本發(fā)明屬于西藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及烏苯美司在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤癌癥疾病是二十一世紀(jì)人類第一殺手?；瘜W(xué)療法是治療惡性腫瘤的重要方法，常用于腫瘤化療的藥物包括5-氟尿嘧啶及其衍生物、鉑類藥物、蒽環(huán)類藥物等，5-氟尿嘧啶及其衍生物是第一類根據(jù)一定設(shè)想合成的且是目前臨床應(yīng)用最廣的化療藥物，主要機(jī)制是通過細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的氟尿嘧啶脫氧核苷酸，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性而減少dna的合成。該類化合物對(duì)食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等消化道癌及乳腺癌、卵巢癌等其他實(shí)體瘤有良好療效，在腫瘤內(nèi)科治療中占有重要地位。

近年來研究表明腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性逐漸降低，耐藥性逐漸增強(qiáng)，且多項(xiàng)研究表明多種瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，還可對(duì)不同作用機(jī)制的其他化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(multi-drugresistance，mdr)，mdr的出現(xiàn)已經(jīng)成為腫瘤化療的最大障礙。尋找腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)成為提高腫瘤化療療效的關(guān)鍵。

烏苯美司作為一種免疫增強(qiáng)劑，是目前唯一應(yīng)用于臨床的cd13抑制劑，其應(yīng)用于白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合癥及造血干細(xì)胞移植后，以及其它實(shí)體瘤患者的輔助治療，相關(guān)治療機(jī)制是通過增強(qiáng)t、b淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(nk)的殺傷活力，增加集落刺激因子合成，刺激骨髓細(xì)胞的再生及分化，調(diào)節(jié)和恢復(fù)機(jī)體免疫功能。

而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)烏苯美司在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性方面具有很好的效果，作為腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)烏苯美司作為一種逆轉(zhuǎn)劑在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性方面中具有很好的應(yīng)用效果。

為克服上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，其包括烏苯美司或其藥效成分。

進(jìn)一步，所述逆轉(zhuǎn)劑即為烏苯美司。

本發(fā)明還提供一種治療腫瘤的聯(lián)合藥物，其包括作為逆轉(zhuǎn)劑的烏苯美司和其他化療藥成分。

所述其他化療藥成分可以為呋喃氟尿嘧啶、卡培他濱或5’-脫氧氟尿苷。

所述化療藥與烏苯美司之間的質(zhì)量比為1∶1-10∶1。

所述腫瘤為肝癌、胃癌或結(jié)腸癌。

本發(fā)明還提供上述逆轉(zhuǎn)劑在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性上的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供烏苯美司在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性上的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供烏苯美司在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑上的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供烏苯美司或其有效成分和其他化療藥或其有效成分在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

有益的技術(shù)效果

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)烏苯美司在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性上具有很好的效果。

附圖說明

圖1人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu的增殖能力情況；

圖2人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp的增殖能力情況；

圖3人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株ht-29/x的增殖能力情況；

圖4烏苯美司與化療藥物在不同配比下的聯(lián)合使用對(duì)hepg2/5-fu耐藥細(xì)胞株增殖能力的影響；

圖5烏苯美司與化療藥物在不同配比下的聯(lián)合使下hepg2/5-fu細(xì)胞中5’-脫氧氟尿苷的蓄積情況；

圖6呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司在不同配比下的聯(lián)合使用對(duì)sgc7901/ddp細(xì)胞增殖能力的影響；

圖7呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司在不同配比下，sgc7901/ddp細(xì)胞中呋喃氟尿嘧啶的蓄積情況；

圖8卡培他濱與烏苯美司在不同配比下的聯(lián)合使用對(duì)ht-29/x耐藥細(xì)胞株增殖能力的影響；

圖9卡培他濱與烏苯美司在不同配比下，卡培他濱在ht-29/x細(xì)胞內(nèi)的蓄積情況。

具體實(shí)施方式

以下采用實(shí)施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

耐藥性實(shí).驗(yàn)驗(yàn)證

1、選用人肝癌細(xì)胞株hepg2，采用藥物濃度梯度遞增誘導(dǎo)法建立人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu，具體過程如下。

