）-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-7）（170mg，0.41mmol）溶于二氯甲烷（18ml）中，加入4n的鹽酸二氧六環(huán)（18ml）后，反應(yīng)混合液室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜，溶劑減壓濃縮后用制備hplc分離純化得到（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（四氫吡咯-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮的鹽酸鹽（12-8），收率100%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）318.3；

8）（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（n-正丙基-四氫吡咯）-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-12）的制備：將所得（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（四氫吡咯-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮的鹽酸鹽（12-8）（60mg，0.19mmol）和正丙醛（13mg，0.23mmol）溶于二氯甲烷（2ml）中，加入三乙?；饸浠c（117mg，0.552mmol），反應(yīng)混合液室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，加入飽和碳酸氫鈉溶液，用二氯甲烷萃取，合并萃取液，用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，經(jīng)過(guò)制備hplc的分離純化得到28mg（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（n-正丙基-四氫吡咯）-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-12），收率41%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）360.3。

化合物-12：¹h-nmr（400mhz，cdcl3）δ：7.22-7.17（m，2h），6.95-6.91（m，2h），3.82（s，3h），3.77-3.60（m，3h），3.43-3.37（m，1h），3.31-3.23（m，1h），3.17（t，j=4.7hz，1h），3.06-2.97（m，1h），2.80-2.71（m，2h），2.40-2.34（m，1h），2.06-2.02（m，2h），1.96-1.89（m，3h），1.86-1.79（m，2h），1.26（t，j=7.0hz，3h），1.04-0.94（m，6h）。

實(shí)施例13

（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（n-正丙基-四氫吡咯）-2-亞甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-13）的制備

化合物-13具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：

1）1,4-二叔丁氧羰基哌嗪-2-甲酸（13-2）的制備：將吡嗪-2-甲酸鹽酸鹽（2g，9.8mmol）和(boc)2o（8.6g，39.4mmol）溶于thf（40ml）和水（40ml），加入碳酸氫鈉（8.31g，79.8mmol），反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌4小時(shí)后加乙酸乙酯，倒入分液漏斗分液，分出的有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，溶劑減壓濃縮后用硅膠柱層析分離純化得到2.5g1,4-二叔丁氧羰基哌嗪-2-甲酸（13-2），收率78%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）331.2；

2）1,4-二叔丁氧羰基-2-羥基亞甲基-哌嗪（13-3）的制備：將所得1,4-二叔丁氧羰基哌嗪-2-甲酸（13-2）（500mg，1.5mmol）溶于無(wú)水thf（10ml），氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入硼烷四氫呋喃（4.5ml，4.5mmol）后，加熱到40℃反應(yīng)2小時(shí)，冷至0℃，逐滴加入甲醇淬滅反應(yīng)，反應(yīng)液濃縮干燥后得到470mg1,4-二叔丁氧羰基-2-羥基亞甲基-哌嗪（13-3），收率98%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）317.2；

3）1,4-二叔丁氧羰基-2-甲?；?哌嗪（13-4）的制備：將所得1,4-二叔丁氧羰基-2-羥基亞甲基-哌嗪（13-3）（100mg，0.32mmol）溶于二氯甲烷（5ml）中，加入戴斯-馬丁氧化劑（272mg，0.64mmol），反應(yīng)混合液室溫磁力攪拌3小時(shí)后，加入碳酸氫鈉水溶液和亞硫酸鈉水溶液攪拌至澄清，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取，合并萃取液用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，然后用硅膠柱層析分離純化，得到64mg1,4-二叔丁氧羰基-2-甲?；?哌嗪（13-4），收率64%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）314.2；

4）（r）-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）丙酸甲酯（13-6）的制備：將（r）-（+）-2-羥基丙酸甲酯（1g，9.6mmol）和三乙胺（2.91g，28.8mmol）溶于無(wú)水二氯甲烷中（32ml），反應(yīng)混合液冷至0℃后，加入對(duì)甲苯磺酰氯（2.2g，11.5mmol），反應(yīng)混合液在0℃反應(yīng)2小時(shí)后，加入水（16ml），分出有機(jī)相，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后，用無(wú)水硫酸鈉干燥，溶劑減壓濃縮后得到粗產(chǎn)品，用快速硅膠柱層析純化，得到1.2g（r）-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）丙酸甲酯（13-6），收率49%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）259.2；

5）（s）-1-（叔丁氧羰基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-8）的制備：將（r）-2-（對(duì)甲苯磺酰氧基）丙酸甲酯（13-6）（400mg，1.55mmol）和乙二胺（88mg，1.47mmol）溶于甲醇（50ml），反應(yīng)混合液加熱到50℃反應(yīng)24小時(shí)后，冷至室溫，溶劑加壓濃縮后，得到（s）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-7）的粗產(chǎn)品；然后按實(shí)施例步驟3）操作得到140mg（s）-1-（叔丁氧羰基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-8），兩步收率48%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）215.2；

