專利名稱：白首烏總苯乙酮或苯乙酮化合物在制備治療肝臟疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類具有治療肝臟疾病作用的化合物的應(yīng)用，尤其是從中藥白首烏中提取分離得到的9種苯乙酮以及9種苯乙酮之一及其任意組合的總含量≥50％的混合物(白首烏總苯乙酮)，在制備預(yù)防和治療肝炎、急性肝損傷、慢性肝損傷和肝纖維化等肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
我國被稱為肝病大國，近年來病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝病、肝損傷、肝癌等肝病已經(jīng)成為當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病之一，其中病毒性肝炎的發(fā)病率居各種傳染性疾病之首，且發(fā)病率逐年增長。
我國每年大約有200萬急性肝炎患者，其中甲型肝炎占半數(shù)(50％)，乙型肝炎占20-25％，丙型肝炎占5-10％，戊型肝炎約占10％。在我國，甲型肝炎病毒的抗體總流行率為81％，乙型肝炎病毒的總流行率為59.17％、感染率為57.6％、攜帶率為9.8％，被定為高流行區(qū)。據(jù)統(tǒng)計，我國目前大約有現(xiàn)癥的慢性乙型肝炎約3000萬人，每年用于治療各型肝炎的藥物費用和手術(shù)等費用超過1000億元人民幣?？梢哉f，肝炎已成為對我國人民健康危害最嚴(yán)重的疾病之一。目前，肝炎的治療藥物很多，例如干擾素、阿昔洛韋、拉米夫定等，以及上百種降酶藥。然而其中療效顯著、治愈率高的卻很少。
我國傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療肝病方面有著悠久的歷史，不僅形成了一整套完整的臨床治療理論體系、豐富的臨床治療經(jīng)驗，而且篩選出很多較常應(yīng)用的治療藥物，這些中藥的療效經(jīng)過上千年的臨床驗證，作用明確，療效可靠。
白首烏是我國傳統(tǒng)滋補名藥，中醫(yī)理論中白首烏具有養(yǎng)肝益血、固腎益精、強筋健骨的功效。白首烏的藥材基源是蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatumRoyle ex Wight.)、戟葉牛皮消(Cynanchum bungei Decne.)、隔山消(Cynanchum wilfordii(Maxim.)Hemsl.)的干燥塊根。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從白首烏中提取分離高效低毒、具有治療肝臟疾病作用的白首烏總苯乙酮和苯乙酮，并用于制備治療肝臟疾病的藥物。
本發(fā)明從白首烏中提取分離得到的具有肝病作用的9種苯乙酮化合物為cynandioneA(白首烏酮A)，cynandione B(白首烏酮B)，cynandione C(白首烏酮C)，cynandioneD(白首烏酮D)，cynanchone A(白首烏新酮A)，cynantetrone(白首烏四酮)，2，4-dihydroxyacetophenone(2，4-二羥基苯乙酮)，2，5-dihydroxyacetophenone(2，5-二羥基苯乙酮)，4-hydroxyacetophenone(4-羥基苯乙酮)，本發(fā)明所述的白首烏總苯乙酮是包含上述9種苯乙酮之一種或任意幾種組合且苯乙酮化合物總重量含量≥50％的混合物。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有抗肝炎病毒、抗肝損傷、改善肝功能等多方面的作用特點，降酶活性高，停止服藥后療效較鞏固，反跳率低，毒性極低無明顯不良反應(yīng)，無致畸致突變效應(yīng)，是天然資源中提取分離作為治療肝臟疾病的新藥。
這些苯乙酮，以及包含有這些苯乙酮的混合物白首烏總苯乙酮，對乙型肝炎病毒的表達有抑制作用，使四氯化碳所致大鼠慢性肝中毒后肝臟指數(shù)較明顯變?。粚λ穆然妓麓笫舐愿沃卸竞蟾喂δ芎透卫w維化具有顯著改善作用；使硫代乙酰胺所致大鼠慢性肝中毒后肝臟指數(shù)較明顯變小；對硫代乙酰胺所致大鼠急性肝中毒后肝功能和肝纖維化具有顯著改善作用；能夠顯著增加大鼠膽汁分泌的速度和總量，具有利膽作用。