選用人肝癌細(xì)胞株hepg2(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，細(xì)胞培養(yǎng)使用含15％新生牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫，且含4％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱，細(xì)胞消化傳代用含edta的0.25％胰蛋白酶。

取對(duì)數(shù)生長期hepg2細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞濃度為1×10⁵/ml。待細(xì)胞貼壁后，更換含5-氟尿嘧啶(5-fu)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，5-fu的起始濃度為2000μg/l，3d后棄去細(xì)胞上清及懸浮細(xì)胞，存活下來的細(xì)胞經(jīng)磷酸緩沖鹽沖洗、胰酶消化后，以1×10⁶/ml細(xì)胞濃度接種于不含藥的培養(yǎng)瓶中。

向上述細(xì)胞中加入含兩倍濃度5-fu的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3d，如此不斷重復(fù)上述步驟，直到hepg2細(xì)胞能在5-fu濃度為2×10⁴μg/l的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長并傳代，用時(shí)大約4個(gè)月，順利誘導(dǎo)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu。

2、選用人胃癌細(xì)胞株sgc7901(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，采用藥物沖擊方法誘導(dǎo)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp，具體過程如下。

選用人胃癌細(xì)胞株sgc7901，細(xì)胞培養(yǎng)使用含10％胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫，且含4％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱，細(xì)胞消化傳代用含edta的0.25％胰蛋白酶。

取對(duì)數(shù)生長期sgc7901細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞濃度為1×10⁵個(gè)/ml。待細(xì)胞貼壁并生長至約70％-90％滿瓶時(shí)，用含順鉑(ddp)4×10³μmol/l的培養(yǎng)液培養(yǎng)，12h后棄去含藥培養(yǎng)液，存活下來的細(xì)胞經(jīng)磷酸緩沖鹽沖洗、胰酶消化后，以1×10⁶/ml細(xì)胞濃度接種于不含藥的培養(yǎng)瓶中。

待細(xì)胞逐漸長至70％-80％滿瓶時(shí)再次用含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)，同樣方法反復(fù)多次沖擊，最終用時(shí)4個(gè)月，順利誘導(dǎo)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp。

3、選用人結(jié)腸癌細(xì)胞株ht-29，采用大劑量奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶、順鉑共同沖擊誘導(dǎo)建立人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株ht-29/x，具體過程如下：

選用人結(jié)腸癌細(xì)胞株ht-29，細(xì)胞培養(yǎng)使用含10％新生牛血清、無抗生素的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫，且含4％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱，細(xì)胞消化傳代用含edta的0.25％胰蛋白酶。

將處于對(duì)數(shù)生長期的ht-29細(xì)胞株，細(xì)胞濃度調(diào)整為2×10⁴/ml，細(xì)胞生長至約70％-90％時(shí)，先用100μmol/l奧沙利鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)15min，再用100μmol/l5-氟尿嘧啶、順鉑混合培養(yǎng)基培養(yǎng)0.5h，12h后棄去含藥培養(yǎng)液，存活下來的細(xì)胞經(jīng)磷酸緩沖鹽沖洗、胰酶消化后，以1×10⁶/ml細(xì)胞濃度接種于不含藥的培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞再次生長至約70％-90％時(shí)，重復(fù)上述藥物沖擊的步驟，歷時(shí)7個(gè)月，得到多藥耐藥ht-29/x細(xì)胞株。

耐藥細(xì)胞株耐藥指數(shù)、增殖能力和遷移能力的評(píng)價(jià)

耐藥指數(shù)評(píng)價(jià)：

收集上述三種腫瘤細(xì)胞株和相應(yīng)的耐藥細(xì)胞株，將細(xì)胞濃度均調(diào)整為1×10⁴/ml，以每孔100ul分別接種于六塊96孔板，分別為hepg2和hepg2/5-fu共兩塊孔板、sgc7901和sgc7901/ddp共兩塊孔板、ht-29和ht-29/x共兩塊孔板，每塊板上均設(shè)三個(gè)組，分別為不加藥組、加藥組、無細(xì)胞的空白組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