6）（s）-1-（叔丁氧羰基）-4-（4-甲氧基苯基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-9）的制備：將所得（s）-1-（叔丁氧羰基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-8）（70mg，0.33mmol）和4-甲氧基碘苯（100mg，0.43mmol）按實(shí)施例3步驟4）操作，得到80mg（s）-1-（叔丁氧羰基）-4-（4-甲氧基苯基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-9），收率77%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）321.2；

7）（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-10）的制備：將所得（s）-1-（叔丁氧羰基）-4-（4-甲氧基苯基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-9）（80mg，0.25mmol）按實(shí)施例3步驟5）操作，得到（s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基哌嗪-2-酮的鹽酸鹽（13-10），收率100%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）221.2；

8）（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（1,4-二叔丁氧羰基）-2-亞甲基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-11）的制備：將所得（s）-1-（（4-甲氧基苯基）-3-甲基哌嗪-2-酮的鹽酸鹽（13-10）（30mg，0.14mmol）和1,4-二叔丁氧羰基-2-甲酰基-哌嗪（13-4）（52mg，0.16mmol）溶于二氯甲烷（2ml）中，加入三乙?；饸浠c（89mg，0.42mmol），反應(yīng)混合液室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，加入飽和碳酸氫鈉溶液，用二氯甲烷萃取，合并萃取液用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，然后用硅膠柱層析分離純化，得到47mg（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（1,4-二叔丁氧羰基）-2-亞甲基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-11），收率67%，lc-ms（esi）：m/z（m+1）519.3；

9）（3s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（哌嗪-2-亞甲基）哌嗪-2-酮（化合物-13）的制備：將所得（s）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（1,4-二叔丁氧羰基）-2-亞甲基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-11）（47mg，0.091mmol）按實(shí)施例3步驟5）操作，得到25mg（3s）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（哌嗪-2-亞甲基）哌嗪-2-酮（化合物-13），收率80%。lc-ms（esi）：m/z（m+1）319.2。

化合物-13：¹h-nmr（400mhz，dmso）δ：7.20（d，j=8.8hz，2h），6.94（d，j=8.7hz，2h），3.76（s，3h），3.53-3.39（m，4h），3.24-3.08（m，6h），2.94（s，2h），2.74-2.62（m，2h），1.39-1.24（m，3h）。

實(shí)施例14

6-（4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-哌嗪-1-基）-2-甲氧-4-（對(duì)甲苯胺基）-吡啶-1-鹽（化合物-14）的分析數(shù)據(jù)

化合物-14具有如下結(jié)構(gòu)：

化合物-14由陶素（上海）生化科技有限公司提供。cas：1269092-46-7，zinc:65362942。其測(cè)試數(shù)據(jù)如下：ir（kbr，cm^-1）ν：3334，2920，1618，1578，1511，1429，1307，1250，1220，196，999，800；¹h-nmr（400mhz，dmso-d6）δ：8.94（s，1h），7.43（d，j=8.0hz，2h），7.08（d，j=8.0hz，2h），5.79（s，2h），3.54（s，8h），3.37（s，1h），2.63（s，3h），2.31-2.24（m，9h）；¹³c-nmr（100mhz，dmso-d6）δ：166.17，165.89，162.84，162.28，161.93，150.96，138.58，130.87，129.61，124.45，120.28，81.48，43.83，40.58，26.49，20.86，19.11，16.57；ms（esi）m/z：423.23[m+h]⁺。

實(shí)施例15

1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-羰基）-哌嗪-2-酮（化合物-15）的制備

化合物-15具有如下結(jié)構(gòu)：

其制備路線(xiàn)如下：

其具體包括如下步驟：

1）將n-boc-4-哌啶甲酸（15-1）（181mg，0.79mmol）溶解n,n-二甲基甲酰胺（3ml）中，隨后加入n,n-二異丙基乙胺（0.32ml，1.95mmol）和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（pybop，553mg，1.06mmol），加畢，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘，然后冰水浴下慢慢加入用n,n-二甲基甲酰胺（2ml）溶解的1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）（200mg，0.71mmol），加畢，室溫?cái)嚢?小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，用保護(hù)碳酸氫鈉溶液淬滅，乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得到油狀物（15-2）；

2）將濃縮得到的油狀物（15-2）溶解在干燥的二氯甲烷（6ml）中，冰水浴下慢慢加入三氟乙酸（2ml），混合液在室溫下攪拌，tlc檢測(cè)跟蹤至反應(yīng)完成，然后減壓濃縮除去溶劑，濃縮物加入飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和，加入二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮物經(jīng)柱層析分離純化得到白色固體1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-羰基）-哌嗪-2-酮（化合物-15），產(chǎn)率50%。

化合物-15：¹h-nmr（400mhz，dmso-d6）δ：7.20-7.48（m，7h），6.96（d，j=8.7hz，2h），6.03（s，1h），4.09-4.21（m，1h），3.78-3.93（m，1h），3.76（s，3h），3.68-3.75（m，1h），3.52-3.63（m，1h），3.05-3.24（m，2h），2.95-3.05（m，1h），2.70-2.89（m，2h），1.57-1.85（m，4h）；esi-ms：m/z394[m+h]⁺。