本發(fā)明提供的苯乙酮以及包含有苯乙酮的混合物白首烏總苯乙酮，它們是從白首烏經(jīng)乙醇等作為提取溶劑，濃縮得到的浸膏經(jīng)大孔樹脂柱層析分離，收集乙醇洗脫液，濃縮得到白首烏總苯乙酮，經(jīng)硅膠柱層析，用薄層層析檢測層析流分，具有相同單一斑點的流分合并，濃縮，再經(jīng)RP-18低壓柱或HPLC(高效液相色譜)分離和純化，分得cynandione A，cynandione B，cynandione C，cynandione D，cynanchone A，cynantetrone，2，4-dihydroxyacetophenone，2，5-dihydroxyacetophenone，4-hydroxyacetophenone。
通過酸水解以及紫外光譜儀、紅外光譜儀、高分辨快速原子轟擊質(zhì)譜儀、核磁共振氫譜儀、核磁共振碳譜儀、異核多量子相關(guān)譜儀、異核多鍵相關(guān)譜儀等光譜分析技術(shù)，9種苯乙酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明，分別如

圖1所示。
圖19種苯乙酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)

本發(fā)明中對白首烏總苯乙酮和9個苯乙酮化合物進行了抗肝炎活性和肝保護的評價實驗。
(一)白首烏總苯乙酮在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對乙型肝炎病毒的抑制作用 1實驗方法采用體外2.2.15細(xì)胞HBsAg表達模型，將苯乙酮作用于HepG2.2.15細(xì)胞，分別在第72h和144h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法測定上清液HBsAg和HBeAg的滴度。觀察白首烏總苯乙酮對乙型肝炎病毒表達的影響 2數(shù)據(jù)處理試驗結(jié)果以X±s表示，采用組間比較t檢驗。
3試驗結(jié)果白首烏總苯乙酮在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中可有效地抑制細(xì)胞HBsAg和HBeAg的表達(P＜0.05、P＜0.01)，抑制作用有明顯的量效反應(yīng)關(guān)系。白首烏總苯乙酮對乙型肝炎病毒的表達有抑制作用。試驗部分結(jié)果見表1 表1 白首烏總苯乙酮對2.2.15細(xì)胞HBsAg表達的抑制作用(8天) *P＜0.05，**P＜0.01，和NS對照組比較。
(二)白首烏苯乙酮對四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷的保護作用 1實驗步驟動物稱重后隨機分組正常對照組；模型對照組；陰性(磷脂)對照組(磷脂400mg/kg)；陽性對照組(聯(lián)苯雙酯10mg/kg)； 苯乙酮單體給藥組(10mg/kg)，總苯乙酮組(10m/kg)。除正常對照組外，以25％四氯化碳0.2ml/100g(體重)，1次/5天，皮下注射，連續(xù)11周后；同時每天一次灌胃給藥，造模結(jié)束后再連續(xù)給藥20天，最后一次給藥后24小時眼眶采血，測定各組動物血清中AST、ALT、TP、ALB、LN、HA、PIIIP、CIV等指標(biāo)的變化；并稱肝重，計算肝臟指數(shù)。
2觀察指標(biāo) AST(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、TP(totalprotein，總蛋白)、ALB(albumin，白蛋白)、LN(laminia，層粘連蛋白)、HA(hyaluronicacid，透明質(zhì)酸)、PIIIP(III型前膠原末端肽)、CIV(IV型膠原)等定量指標(biāo)停藥后采血測定，各測兩次，取平均值。采血后處死動物，稱肝重，計算肝臟指數(shù)(肝重/體重*100％)。
3統(tǒng)計處理試驗結(jié)果以X±s表示，采用組間比較t檢驗。