(1)無細(xì)胞的空白組中只有非藥培養(yǎng)基；

(2)不加藥組的細(xì)胞使用非藥培養(yǎng)基(如前文所述)孵育48h；

(3)加藥組的細(xì)胞在使用非藥培養(yǎng)基(如前文所述)孵育24h后，再換用含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)：加藥組共有三種藥即5-fu、順鉑和奧沙利鉑，每種藥物的濃度為600、300、100、50、25、6.25umol/l，孵育48h，去除含藥液，每孔加100ul不含藥培養(yǎng)基和10ulcck-8，孵育2h后，用酶標(biāo)儀測(cè)波長為450nm處的光密度值。設(shè)a為加藥組的吸光度，b為不加藥細(xì)胞組的吸光度，c為無細(xì)胞的空白組的吸光度，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率(％)＝1-[(a-c)/(b-c)]×100％，計(jì)算上述三種藥物抑制率為50％的濃度(ic50)和耐藥指數(shù)(ri)，ri＝耐藥細(xì)胞ic50/親本細(xì)胞ic50。

增殖能力評(píng)價(jià)：

處于對(duì)數(shù)生長期的三種耐藥細(xì)胞株分別制成細(xì)胞濃度1×10⁴/ml，分別接種于3個(gè)96孔板，每孔體積為100ul，均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，采用cck-8細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑分別檢測(cè)上述細(xì)胞株在波長為450nm處的光密度值(od450)，od450越大，細(xì)胞活性及增殖能力越強(qiáng)，時(shí)間梯度為24h、48h、72h，并繪制3種細(xì)胞生長曲線。

遷移能力評(píng)價(jià)：

處于對(duì)數(shù)生長期的三種耐藥細(xì)胞株分別接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，在6孔板底部劃痕并換用無血清培養(yǎng)基，分別于劃痕后的0、18、36h在同一點(diǎn)拍照，劃痕后0h距離設(shè)100％，其余時(shí)間點(diǎn)距離與0h距離的百分比值反映細(xì)胞遷徙能力。

結(jié)果分析

耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu、sgc7901/ddp和ht-29/x耐藥指數(shù)評(píng)價(jià)

表1耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu耐藥指數(shù)分析

表1顯示了耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu對(duì)三種化療藥物的耐藥情況，從表1可以看出，耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu對(duì)5-fu(5-氟尿嘧啶)、順鉑和奧沙利鉑均產(chǎn)生耐藥性，其中，對(duì)順鉑的耐藥指數(shù)最高。

表2耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp耐藥指數(shù)分析

表2顯示了耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp對(duì)三種化療藥物的耐藥情況，從表2可以看出，耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp對(duì)5-fu、順鉑和奧沙利鉑均產(chǎn)生耐藥性，其中，對(duì)5-fu的耐藥指數(shù)最高。

表3耐藥細(xì)胞株ht-29/x耐藥指數(shù)分析

表3顯示了耐藥細(xì)胞株ht-29/x對(duì)三種化療藥物的耐藥情況，從表3可以看出，耐藥細(xì)胞株ht-29/x對(duì)5-fu、順鉑和奧沙利鉑均產(chǎn)生耐藥性，其中，對(duì)順鉑的耐藥指數(shù)最高。

耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu、sgc7901/ddp和ht-29/x增殖能力分析

圖1顯示了人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu的增殖能力，從圖1可以看出，hepg2/5-fu細(xì)胞在24h、48h和72h的od450值分別為1.53±0.2、2.01±0.4、2.51±0.3，而hepg2細(xì)胞在24h、48h和72h的od450值分別為0，91±0.2、1.12±0.3、1.89±0.4，od450值越大，細(xì)胞活性及增殖能力越強(qiáng)因此，耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu的增殖能力強(qiáng)于親本細(xì)胞hepg2。

圖2顯示了人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp的增殖能力，從圖2可以看出，sgc7901/ddp細(xì)胞在24h、48h和72h的od450值分別為0.56±0.1、1.15±0.2、1.51±0.1，而hepg2細(xì)胞在24h、48h和72h的od450值分別為0.49±0.2、0.76±0.2、0.99±0.2，od450值越大，細(xì)胞活性及增殖能力越強(qiáng)因此，耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp的增殖能力強(qiáng)于親本細(xì)胞sgc7901。