實(shí)施例16具體生物測(cè)試實(shí)施方式

下列試驗(yàn)用于測(cè)定本實(shí)驗(yàn)化合物作為lsd1體外酶抑制劑、肝癌細(xì)胞hepg2和肺癌細(xì)胞k562體外增殖抑制劑的活性。

1.lsd1體外酶活性抑制試驗(yàn)

采用購(gòu)自enzolifescience的lsd1熒光藥物試劑盒（instructionmanualbml-ak544）測(cè)試實(shí)施例化合物對(duì)lsd1活性的影響，即以二甲基化的h3-k4肽（h3k4me2）（bml-p256）作為底物。lsd1（bml-se544）可催化h3k4me2產(chǎn)生h2o2，在cellestialtmred基質(zhì)（bml-ki565）存在的情況下，過(guò)氧化氫酶（hrp）可催化h2o2產(chǎn)生熒光信號(hào)（激發(fā)光波長(zhǎng)：530-570nm，發(fā)射光波長(zhǎng)：590nm）。此熒光信號(hào)和lsd1活性呈正相關(guān)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，酶活性越強(qiáng)，實(shí)施例化合物對(duì)酶的抑制活性越低。

具體來(lái)說(shuō)，以反苯環(huán)丙胺為陽(yáng)性對(duì)照，不加任何化合物為陰性對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)兩次，先在384孔板中加入由27.2μl測(cè)定緩沖液，5μl0.1μg/μl的lsd1及各個(gè)濃度的實(shí)施例化合物0.8μl或dh2o0.8μl或反苯環(huán)丙胺（tcp）0.8μl組成的“2×enzymes”，在室溫（23℃）下反應(yīng)30分鐘，再加入由6.7μl測(cè)定緩沖液，1.6μl0.5mm的h3k4me2，0.4μl100×cellestialtmred和0.8μl50×hrp組成的“2×substrates”后，馬上用酶標(biāo)儀讀取熒光值，再軟件擬合各個(gè)實(shí)施例化合物和反苯環(huán)丙胺的ic50值，如表1所示。

表1本發(fā)明化合物體外酶抑制實(shí)驗(yàn)的活性情況

通過(guò)表1的ic50（μm）值可以看出，本發(fā)明化合物-10、11、14對(duì)lsd1的抑制能力分別是參照化合物tcp的12.8倍，4.6倍，3.4倍，故化合物-10、11、14屬于lsd1的高效抑制劑。

2.本實(shí)施例化合物對(duì)肝癌hepg2和急性粒細(xì)胞白血?。╝ml）k562細(xì)胞內(nèi)組蛋白第三位賴(lài)氨酸一甲基化（h3k4me1）及二甲基化（h3k4me2）的影響測(cè)試

分別將hepg2和k562細(xì)胞在加入dmem或rpmi培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng)，使其細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁶細(xì)胞/孔，以濃度為0.02%的dmso作為陰性對(duì)照，用100μm本實(shí)施例化合物及陽(yáng)性參照化合物tcp撫育細(xì)胞，24小時(shí)后收集細(xì)胞，通過(guò)westernblot試驗(yàn)ecl方法，分別用非選擇性h3抗體、選擇性h3k4me1抗體或選擇性h3k4me2抗體，檢測(cè)hepg2細(xì)胞及k562細(xì)胞中h3k4me1和h3k4me2的表達(dá)水平改變，結(jié)果如圖1所示。用imagej軟件對(duì)圖1中hepg2細(xì)胞及k562細(xì)胞進(jìn)行定量分析，分析結(jié)果如圖2和圖3。

從圖1（a）可見(jiàn)，在肝癌hepg2細(xì)胞試驗(yàn)中，化合物-4、10、11、14及陽(yáng)性對(duì)照化合物tcp對(duì)h3k4me1的表達(dá)有提高的趨勢(shì)，tcp及化合物-4、11對(duì)h3k4me2有上調(diào)作用，組蛋白h3及beta-actin未顯示明顯改變。而從圖1（b）可見(jiàn)，在急性粒細(xì)胞白血病k562細(xì)胞試驗(yàn)中，化合物-4、10、11、14及陽(yáng)性對(duì)照化合物tcp對(duì)h3k4me1均有上調(diào)作用，化合物-4、11、14及tcp對(duì)h3k4me2有上調(diào)作用。

3.本實(shí)施例化合物對(duì)肝癌hepg2細(xì)胞的mtt毒性試驗(yàn)

將hepg2細(xì)胞加入dmem或rpmi培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)，使其細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁵胞/孔，以濃度為0.02%的dmso作為陰性對(duì)照，用100μm本實(shí)施例化合物及陽(yáng)性對(duì)照化合物tcp撫育細(xì)胞24小時(shí)后，按照碧云天公司的mtt細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（c0009）操作要求配制5mg/ml的mtt溶液，每孔加入10μlmtt溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時(shí)，然后每孔加入100μlformanzan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶解（通常37℃孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解），于波長(zhǎng)570nm下測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光值，應(yīng)用graphpadprism5軟件繪制圖4，得到本實(shí)施例化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

從圖4可以看出，化合物-4、11、14及陽(yáng)性對(duì)照tcp對(duì)hepg2均顯示明顯的抑制作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。