本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及吡咯喹啉醌或其鹽在制備用于預(yù)防和/或治療雄性生殖功能障礙、或者改善雄性生殖功能的產(chǎn)品中的用途。

背景技術(shù)：

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)，所有育齡夫妻中約有15％都有不孕不育問題，而其中約有一半為男性因素。臨床上，男性不育主要分為無精、少精、弱精以及精子畸形等。目前臨床上通常使用的藥物有核苷酸和氨基酸類制劑以及激素類藥物，效果差強(qiáng)人意，缺少更為有效的改善精子發(fā)生和精子質(zhì)量的治療藥物。

吡咯喹啉醌(pqq)化學(xué)名為4,5-二氫-4,5-二氧化-1-氫吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸(如下式)，是20世紀(jì)70年代末被發(fā)現(xiàn)的一種氧化還原酶的新輔酶，可溶于水，并且具有較好的熱穩(wěn)定性。

其首先被發(fā)現(xiàn)于甲基營養(yǎng)菌中，并被證實(shí)為細(xì)菌脫氫酶的還原型輔因子。盡管哺乳動物本身并不能合成pqq，但可以從食物中獲得，如蔬菜以及肉類。在人類和大鼠的組織中均能檢測到痕量的pqq(pm-nm水平)，其中pqq在人乳中含量最高。pqq最為顯著的生物學(xué)特性是其強(qiáng)大的抗氧化作用，其抗氧化活性約為維生素c的5000倍。大量研究表明pqq可以通過發(fā)揮抗氧化作用來維持哺乳動物的健康。缺乏pqq將會引起哺乳動物嚴(yán)重的健康問題，如生長阻滯以及免疫系統(tǒng)損傷。此外，多項(xiàng)研究表明pqq對小鼠腦和心血管都有很好的保護(hù)作用，并能抑制糖尿病的進(jìn)展。pqq在生殖中的作用也有少量報道，但都是研究其對雌性生殖的影響。steinbergf等的研究結(jié)果顯示飲食中缺乏pqq可以明顯降低雌性小鼠或者大鼠的生育能力，主要表現(xiàn)為受孕率降低以及每窩生仔數(shù)的下降。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)吡咯喹啉醌對雄性不育動物模型具有治療作用，為男性不育提供了一種新的防治選擇。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

吡咯喹啉醌或其鹽在制備用于預(yù)防和/或治療雄性生殖功能障礙、或者改善雄性生殖功能的產(chǎn)品中的用途。所述產(chǎn)品可以為但不限于食品、保健食品或者藥物。

本發(fā)明所述吡咯喹啉醌的鹽包括各種無機(jī)或有機(jī)酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；或者，各種無機(jī)或有機(jī)堿鹽如鈉鹽、鉀鹽、三羥甲基氨基甲烷或n-甲基-葡萄糖胺。

本發(fā)明所述雄性生殖功能障礙為雄性精子發(fā)生障礙，具體的，指精子質(zhì)量異常和/或精子數(shù)量和運(yùn)動異常。更具體的臨床表現(xiàn)為無精癥、少精癥、弱精癥或畸形精子癥。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種預(yù)防和/或治療雄性生殖功能障礙、或者改善雄性生殖功能的食品、保健食品或者藥物，包含吡咯喹啉醌或其鹽。較佳的，含有0.1-99.9％重量百分比的作為活性成分的吡咯喹啉醌或其鹽。

進(jìn)一步的，所述的食品、保健食品或者藥物還包含一種或多種載體、賦形劑和/或稀釋劑?？刹捎闷瑒?、膠囊、沖劑、口服液形式或者為含有吡咯喹啉醌或其鹽的固體或液體食品。

所述載體包括但不限于：離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(sedds)如d-維生素e聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫或其他類似聚合介質(zhì)等藥物制劑用的表面活性劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質(zhì)、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、環(huán)糊精如α-、β-、γ-環(huán)糊精或其經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-β-環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進(jìn)本發(fā)明的食品、保健食品或者藥物的吸收和傳遞。

其他輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯(lián)pvp)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)、吸收促進(jìn)劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發(fā)明的食品、保健食品或者藥物中。

上述吡咯喹啉醌或其鹽以及含有吡咯喹啉醌或其鹽的食品、保健食品或者藥物可通過腸道或者非腸道途徑攝入。可將吡咯喹啉醌或其鹽添加入任何可食用的固體或液體食物中作為功能性食品，也可將吡咯喹啉醌或其鹽作為單一活性成分或者與其它一種或多種活性成分聯(lián)合制成保健食品或者藥品。所述保健食品可采用片劑、膠囊、沖劑、口服液形式。所述藥物制劑包括注射劑、霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。給藥途徑包括皮下、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)注射或輸注，或者，口服、局部、直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、陰道、舌下、皮內(nèi)、粘膜、氣管、尿道給藥，或者通過吸入氣霧或植入蓄積或者針刺方式給藥。本發(fā)明所述吡咯喹啉醌或其鹽以及食品、保健食品或者藥物的治療有效量為0.001-100mg/kg/d之間(以吡咯喹啉醌或其鹽計(jì))，可用于相關(guān)疾病的單一用藥或聯(lián)合用藥治療，為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的范圍。