圖3顯示了人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株ht-29/x的增殖能力，從圖3可以看出，ht-29/x細(xì)胞在24h、48h和72h的od450值分別為0.60±0.1、0.81±0.3、1.31±0.2，而ht-29細(xì)胞在24h、48h和72h的od450值分別為0.59±0.2、0.71±0.3、1.10±0.1，od450值越大，細(xì)胞活性及增殖能力越強(qiáng)耐藥細(xì)胞株ht-29/x的增殖能力強(qiáng)于親本細(xì)胞ht-29。

耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu、sgc7901/ddp和ht-29/x遷徙能力分析

表4耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu遷徙能力分析

從表4可以看出，耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu在18h和36h的遷徙時(shí)間內(nèi)，遷徙距離百分比均顯著大于親本細(xì)胞hepg2，遷徙能力更強(qiáng)。

表5耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp遷徙能力分析

從表5可以看出，耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp在18h和36h的遷徙時(shí)間內(nèi)，遷徙距離百分比均顯著大于于親本細(xì)胞sgc7901，遷徙能力更強(qiáng)。

表6耐藥細(xì)胞株ht-29/x遷徙能力分析

從表5可以看出，耐藥細(xì)胞株ht-29/x在18h和36h的遷徙時(shí)間內(nèi)，遷徙距離百分比均顯著大于親本細(xì)胞ht-29，遷徙能力更強(qiáng)。

結(jié)論：通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，采用本發(fā)明方案建立的人耐藥細(xì)胞株與親本細(xì)胞相比，增殖和遷徙能力增強(qiáng)，且上述耐藥細(xì)胞株對(duì)多種化療藥物穩(wěn)定耐藥。

烏苯美司對(duì)上述耐藥細(xì)胞株耐藥指數(shù)的影響分析

收集烏苯美司(100μg/ml)處理24h或未經(jīng)處理的上述三種耐藥細(xì)胞株，調(diào)整濃度為1×10⁴個(gè)/ml，以每孔100ul分別接種于六塊96孔板，分別為hepg2/5-fu共兩塊孔板，包括烏苯美司處理組和非烏苯美司處理組、sgc7901/ddp共兩塊孔板，包括烏苯美司處理組和非烏苯美司處理組，ht-29/x共兩塊孔板，包括烏苯美司處理組和非烏苯美司處理組。每塊板上均設(shè)三個(gè)組，分別為不加藥組、加藥組、無細(xì)胞的空白組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

(1)無細(xì)胞的空白組中只有非藥培養(yǎng)基。

(2)不加藥組的細(xì)胞(細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml)，使用非藥培養(yǎng)基(如前文所述)孵育48h。

(3)加藥組共有三種藥即5-fu、順鉑和奧沙利鉑，每種藥物的濃度為600、300、100、50、25、6.25umol/l，孵育48h，去除含藥液，每孔加100ul不含藥培養(yǎng)基和10ulcck-8，孵育2h后，用酶標(biāo)儀測(cè)波長為450nm處的光密度值。設(shè)a為加藥組的吸光度，b為不加藥細(xì)胞組的吸光度，c為無細(xì)胞的空白組的吸光度，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率(％)＝1-[(a-c)/(b-c)]×100％，計(jì)算上述三種藥物抑制率為50％的濃度(ic50)和耐藥指數(shù)(ri)，ri＝耐藥細(xì)胞ic50/親本細(xì)胞ic50。

表7烏苯美司對(duì)耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu耐藥指數(shù)的影響

從表7可以看出，經(jīng)過烏苯美司處理過的耐藥細(xì)胞株hepg2/5-fu的耐藥指數(shù)較不處理的耐藥細(xì)胞株有顯著的下降。

表8烏苯美司對(duì)耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp耐藥指數(shù)的影響

從表8可以看出，經(jīng)過烏苯美司處理過的耐藥細(xì)胞株sgc7901/ddp的耐藥指數(shù)較不處理的耐藥細(xì)胞株有顯著的下降。

表9烏苯美司對(duì)耐藥細(xì)胞株ht-29/x耐藥指數(shù)的影響

從表9可以看出，經(jīng)過烏苯美司處理過的耐藥細(xì)胞株ht-29/x的耐藥指數(shù)較不處理的耐藥細(xì)胞株有顯著的下降。

結(jié)論：從表7至表9可以看出，烏苯美司能夠逆轉(zhuǎn)上述耐藥細(xì)胞株的耐藥性。

烏苯美司與化療藥物在不同配比下的聯(lián)合使用對(duì)上述耐藥細(xì)胞株增殖能力、遷徙能力評(píng)價(jià)