4結(jié)果 4.1肝臟指數(shù)大鼠腹腔注射四氯化碳后，肝臟出現(xiàn)水腫等病理學(xué)改變，肝指數(shù)變大。實驗結(jié)果顯示經(jīng)苯乙酮治療，大鼠肝臟指數(shù)較模型對照組明顯變小。結(jié)果見表2 表2苯乙酮對四氯化碳所致大鼠慢性肝中毒后肝臟指數(shù)的影響(n＝20) 與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
4.2肝功能苯乙酮對四氯化碳所致大鼠慢性肝中毒后AST、ALT、TP和ALB等有顯著的改善作用。結(jié)果見表3 表3苯乙酮對四氯化碳所致大鼠慢性肝中毒后肝功能的影響(n＝20) 與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
4.3肝纖維化苯乙酮對四氯化碳所致大鼠慢性肝中毒后肝纖維化指標(biāo)LN、HA、PIIIP和CIV均有顯著改善作用。結(jié)果見表4 表4苯乙酮對四氯化碳所致大鼠慢性肝中毒后肝纖維化的影響(n＝20) 與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
(三)白首烏苯乙酮對硫代乙酰胺所致大鼠急性肝損傷的保護作用 1實驗步驟 動物稱重后隨機分組正常對照組；模型對照組；陰性(磷脂)對照組(磷脂400mg/kg)；陽性對照組(聯(lián)苯雙酯10mg/kg)；苯乙酮單體給藥組(10mg/kg)，總苯乙酮組(10m/kg)。各組按上述劑量每天灌胃給藥一次，共28天。第29天除正常對照組外，其余各組均腹腔注射硫代乙酰胺(TAA)20mg/kg，注射后3h、6h、9h，再連續(xù)給藥3次，最后一次給藥后24小時，即第2天眼眶取血，測定生化指標(biāo)。
2觀察指標(biāo) AST(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、TP(total protein，總蛋白)、ALB(albumin，白蛋白)、LN(laminia，層粘連蛋白)、HA(hyaluronic acid，透明質(zhì)酸)、PIIIP(III型前膠原末端肽)、CIV(IV型膠原)等定量指標(biāo)停藥后采血測定，各測兩次，取平均值。采血后處死動物，稱肝重，計算肝臟指數(shù)(肝重/體重*100％)。
3統(tǒng)計處理試驗結(jié)果以X±s表示，采用組間比較t檢驗。
4結(jié)果 4.1肝臟指數(shù)經(jīng)苯乙酮治療，大鼠肝臟指數(shù)較模型對照組明顯變小。結(jié)果見表5 表5苯乙酮對硫代乙酰胺致大鼠急性肝中毒后肝臟指數(shù)的影響(n＝10) 與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
4.2肝功能苯乙酮對硫代乙酰胺所致大鼠急性肝中毒后AST、ALT等有顯著的改善作用，小劑量的苯乙酮即有顯著改善作用；對TP和ALB未見有任何影響。結(jié)果見表6 表6苯乙酮對硫代乙酰胺致大鼠急性肝中毒后肝功能的影響(n＝10) 與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
4.3肝纖維化苯乙酮對硫代乙酰胺所致大鼠急性肝中毒后肝纖維化指標(biāo)LN、HA、PIIIP和CIV均有顯著改善作用。結(jié)果見表7 表7苯乙酮對硫代乙酰胺致大鼠急性肝中毒后肝纖維化的影響(n＝10) 與模型對照組比較*P＜0.05， **P＜0.01。
(四)白首烏總苯乙酮對大鼠膽汁分泌的影響試驗。
1實驗方法采用麻醉大鼠行膽汁引流術(shù)，測定白首烏總苯乙酮對大鼠膽汁分泌速度及分泌總量的影響。
2數(shù)據(jù)處理試驗結(jié)果以X±s表示，采用組間比較t檢驗。
3試驗結(jié)果 白首烏總苯乙酮口服可顯著增加大鼠膽汁分泌的速度和總量，說明白首烏總苯乙酮有利膽的作用。結(jié)果見表8 表8 120min的膽汁總量及給藥后1小時膽汁流量增加百分率 *P＜0.05，**P＜0.01，和NS對照組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，和自身給藥前比較。