本發(fā)明利用bmi1缺失(bmi1^-/-)的雄性小鼠模型考察了吡咯喹啉醌治療小鼠精子發(fā)生障礙的作用。bmi1^-/-雄性小鼠是一種典型的精子發(fā)生障礙的動物模型，主要表現(xiàn)為小睪丸、生精結(jié)構(gòu)紊亂以及附睪中幾乎無成熟精子產(chǎn)生。研究表明，bmi1^-/-小鼠睪丸組織中出現(xiàn)生精細(xì)胞嚴(yán)重的dna損傷，并因此導(dǎo)致生精細(xì)胞增殖降低以及凋亡顯著增加。當(dāng)給予斷奶后3周齡bmi1^-/-小鼠pqq飲食補(bǔ)充4周后，吡咯喹啉醌能夠明顯糾正bmi1^-/-小鼠睪丸大小、恢復(fù)其生精結(jié)構(gòu)并顯著增加附睪尾部精子的產(chǎn)生，能夠顯著降低bmi1^-/-小鼠睪丸組織生精細(xì)胞dna損傷，并最終促進(jìn)bmi1^-/-小鼠生精細(xì)胞增殖以及抑制生精細(xì)胞凋亡。

本發(fā)明首次將吡咯喹啉醌用于治療雄性不育，并取得較為理想的治療效果，為臨床應(yīng)用治療雄性不育提供了一種新的防治選擇，具有極高的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為pqq對bmi1缺失引起的精子發(fā)生障礙的影響。(a)7周齡雄鼠睪丸大小大體照。(b)7周齡雄鼠睪丸重量。(c)casa檢測7w齡小鼠附睪尾部精子數(shù)目。(d)7周齡雄鼠睪丸切片he染色(400×)。(e)7周齡雄鼠附睪切片he染色(400×)。*,p<0.05；***,p<0.001與wt小鼠相比；###，p<0.001與bmi1^-/-小鼠相比。

圖2為pqq對bmi1缺失小鼠睪丸組織中氧化應(yīng)激以及dna損傷的影響。(a)流式細(xì)胞術(shù)檢測7周齡雄鼠睪丸組織中ros水平及(b)生精細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。(c)7周齡雄鼠睪丸切片8-ohdg染色顯微圖片(400×)及(d)8-ohdg陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。(e)7周齡雄鼠睪丸切片γ-h2a.x染色顯微圖片(400×)及(f)γ-h2a.x陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。*,p<0.05；***,p<0.001與wt小鼠相比；*,#<0.05；**,#<0.01；***,#<0.001與bmi1^-/-小鼠相比。

圖3為pqq對bmi1缺失小鼠睪丸生精細(xì)胞增殖及凋亡的影響。(a)7周齡雄鼠睪丸切片pcna染色顯微圖片(400×)及(b)pcna陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。(c)7周齡雄鼠睪丸切片tunel染色顯微圖片(400×)及(d)tunel陽性曲細(xì)精管比率統(tǒng)計(jì)圖。***,p<0.001與wt小鼠相比。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實(shí)施例限制。

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。

實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)、繁殖和鑒定

本發(fā)明研究中所有實(shí)驗(yàn)小鼠均由南京醫(yī)科大學(xué)spf級實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。

本研究采用bmi-1基因敲除雜合子小鼠(bmi1^+/-)(129ola/fvb/n雜交背景)(由荷蘭腫瘤研究所antonberns教授惠贈)，進(jìn)行雌雄配對合籠，以獲得野生型(wt)和bmi1純合子(bmi1^-/-)小鼠。取bmi1^+/-后代小鼠尾巴，提取dna,利用bmi1特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳鑒定小鼠基因型，以獲得實(shí)驗(yàn)所需純合子雄性小鼠。

動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循南京醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)管理規(guī)定，經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核。

藥物處理

將3周齡bmi1^-/-小鼠隨機(jī)分為普通飲食組或添加pqq(sigma,usa)(4mgpqq/kgdiet)(由北京科奧協(xié)力飼料有限公司合成)飲食組，以同窩wt小鼠作為對照。7周齡時將小鼠進(jìn)行處理分析。

動物取材

7周齡小鼠經(jīng)麻醉后，取下小鼠睪丸和附睪，左側(cè)置于4％多聚甲醛中，右側(cè)于-80℃保存。

睪丸、附睪切片

4％多聚甲醛固定后組織經(jīng)系列酒精上行脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、橫斷面切片，片厚5μm用于組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色。