本發(fā)明將化療藥5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司分別按照10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1的配比聯(lián)合應(yīng)用，測(cè)定其對(duì)hepg2/5-fu增殖能力和遷徙能力的影響，評(píng)價(jià)在不同配比的情況下，hepg2/5-fu細(xì)胞中5’-脫氧氟尿苷的蓄積情況。具體步驟如下：烏苯美司的給藥濃度為100μg/ml，將5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司按照10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1的濃度比混溶于溶劑dmso中：

(1)增殖能力評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的hepg2/5-fu細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×10⁴個(gè)/ml，以每孔體積為100ul，分別接種于3個(gè)96孔板(24h、48h、72h)，每塊板分為4個(gè)組(10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1配比組)，每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，采用cck-8細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑分別檢測(cè)上述細(xì)胞株在波長為450nm處的光密度值(od450)，od450越大，細(xì)胞活性及增殖能力越強(qiáng)，時(shí)間梯度為24h、48h、72h，并繪制hepg2/5-fu細(xì)胞的生長曲線。

(2)遷徙能力評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的hepg2/5-fu細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，在6孔板底部劃痕并換用無血清培養(yǎng)基，分別于劃痕后的0、18、36h在同一點(diǎn)拍照，劃痕后0h距離設(shè)100％，其余時(shí)間點(diǎn)距離與0h距離的百分比值反映細(xì)胞遷徙能力。

(3)hepg2/5-fu細(xì)胞中5’-脫氧氟尿苷的蓄積情況評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的hepg2/5-fu細(xì)胞，用預(yù)冷的pbs將其濃度調(diào)整為2×10⁶/ml，加入300μl細(xì)胞裂解液，釋放出的5’-脫氧氟尿苷通過液相-二級(jí)質(zhì)譜儀(lc-ms/ms)進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見圖4、表10和圖5。

圖4顯示了烏苯美司與化療藥物在不同配比下的聯(lián)合使用對(duì)hepg2/5-fu耐藥細(xì)胞株增殖能力的影響。從圖4可以看出，與烏苯美司和5’-脫氧氟尿苷單獨(dú)使用相比，兩者以不同比例聯(lián)合使用時(shí)，hepg2/5-fu細(xì)胞的增殖能力均有不同程度的下降，且在5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司的比例為5：1的時(shí)候，hepg2/5-fu細(xì)胞的增殖能力最弱。

表10烏苯美司與化療藥物在不同配比下的聯(lián)合使用對(duì)hepg2/5-fu遷徙能力的影響

從表10可以看出，相對(duì)于純的烏苯美司和5’-脫氧氟尿苷，兩者的聯(lián)合使用時(shí)，hepg2/5-fu細(xì)胞遷徙距離百分比都有不同程度的下降，其中在5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司的比例為5∶1的時(shí)候，下降程度最大，說明5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司在該配比下，對(duì)hepg2/5-fu細(xì)胞遷徙能力的抑制作用最強(qiáng)。

圖5顯示烏苯美司與化療藥物在不同配比下的聯(lián)合使下，hepg2/5-fu細(xì)胞中5’-脫氧氟尿苷的蓄積情況。從圖5可以看出，5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司的比例為5：1時(shí)，hepg2/5-fu細(xì)胞中的5’-脫氧氟尿苷濃度最高。

上述結(jié)果表明，相對(duì)于純的烏苯美司和5’-脫氧氟尿苷，兩者的聯(lián)合使用時(shí)，hepg2/5-fu細(xì)胞的增殖能力和遷徙距離百分比都有不同程度的下降，其中在5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司的比例為5∶1的時(shí)候，hepg2/5-fu細(xì)胞的增殖能力最弱，遷徙距離下降程度最大，且此時(shí)hepg2/5-fu細(xì)胞中的5’-脫氧氟尿苷濃度最高，說明5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司在該配比下，對(duì)烏苯美司能夠促進(jìn)5’-脫氧氟尿苷在hepg2/5-fu細(xì)胞內(nèi)的濃度，對(duì)其生長、遷徙抑制作用最強(qiáng)。

