一種從蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，該方法包括以下步驟：(1)將蠶沙用酸性水或酸性稀乙醇溶劑提取，提取液過濾，濃縮；(2)取陽離子交換樹脂，將步驟(1)中得到的濃縮液上樣，用酸性水和水洗脫，收集酸性水和水洗脫液，濃縮，再用稀氨水溶液洗脫，收集稀氨水洗脫液；(3)將步驟(2)得到的酸性水和水洗脫濃縮液，通過聚酰胺層析柱純化，上樣，分別用水、乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物。(4)將步驟(2)所得的稀氨水洗脫液，濃縮至pH中性，通過氧化鋁層析柱純化，上樣，并用乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物。該方法制得的亞氨基糖及黃酮提取物含量高，且工藝簡單，成本低。
【專利說明】一種從蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明具體涉及一種從蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蠶沙為家蠶(Bombyx mori L.)幼蟲蠶食桑葉后排泄出來的糞便。據(jù)測定，風干蠶沙中除含有9.9%的水份，還含有90.1%的干物質(zhì)(含粗蛋白13.6%，粗脂肪3.7%，無氮浸出物48.7%，粗纖維12.5%，灰分12.6% )。蠶沙中含有18種氨基酸，其含量達到4.4%。
[0003]蠶沙中含有多種亞氨基糖類物質(zhì)，如1-脫氧野尻霉素、fagomine、3-ep1-fagomine，其中以1_脫氧野尻霉素含量最高，這類物質(zhì)具有降血糖、抗病毒等作用。中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?00910167602.5中公開了一種從蠶沙等中藥中分離高純度1_脫氧野尻霉素的方法，該方法需要將樣品通過陰離子交換樹脂純化后再經(jīng)過陽離子交換樹脂進行純化，然后經(jīng)過有機溶劑萃取、重結(jié)晶、凝膠柱層析純化得到高純度1-脫氧野尻霉素，該方法較繁瑣，而且所用萃取的有機溶劑氯仿毒性較大，且為易制毒試劑，不適合放大生產(chǎn)，且對環(huán)境會產(chǎn)生潛在污染。
[0004]蠶沙中還含有多種黃酮類成分，具有很強的生理活性。中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?00910167602.5中公開了一種從蠶沙中制備粗黃酮的方法，采用陰離子交換樹樹脂對黃酮進行純化，但沒有說明所制備的粗黃酮的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有工藝中存在的缺陷，提供一種操作更為安全簡便、低成本，同時制備高含量亞氨基糖及黃酮提取物的方法。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種從蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，該方法包括以下步驟:
[0007](1)用酸性水或酸性稀乙醇溶劑提取蠶沙，提取液過濾，濃縮；溶劑用量為蠶沙藥材量的5-10倍；
[0008](2)取陽離子樹脂，將步驟(1)中得到的提取濃縮液上樣，用酸性水和水洗脫，收集酸性水洗脫液和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。再用稀氨水溶液洗脫，收集稀氨水洗脫液；
[0009](3)取聚酰胺，將步驟(2)得到的酸性水和水洗脫合并濃縮液通過聚酰胺柱層析純化，上樣，分別用水、乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物；
[0010](4)取氧化鋁，將步驟(2)所得的稀氨水洗脫液，濃縮至pH中性，通過氧化鋁層析柱純化，上樣，并用乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物。