本發(fā)明提出的上述化合物可用于制備治療肝臟疾病藥物，尤其可用于制備治療肝炎、急性肝損傷、慢性肝損傷、肝纖維化的藥物。而且，根據(jù)治療的有效量，與藥學(xué)上可接受的載體組成藥物組合物，制成各種制劑，包括片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、合劑、溶液劑、糖漿劑、酊劑或注射劑等。

具體實施例方式 實施例1 制備白首烏總苯乙酮 白首烏干燥塊根5kg粉碎后，以75％乙醇回流2次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物加水分散后，先以石油醚萃取3次，棄去；再以氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓回收氯仿至干，即白首烏總苯乙酮。
本品為淡棕色粉術(shù)。
實施例2 取白首烏酮A和白首烏酮D各10g，用適量注射用水溶解，加甘露醇20g，按照常規(guī)凍干工藝凍干，即得注射用凍干粉。用于治療肝臟疾病。
實施例3 將20g聚乙二醇(6000)、5.8g泊洛沙姆(188)置燒杯中，90℃水浴上加熱使熔融，攪拌均勻，加入10g，攪拌均勻，加入10ml藥用無水乙醇，充分?jǐn)嚢?，使白首烏總苯乙酮溶解，繼續(xù)攪拌，使乙醇揮發(fā)，保溫待用；將滴丸機預(yù)熱，貯液室溫度恒溫為94℃±2℃，冷卻劑預(yù)冷至10~12℃，調(diào)節(jié)滴嘴與冷卻液面的距離，將藥液倒入貯液室，啟動閥門，將藥液逐滴滴入冷卻劑中，滴速約為24滴/分；于收集口收集滴丸，用紗布吸除表面冷卻劑，冰箱冷凍室(-18℃)冷凍處理24小時，置真空干燥箱中，常溫真空干燥，即得白首烏總苯乙酮滴丸。
實施例4 取白首烏酮B、C、白首烏四酮、4-羥基苯乙酮各10g，輔料微晶纖維素40g、乳糖90g，按等量遞加法將主藥與各種輔料混合，過40目篩，混合均勻?；旌暇鶆蚝蟮奈锪贤度脒m當(dāng)?shù)娜萜髦?，加?5％酒精配制的適量濃度的聚維酮K30，制成軟材，再20目篩擠壓制濕顆粒。將濕顆粒平攤，放于60℃烘箱烘干，18目篩整粒，加入0.2％硬脂酸鎂混合均勻，填充膠囊，包裝，得白首烏苯乙酮膠囊。
權(quán)利要求
1.一種白首烏總苯乙酮或苯乙酮化合物在制備治療肝臟疾病藥物中的應(yīng)用，所述苯乙酮化合物分別為白首烏酮A，白首烏酮B，白首烏酮C，白首烏酮D，白首烏新酮A，白首烏四酮，2，4-二羥基苯乙酮，2，5-二羥基苯乙酮，4-羥基苯乙酮，所述總苯乙酮為包含這上述苯乙酮中任意幾種而且苯乙酮化合物的重量含量≥50％的混合物；這9種苯乙酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
2.一種如權(quán)利要求1所述的白首烏總苯乙酮或苯乙酮化合物與藥學(xué)上可接受的載體組成的用于治療肝臟疾病的藥物組合物，其劑型包括片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、合劑、溶液劑、糖漿劑、酊劑或注射劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的肝臟疾病為肝炎、急性肝損傷、慢性肝損傷或肝纖維化。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種白首烏總苯乙酮或苯乙酮類化合物在制備治療肝臟疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的苯乙酮化合物共有9種白首烏酮A，白首烏酮B，白首烏酮C，白首烏酮D，白首烏新酮A，白首烏四酮，2，4-二羥基苯乙酮，2，5-二羥基苯乙酮和4-羥基苯乙酮；白首烏總苯乙酮為包括上述9種苯乙酮中任意幾種且苯乙酮總重量含量≥50％的混合物。實驗表明，上述化合物具有抗肝炎病毒、抗肝傷，改善肝功能等多方面作用，毒性極低，無明顯不良反應(yīng)，無致畸致突變效應(yīng)，可用作治療肝臟疾病的藥物。
文檔編號A61K31/12GK101181248SQ20071017261
公開日2008年5月21日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者磊 單, 張衛(wèi)東, 川 張, 娟 蘇, 沈云亨, 柳潤輝, 李慧梁, 徐希科, 邢愛婷 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)