本發(fā)明將化療藥呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司分別按照10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1的配比聯(lián)合應(yīng)用，測(cè)定其對(duì)sgc7901/ddp增殖能力和遷徙能力的影響，評(píng)價(jià)在不同配比的情況下，sgc7901/ddp細(xì)胞中呋喃氟尿嘧啶的蓄積情況。具體步驟如下：烏苯美司的給藥濃度為1001μg/ml，將呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司按照10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1的濃度比混溶于溶劑dmso中：

(1)增殖能力評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的sgc7901/ddp細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×10⁴個(gè)/ml，以每孔體積為100ul，分別接種于3個(gè)96孔板(24h、48h、72h)，每塊板分為4個(gè)組(10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1配比組)，每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，采用cck-8細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑分別檢測(cè)上述細(xì)胞株在波長為450nm處的光密度值(od450)，od450越大，細(xì)胞活性及增殖能力越強(qiáng)，時(shí)間梯度為24h、48h、72h，并繪制hepg2/5-fu細(xì)胞的生長曲線。

(2)遷徙能力評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的sgc7901/ddp細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，在6孔板底部劃痕并換用無血清培養(yǎng)基，分別于劃痕后的0、18、36h在同一點(diǎn)拍照，劃痕后0h距離設(shè)100％，其余時(shí)間點(diǎn)距離與0h距離的百分比值反映細(xì)胞遷徙能力。

(3)sgc7901/ddp細(xì)胞中呋喃氟尿嘧啶的蓄積情況評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的sgc7901/ddp細(xì)胞，用預(yù)冷的pbs將其濃度調(diào)整為2×10⁶/ml，加入300μl細(xì)胞裂解液，釋放出的呋喃氟尿嘧啶通過液相-二級(jí)質(zhì)譜儀(lc-ms/ms)進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見圖6、表11和圖7。

圖6顯示呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司在不同配比下的聯(lián)合使用，對(duì)sgc7901/ddp細(xì)胞增殖能力的影響，從圖6可以看出，與烏苯美司和呋喃氟尿嘧啶單獨(dú)使用相比，兩者以不同比例聯(lián)合使用時(shí)，sgc7901/ddp細(xì)胞的增殖能力均有不同程度的下降，且在呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司的比例為5∶1和10∶1的時(shí)候，sgc7901/ddp細(xì)胞的增殖能力最弱。

表11呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司在不同配比下的聯(lián)合使用，sgc7901/ddp遷徙能力的影響

圖7顯示呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司在不同配比下，sgc7901/ddp細(xì)胞中呋喃氟尿嘧啶的蓄積情況，從圖7可以看出，呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司的比例為5∶1和10∶1時(shí)，sgc7901/ddp細(xì)胞中的呋喃氟尿嘧啶濃度最高。上述結(jié)果表明，相對(duì)于純的烏苯美司和呋喃氟尿嘧啶，兩者的聯(lián)合使用時(shí)，sgc7901/ddp細(xì)胞的增殖能力和遷徙距離百分比都有不同程度的下降，其中在呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司的比例為5∶1和10∶1的時(shí)候，sgc7901/ddp細(xì)胞的增殖能力最弱，遷徙距離下降程度最大，且此時(shí)sgc7901/ddp細(xì)胞中的呋喃氟尿嘧啶濃度最高，說明呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司在上述配比下，對(duì)烏苯美司能夠促進(jìn)呋喃氟尿嘧啶在sgc7901/ddp細(xì)胞內(nèi)的濃度，對(duì)其生長、遷徙抑制作用最強(qiáng)。

本發(fā)明將化療藥卡培他濱與烏苯美司分別按照10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1的配比聯(lián)合應(yīng)用，測(cè)定其對(duì)ht-29/x細(xì)胞增殖能力和遷徙能力的影響，評(píng)價(jià)在不同配比的情況下，ht-29/x中卡培他濱的蓄積情況。具體步驟如下：烏苯美司的給藥濃度為1001μg/ml，將卡培他濱與烏苯美司按照10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1的濃度比混溶于溶劑dmso中：