[0011]其中，步驟(1)中提取方法為:每1千克蠶沙加入5-10L水或10-30%的乙醇，加鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pHl-4，80-100°C加熱提取2-4個小時，合并提取液，提取液過濾，濃縮。最佳提取方法為:每千克蠶沙加入8L的水溶液加鹽酸調(diào)節(jié)pH至1，80°C加熱提取2個小時，提取2次，過濾，合并提取液，濃縮。[0012]步驟⑵取陽離子交換樹脂，樹脂與蠶沙的重量比為1:1-1: 2，將步驟⑴中得到的提取濃縮液上樣，先采用pH范圍為1-3鹽酸或硫酸水溶液洗脫，至洗脫液色淺，再以水洗脫至pH中性，合并酸性水洗脫液和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。以0.1-0.3mol.L 1氨水洗脫液洗脫，棄去洗脫液，再以0.4-1.0mol.L 1氨水洗脫，收集0.4-1.0mol.L-1氨水洗脫液。
[0013]最佳條件為:取與蠶沙的重量比為1: 1的001X7樹脂，將步驟(1)中得到的提取液上樣，先采用PH2鹽酸水溶液洗脫，至洗脫液色淺，再以水洗脫至pH中性，合并酸性水洗脫液和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。以0.3mol.L—1氨水洗脫液洗脫，棄去洗脫液，再以0.4mol.I71氨水洗脫,收集0.4mol.I71氨水洗脫液。
[0014]步驟(3)取與步驟⑴中蠶沙的重量比為1:1-1:2的聚酰胺，將步驟(2)得到的酸性水和水洗脫合并濃縮液上樣，分別用水、10 % -90 %乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物。
[0015]最佳條件為:取與步驟⑴中蠶沙的重量比為1: 1的聚酰胺，將步驟(2)得到的酸性水和水洗脫合并濃縮液上樣，分別用水、30%乙醇和70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物。
[0016]步驟⑷取與步驟(1)中蠶沙的重量比為1: 0.5-1: 2的氧化鋁，將步驟(2)所得的氨水洗脫液濃縮至pH中性，上樣，并用10% -90%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥得亞氨基糖提取物。
[0017]最佳條件為:取與步驟⑴中蠶沙的重量比為1: 1的堿性氧化鋁或中性氧化鋁，將步驟(2)所得的0.4mol.L-1氨水洗脫液濃縮至pH中性，上樣，并用50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物。
[0018]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0019](1)蠶沙中亞氨基糖類成分極性較大且由于含亞氨基顯堿性，所以本發(fā)明使用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pH至酸性的水或低極性乙醇作為提取溶劑，可以提高亞氨基糖類成分的提取率。由于蠶沙提取液中除亞氨基糖類成分外還含有可溶性糖、黃酮類和氨基酸類等大極性成分，本發(fā)明采用陽離子交換樹脂對亞氨基糖類成分進行初步純化。文獻有采用陽離子交換樹脂純化蠶沙中亞氨基糖類成分的報道，但洗脫方法一般是采用上樣后直接以水洗脫再以氨水洗脫。本發(fā)明采用PH1-4的鹽酸水或者硫酸水溶液對非亞氨基糖類成分進行洗脫，可以去除可溶性糖和黃酮類等大極性雜質(zhì)。除此之外由于蠶沙提取液中的酸性氨基酸類成分與陽離子交換樹脂的結(jié)合能力較堿性的亞氨基糖類弱，酸性水溶液與水相比對這類氨基酸成分洗脫能力更強，所以可以更好的去除這些成分。本發(fā)明還在氨水洗脫過程中采用氨水濃度由稀到濃梯度洗脫，先采用0.1-0.3mol.L-1氨水洗脫，去除部分包括堿性氨基酸類在內(nèi)的堿性雜質(zhì)，再用0.4-0.5mol.L-1氨水洗脫，亞氨基糖類成分可以被洗脫下來。本發(fā)明在使用陽離子交換樹脂對亞氨基糖類成分初步純化基礎(chǔ)上，再使用氧化鋁對亞氨基糖類成分進行精制，因為亞氨基糖類成分顯堿性，所以氧化鋁對這類成分結(jié)合能力較弱，采用乙醇洗脫可以使亞氨基糖類成分被洗脫下來，而其余包括氨基酸類在內(nèi)的酸性雜質(zhì)，由于和氧化鋁結(jié)合能力較強，不能被洗脫。通過氧化鋁吸附使亞氨基糖類成分得到進一步精制，最終得到的亞氨基糖類提取物中1-脫氧野尻霉素含量可達到24%，而亞氨基糖類成分總含量可以達到50%以上。且操作相對簡便，使用的有機溶劑相對價格低廉，且對環(huán)境污染較小，適合大生產(chǎn)操作。