組織化學(xué)、免疫組化以及tunel染色

1)he染色：睪丸及附睪切片經(jīng)脫蠟、水化，he染色；

2)免疫組織化學(xué)染色：睪丸切片經(jīng)脫蠟、水化以及高溫法抗原修復(fù)后，孵育一抗過夜。第二天孵育二抗，dab顯色。一抗：pcna(abcam,usa)，γ-h2a.x(ser139)(cellsignalingtechnology,usa)，8hydroxyguanosine(8-ohdg)(abcam,usa)。二抗：生物素結(jié)合的羊抗小鼠igg(fab段)抗體(sigma,usa)、生物素結(jié)合的羊抗兔igg(全分子)抗體(sigma,usa)、生物素結(jié)合的兔抗山羊igg(全分子)抗體(sigma,usa)；

3)tunel染色：睪丸切片經(jīng)脫蠟、水化，按照凋亡試劑盒(roche,usa)說明書進(jìn)行染色。

流式細(xì)胞術(shù)檢測活性氧(ros)

取小鼠睪丸組織制備單細(xì)胞懸液，dcfda(sigma,japan)染色。流式細(xì)胞術(shù)檢測生精細(xì)胞活性氧水平。

精子計(jì)數(shù)

取小鼠附睪尾部，放入37℃預(yù)熱的pbs中，橫向三刀縱向2刀剪開附睪尾部，使精子游離出來。放置5mins，上機(jī)檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.pqq對bmi1缺失小鼠精子發(fā)生障礙的影響

為了明確pqq能否夠改善bmi1缺失小鼠的生精障礙，本發(fā)明通過檢測睪丸大小、重量以及利用casa精子計(jì)數(shù)和he染色等方法，比較分析7周齡wt、bmi1^-/-以及pqq給予的bmi1^-/-雄鼠睪丸大小、重量、精子數(shù)量以及睪丸生精結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖1-a～e所示，圖1-a為7周齡雄鼠睪丸大小大體照。圖1-b為7周齡雄鼠睪丸重量。圖1-c為casa檢測7w齡小鼠附睪尾部精子數(shù)目。圖1-d為7周齡雄鼠睪丸切片he染色(400×)。圖1-e為7周齡雄鼠附睪切片he染色(400×)。*,p<0.05；***,p<0.001與wt小鼠相比；###，p<0.001與bmi1^-/-小鼠相比。結(jié)果表明，相較于bmi1^-/-雄鼠，pqq處理的bmi1^-/-雄鼠睪丸體積增大、睪丸重量及精子數(shù)量明顯增加，生精結(jié)構(gòu)也趨于正常。

對bmi1缺失引小鼠睪丸組織中氧化應(yīng)激以及dna損傷的影響

為了明確pqq能否通過抑制氧化應(yīng)激從而降低bmi1^-/-雄性小鼠生精細(xì)胞的dna氧化損傷以及dna損傷反應(yīng)，本發(fā)明通過流式細(xì)胞術(shù)以及免疫組化，比較分析7周齡wt、bmi1^-/-以及pqq給予的bmi1^-/-雄鼠睪丸組織中活性氧(ros)、dna氧化損傷指標(biāo)8-ohdg以及dna損傷反應(yīng)指標(biāo)γh2a.x水平的變化。結(jié)果如圖2-a～f所示，圖2-a為流式細(xì)胞術(shù)檢測7周齡雄鼠睪丸組織中ros水平。圖2-b為生精細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。圖2-c為7周齡雄鼠睪丸切片8-ohdg染色顯微圖片(400×)。圖2-d為8-ohdg陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。圖2-e為7周齡雄鼠睪丸切片γ-h2a.x染色顯微圖片(400×)。圖2-f為γ-h2a.x陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。*,p<0.05；***,p<0.001與wt小鼠相比；*,#<0.05；**,#<0.01；***,#<0.001與bmi1^-/-小鼠相比。

結(jié)果表明，相較于bmi1^-/-雄鼠，pqq給予的bmi1^-/-雄鼠睪丸組織中ros水平顯著降低、8-ohdg及γh2a.x陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。表明pqq能夠抑制bmi1^-/-雄性小鼠生精細(xì)胞細(xì)胞的dna氧化損傷以及dna損傷反應(yīng)。

對bmi1缺失引小鼠睪丸生精細(xì)胞增殖及凋亡的影響

為了進(jìn)一步明確pqq能否通過降低bmi1^-/-雄性小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激水平、生精細(xì)胞的dna氧化損傷以及dna損傷反應(yīng)，從而促進(jìn)生精細(xì)胞增殖、抑制生精細(xì)胞凋亡。本發(fā)明通過免疫組化，比較分析7周齡wt、bmi1^-/-以及pqq給予的bmi1^-/-雄鼠睪丸組織中增殖指標(biāo)pcna以及凋亡指標(biāo)tunel水平的變化。結(jié)果如圖3-a～d所示，結(jié)果表明，相較于bmi1^-/-雄鼠，pqq給予的bmi1^-/-雄鼠睪丸組織中pcna陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加而tunel陽性曲細(xì)精管比率均顯著降低，說明pqq能夠促進(jìn)bmi1^-/-小鼠生精細(xì)胞增殖、抑制生精細(xì)胞凋亡。