(1)增殖能力評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)卡培他濱與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的ht-29/x細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×10⁴個(gè)/ml，以每孔體積為100ul，分別接種于3個(gè)96孔板(24h、48h、72h)，每塊板分為4個(gè)組(10∶1、5∶1、2.5∶1和1∶1配比組)，每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，采用cck-8細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑分別檢測(cè)上述細(xì)胞株在波長為450nm處的光密度值(od450)，od450越大，細(xì)胞活性及增殖能力越強(qiáng)，時(shí)間梯度為24h、48h、72h，并繪制hepg2/5-fu細(xì)胞的生長曲線。

(2)遷徙能力評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)卡培他濱與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的ht-29/x細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，在6孔板底部劃痕并換用無血清培養(yǎng)基，分別于劃痕后的0、18、36h在同一點(diǎn)拍照，劃痕后0h距離設(shè)100％，其余時(shí)間點(diǎn)距離與0h距離的百分比值反映細(xì)胞遷徙能力。

(3)ht-29/x細(xì)胞中卡培他濱的蓄積情況評(píng)價(jià)：

收集經(jīng)卡培他濱與烏苯美司共同處理24h或未經(jīng)處理的ht-29/x細(xì)胞，用預(yù)冷的pbs將其濃度調(diào)整為2×10⁶/ml，加入3001μl細(xì)胞裂解液，釋放出的卡培他濱通過液相-二級(jí)質(zhì)譜儀(lc-ms/ms)進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見圖8、表12和圖9。

圖8顯示卡培他濱與烏苯美司在不同配比下，對(duì)ht-29/x耐藥細(xì)胞株增殖能力的影響，從圖8可以看出，與烏苯美司和卡培他濱單獨(dú)使用相比，兩者以不同比例聯(lián)合使用時(shí)，ht-29/x細(xì)胞的增殖能力均有不同程度的下降，且在卡培他濱與烏苯美司的比例為5∶1和2.5∶1的時(shí)候，ht-29/x細(xì)胞的增殖能力最弱。

表12卡培他濱與烏苯美司在不同配比下，對(duì)ht-29/x遷徙能力的影響

圖9顯示卡培他濱與烏苯美司在不同配比下，卡培他濱在ht-29/x細(xì)胞內(nèi)的蓄積情況。從圖9可以看出，卡培他濱與烏苯美司的比例為5∶1和2.5∶1時(shí)，ht-29/x細(xì)胞中的卡培他濱濃度最高。

上述結(jié)果表明，相對(duì)于純的烏苯美司和卡培他濱，兩者的聯(lián)合使用時(shí)，ht-29/x細(xì)胞的增殖能力和遷徙距離百分比都有不同程度的下降，其中在卡培他濱與烏苯美司的比例為5∶1和2.5∶1的時(shí)候，ht-29/x細(xì)胞的增殖能力最弱，遷徙距離下降程度最大，且此時(shí)ht-29/x細(xì)胞中的卡培他濱濃度最高，說明卡培他濱與烏苯美司在上述配比下，對(duì)烏苯美司能夠促進(jìn)卡培他濱在ht-29/x細(xì)胞內(nèi)的濃度，對(duì)其生長、遷徙抑制作用最強(qiáng)。

結(jié)論：

5’-脫氧氟尿苷與烏苯美司在5∶1配比時(shí)，對(duì)hepg2/5-fu增殖和遷徙的抑制作用最強(qiáng)，5’-脫氧氟尿苷在細(xì)胞內(nèi)的蓄積濃度最高。

呋喃氟尿嘧啶與烏苯美司在10∶1、5∶1配比時(shí)，對(duì)sgc7901/ddp增殖和遷徙的抑制作用最強(qiáng)，呋喃氟尿嘧啶在細(xì)胞內(nèi)的蓄積濃度最高。

卡培他濱與烏苯美司配在5∶1、2.5∶1配比時(shí)，對(duì)ht-29/x細(xì)胞增殖和遷徙的抑制作用最強(qiáng)，卡培他濱在在細(xì)胞內(nèi)的蓄積濃度最高。

所有上述的首要實(shí)施這一知識(shí)產(chǎn)權(quán)，并沒有設(shè)定限制其他形式的實(shí)施這種新產(chǎn)品和/或新方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將利用這一重要信息，上述內(nèi)容修改，以實(shí)現(xiàn)類似的執(zhí)行情況。但是，所有修改或改造基于本發(fā)明新產(chǎn)品屬于保留的權(quán)利。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。