[0020](2)在陽離子交換樹脂對亞氨基糖類成分純化過程中酸性水和水洗脫可以將蠶沙提取液中的黃酮類成分洗脫下來，本發(fā)明采用聚酰胺對其進行精制，聚酰胺中的酰胺羰基可以與提取液中的黃酮類成分特異性結(jié)合而被吸附，通過水洗和30%乙醇洗脫可以去除大量非黃酮類大極性雜質(zhì)，黃酮類成分被70%乙醇洗脫下來，得到的總黃酮含量達到50%以上。本發(fā)明通過陽離子交換樹脂和聚酰胺柱層析相結(jié)合的方法，得到的黃酮提取物含量較高，操作簡便，適合大生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。[0022]各實施例中使用的儀器設(shè)備以及檢查方法如下:
[0023]儀器設(shè)備:Mettler EL204電子天平；Dionex-Ultimate3000高效液相色譜儀，Alltech3300ELSD檢測器；TU-1810型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；
[0024]1-脫氧野尻霉素高效液相色譜法含量測定:
[0025]色譜條件色譜柱為Inerstil NH2 (4.6mmX 250mm, 5 μ m);流動相為乙腈-水(80: 20);流速 1.0mL.mirT1 ;柱溫 35。。；
[0026]ELSD檢測器參數(shù)漂移管溫度:50°C ;載氣流速:1.5L.mirT1。
[0027]總黃酮含量的測定:
[0028]標準品溶液的配制和標準曲線的建立
[0029]精密稱取蘆丁對照品，用70%乙醇溶解配制成濃度為0.2mg.L-1的蘆丁對照品溶液。精密吸取蘆丁對照品溶液0.0,0.5，1.0,2.0,3.0,4.0mL,分別加入0.3mL5% NaN02溶液，搖勻，6min后加入0.3mll0% A1 (N03)3溶液，搖勻，靜置6min，各加入4.0ml4% NaOH溶液，并用70%乙醇將反應溶液體積補足到10ml，放置10-15min，于510nm處測定吸光值。以吸光值(X)和蘆丁含量(y)繪制總黃酮含量標準曲線:y=0.8647x,r2=0.9991 (n=3)，線性范圍為 0-0.8mg。
[0030]樣品中總黃酮含量的測定
[0031]精密移取待測樣品液于10mL的容量瓶中，別加入0.3mL5% NaN02溶液，搖勻，6min后加入0.3mL10 % A1 (N03) 3溶液，搖勻，靜置6min，各加入4.0mL4% NaOH溶液，并用70 %乙醇將反應溶液體積補足到10mL，放置10-15min，于510nm處測定吸光值。代入標準曲線，計
算總黃酮含量。
[0032]總亞氨基糖含量測定方法:
[0033]精密移取待測樣品溶液至具塞試管中，加入3.0mL2%雷氏銨鹽溶液，混勻，冰水浴反應1.5h，反應液以lOOOOr.mirT1離心lOmin，沉淀以冰水洗滌至無色。加入丙酮溶解轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，以丙酮定容至刻度，于523nm處測定吸光度。
[0034]含量計算公式:W=AXMXV/ ε，其中Α為吸光度；ε為硫氰酸鉻銨在丙酮中的摩爾吸收系數(shù)，其值為106.5…是被測物質(zhì)的分子量，以1-脫氧野尻霉素的分子量計即163 ；V是丙酮的體積，單位為mL ；ff是被測物總亞氨基糖的質(zhì)量，單位為mg。
[0035]產(chǎn)品實施例1
[0036]取蠶沙1.0kg，加入5L30%乙醇，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，90°C提取2個小時，提取液濾過，濃縮。[0037]取1.0kg的001X14.5陽離子交換樹脂，將蠶沙提取濃縮液上樣，先采用pH4鹽酸水溶液洗脫，至洗脫液色淺，再以水洗脫至pH中性，合并酸性水洗脫液和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。以0.lmol.L—1氨水洗脫液洗脫，棄去洗脫液，再以
1.0mol.L—1氨水洗脫，收集1.0mol.L—1氨水洗脫液。
[0038]取2.0kg聚酰胺，將陽離子樹脂酸性水和水洗脫合并濃縮液上樣，分別用水、10%乙醇和90%乙醇洗脫，收集90%乙醇洗脫液，90%乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物
14.lg。經(jīng)含量測定，測得提取物總黃酮含量為48.4%
[0039]取1.0kg酸性氧化鋁，將1.0mol.L-1氨水洗脫液濃縮至pH中性，上樣，并用90%乙醇洗脫，收集90%乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物1.6g。經(jīng)含量測定，提取物1-脫氧野尻霉素含量為13.8%，總亞氨基糖含量以1-脫氧野尻霉素計為43.1%。
[0040]產(chǎn)品實施例2:
[0041]取蠶沙1.0kg，加入10L10%乙醇，加硫酸調(diào)節(jié)pH至1，80°C提取4個小時，提取液過濾，濃縮。
[0042]取2.0kg的D001陽離子交換樹脂，將蠶沙提取濃縮液上樣，先采用pHl硫酸水溶液洗脫，至洗脫液色淺，再以水洗脫至pH中性，合并酸性水洗脫液和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。以0.3mol.Ι^氨水洗脫液洗脫，棄去洗脫液，再以0.5mol -L-1氨水洗脫，收集0.5mol.L—1氨水洗脫液。
[0043]取2.0kg聚酰胺，將陽離子樹脂酸性水和水洗脫合并濃縮液上樣，分別用水、30%乙醇和70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物9.lg。經(jīng)含量測定，測得提取物總黃酮含量為56.7%
[0044]取1.0kg酸性氧化鋁，將0.5mol.L-1氨水洗脫液濃縮至pH中性，上樣，并用10%乙醇洗脫，收集10%乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物2.9g。經(jīng)含量測定，提取物1-脫氧野尻霉素含量為17.8%，總亞氨基糖含量以1-脫氧野尻霉素計為48.9%。
[0045]產(chǎn)品實施例3:
[0046]取蠶沙1.0kg,加入10L水，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，100°C提取2個小時，提取液過濾，再加8L水，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，100°C提取2個小時，提取液過濾，合并兩次提取液，濃縮。
[0047]取1.0kg的D001陽離子交換樹脂，將蠶沙提取濃縮液上樣，先采用pH2鹽酸水溶液洗脫，至洗脫液色淺，再以水洗脫至pH中性，合并酸性水洗脫液和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。以0.2mol.Ι^氨水洗脫液洗脫，棄去洗脫液，再以0.4mol -L-1氨水洗脫，收集0.4mol.I71氨水洗脫液。
[0048]取1.0kg聚酰胺，將陽離子樹脂酸性水和水洗脫合并濃縮液上樣，分別用水、30%乙醇和70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物9.8g。經(jīng)含量測定，測得提取物總黃酮含量為57.1%
[0049]取0.5kg中性氧化鋁，將0.4mol.L-1氨水洗脫液濃縮至pH中性，上樣，并用50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物2.0g。經(jīng)含量測定，提取物1-脫氧野尻霉素含量為22.4%，總亞氨基糖含量以1-脫氧野尻霉素計為53.8%。
[0050]產(chǎn)品實施例4:
[0051]取蠶沙1.0kg,加入8L水，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至1，80°C提取2個小時，提取液過濾，再加8L水，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至1，80°C提取2個小時，提取液過濾，合并兩次提取液，濃縮。
[0052]取1.0kg的001X7陽離子交換樹脂，將蠶沙提取濃縮液上樣，先采用pH2鹽酸水溶液洗脫，至洗脫液色淺，再以水洗脫至pH中性，合并酸性水洗脫液和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。以0.3mol.Ι^氨水洗脫液洗脫，棄去洗脫液，再以
0.4mol.L-1氨水洗脫，收集0.4mol.L-1氨水洗脫液。
[0053]取1.0kg聚酰胺，將陽離子樹脂酸性水和水洗脫合并濃縮液上樣，分別用水、30%乙醇和70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物
9.6g。經(jīng)含量測定，測得提取物總黃酮含量為58.7%
[0054]取1.0kg堿性氧化鋁，將0.4mol.L-1氨水洗脫液濃縮至pH中性，上樣，并用50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物1.9g。經(jīng)含量測定，提取物1-脫氧野尻霉素含量為24.1%，總亞氨基糖含量以1-脫氧野尻霉素計為54.1 %。
【權(quán)利要求】
1.一種從蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟:(1)用酸性水或酸性稀乙醇溶劑提取蠶沙，提取液過濾，濃縮；溶劑用量為蠶沙藥材量的5-10倍；(2)取陽離子交換樹脂，將步驟(1)中得到的濃縮液上樣，用酸性水和水洗脫，收集酸性水和水洗脫液，洗脫液合并，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。再用稀氨水溶液洗脫，收集稀氨水洗脫液；(3)將步驟(2)得到的酸性水和水洗脫濃縮液，通過聚酰胺層析柱純化，上樣，分別用水、乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，乙醇洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物；(4)將步驟(2)所得的稀氨水洗脫液，濃縮至pH中性，通過氧化鋁層析柱純化，上樣，并用乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟⑴所述酸性水或稀乙醇pH范圍為1-4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(1)中稀乙醇包括10-50%乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(2)所述的陽離子交換樹脂為強酸型陽離子交換樹脂，陽離子交換樹脂脂型號可以為 D00U001X7,001X14.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟⑵所述酸性水溶液pH范圍為1-6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟⑵中稀氨水濃度為0.lmol.L_1-l.0mol.L'
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(3)中乙醇濃度為10-90%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(4)中氧化鋁可以為堿性氧化鋁、中性氧化鋁或酸性氧化鋁。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(4)中乙醇濃度為10-90%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(1)中提取方法為每千克蠶沙加入5-10L pHl-4的鹽酸或硫酸水溶液或PH1-4的10-30%的鹽酸或硫酸乙醇溶液，80-100°C加熱提取2_4個小時，合并提取液，提取液過濾，濃縮。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(2)中陽離子交換樹脂與步驟(1)中蠶沙的重量比為1:1-1: 2，將步驟(1)中得到的提取濃縮液上樣，先采用pH范圍為1-3鹽酸或硫酸水溶液洗脫，至洗脫液色淺，再以水洗脫至pH中性，合并酸性水和水洗脫液，濃縮，得到酸性水和水洗脫合并濃縮液。以0.1-0.3mol.L -1氨水洗脫液洗脫，棄去洗脫液，再以0.4-0.5mol.L 1氨水洗脫，收集0.4-0.5mol.L-1氨水洗 脫液。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟(3)中取與步驟(1)中蠶沙的重量比為1:1-1:2的聚酰胺，將步驟(2)得到的酸性水和水洗脫合并濃縮液通過聚酰胺層析柱純化，上樣，分別用水、30%乙醇和70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得黃酮提取物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一所述的蠶沙中同時制備亞氨基糖及黃酮提取物的方法，其特征在于:步驟⑷取與步驟⑴中蠶沙的重量比為1: 0.5-1: 2的堿性氧化鋁或中性氧化鋁，將步驟(2)所得的氨水洗脫液濃縮至pH中性，通過堿性氧化鋁或中性氧化鋁層析柱純化，上樣，并用50 %乙醇洗脫，收集50 %乙醇洗脫液，洗脫液濃縮干燥，得亞氨基糖提取 物。
【文檔編號】A61K35/64GK103641771SQ201310713282
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】呂寒, 李維林, 陳劍, 馬麗, 任冰如, 劉艷, 梁呈元 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所