專利名稱：一種肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于聚乙烯亞胺的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，并提供制備該納米尺度自組裝大分子前藥的方法，屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝癌是最常見的惡性腫瘤之一。早期肝癌由于缺乏特征性征象，多表現(xiàn)為肝區(qū)隱痛、食欲差、腹脹、乏力等，與多數(shù)消化道疾病癥狀相似，目前的檢測(cè)方法難以早期準(zhǔn)確診斷，臨床發(fā)現(xiàn)的肝癌多屬中晚期肝癌，肝臟已經(jīng)受到嚴(yán)重?fù)p害，故使臨床治療方案的選擇和療效受到很大的制約。目前，手術(shù)切除是治療肝癌的首選，但術(shù)后容易復(fù)發(fā)，其主要原因是癌灶殘留。若術(shù)后輔助化療，可明顯降低復(fù)發(fā)率，提高存活率,但是，化療藥物大都存在明顯的療效-劑量依賴關(guān)系，即增大藥物的用量可明顯的提高療效。但藥物劑量的增加必加重全身的毒副作用。為了提高肝癌治療效果，除了需從"早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療"著手外，新的肝癌治療藥物的發(fā)現(xiàn)或現(xiàn)有肝癌治療藥物療效、選擇性和生物利用度的提高成為改善肝癌臨床治療效果的關(guān)鍵。
生物醫(yī)藥與納米技術(shù)的融合集成而誕生的納米生物醫(yī)藥技術(shù)，在肝癌等人類重大疾病的臨床診療方面顯示了誘人潛力。其中，耙向性的納米藥物載體技術(shù)由于特異性強(qiáng)，效果顯著，避免損傷正常組織，為人類提高現(xiàn)有肝癌治療藥物的臨床療效和生物利用度，降低其毒副作用提供了理想的解決方案。如日本Matsumure研究小組以聚乙二醇和天冬氨酸的兩嵌段共聚物膠束載帶阿霉素(代號(hào)NK911 )和紫衫醇(代號(hào)NK105)治療實(shí)體瘤已分別進(jìn)入臨床II期和臨床I期研究(Y. Matsumure, Proceedings of the 2004 international Conference on MEMS, NANO andSmart Systems (ICMENS，04))，顯示出較好的臨床應(yīng)用前景。Kataoka研究小組以聚乙二醇單甲醚與天冬氨酸的兩嵌段共聚物為載體載帶阿霉素而獲得粒徑分布均
勻的核~~^殼結(jié)構(gòu)納米膠束，研究發(fā)現(xiàn)納米膠束藥物能富集于實(shí)體瘤中，在血液中的穩(wěn)定性良好(Y. Bae, S. Harada， K. kataoka, Angew Chem. Int. Ed. 42(2003) 4640.)。以聚乙二醇和天冬氨酸的共聚物膠束為抗癌藥物載體雖然取得了不少成功(Yip YL etal. Application of phage display technology to cancer research. Curr Pharm Biotechnol. 2002，3 (1): 29-43.)，但也存在幾方面的不足。首先，藥物與藥物載體間以降解非常緩慢的酰胺鍵連接，藥物釋放緩慢，指定時(shí)間內(nèi)藥物難以達(dá)到治療劑量；其次，親水的聚合物殼層(PEG)降低了細(xì)胞對(duì)納米微粒的吞噬作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種毒副作用小、臨床療效和生物利用度高、對(duì)肝
3癌細(xì)胞具有耙向性的肝耙向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)的制備方法。
為了克服已有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明利用聚乙烯亞胺(PEI)的"質(zhì)子海綿"效應(yīng)，肝癌耙向因子的耙向性，阿霉素良好的治療效果，提供一種基于聚乙烯亞胺的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)。聚乙烯亞胺由于分子中含有多級(jí)胺
(如1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)胺)，有"質(zhì)子海綿"的功能，當(dāng)其進(jìn)入溶酶體后在質(zhì)子泵作用下吸收質(zhì)子(H+)的同時(shí)帶入反離子，使溶酶體中離子濃度加大，滲透壓加大，水份進(jìn)入，從而使溶酶體膜破裂，使藥物逃逸溶酶體。
本發(fā)明提供的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)由三個(gè)功能部分組成(1)遠(yuǎn)端連肝癌靶向因子的聚乙二醇親水鏈段為膠束的殼層；(2)化療藥物(如阿霉素)共價(jià)連接在促使溶酶體膜破裂的水溶性高分子鏈段上組成疏水部分作為膠束的核層；(3)化療藥物與載體間的溶酶體可降解(酸可降解)的連接鍵，其結(jié)構(gòu)通式為-
[T-PEG〗n—PEI—(ADR)m
其中T為肝靶向基團(tuán)；PEG為聚乙二醇；PEI為聚乙烯亞胺；ADR為阿霉
素作為治療藥物。n， m為1-350的整數(shù)。
本發(fā)明提供的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)中肝靶向基團(tuán)可為D-半乳糖，乳糖或靶向肽，以實(shí)現(xiàn)其主動(dòng)靶向。PEG分子量可為35000Da， 25000Da，10000Da， 3500Da， 1800Da。優(yōu)選為3500-25000Da，更好實(shí)現(xiàn)其在血液中的長(zhǎng)效循環(huán)。本發(fā)明采用的是分子量分別為60000Da， 10000Da， 1800Da， 1200Da，600Da， 423Da的支化或直鏈PEI。
本發(fā)明提供的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)中載體與阿霉素之間通過共價(jià)鍵連接；這里的共價(jià)鍵優(yōu)選通過溶酶體可降解的共價(jià)鍵連接，使其只在溶酶體中降解釋藥以降低毒性。具體可為肼鍵、腙鍵、縮醛鍵或原酸酯鍵。
本發(fā)明提供的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)納米顆粒粒徑為10 500nm。優(yōu)選為100 150nm,對(duì)腫瘤組織可實(shí)現(xiàn)被動(dòng)耙向的效果。
本發(fā)明提供的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)的制備方法步驟如下第一步以遠(yuǎn)端帶肝靶向基團(tuán)(T)的聚乙二醇修飾聚乙烯亞胺得到(T-PEG-PEI);其方法為 一定量的聚乙烯亞胺(PEI)與半乳糖聚乙二醇NHS酯先在冰鹽浴中反應(yīng)12小時(shí)，然后在室溫下反應(yīng)72小時(shí)，透析得產(chǎn)物。
第二步T-PEG-PEI與琥珀-4-(氮maleimidomethyl)環(huán)己烷-l-磺酸鈉SMCC反應(yīng)得T-PEG-PEI-SMCC;其方法為 一定量的T-PEG-PEI與琥珀-4-(氮maleimidomethyl)環(huán)己烷-l-磺酸鈉SMCC溶解于三蒸水中，室溫下攪拌72小時(shí)，透析得產(chǎn)物。第三步阿霉素巰基衍生物(ADR-SH)的制備；其方法為先將3-(2-吡啶
二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)肼解，肼解產(chǎn)物與阿霉素鹽酸鹽(ADM-HC1)反應(yīng)72小時(shí)，然后透析得產(chǎn)物。
第四步ADR-SH與T-PEG-PEI-SMCC反應(yīng)得T-PEG-PEI-ADR;其方法為一定量的ADR-SH與T-PEG-PEI-SMCC在室溫下攪拌反應(yīng)72小時(shí)，然后將反應(yīng)液經(jīng)葡聚糖G-50凝膠柱處理，得產(chǎn)物
本發(fā)明提供的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)用葡聚糖凝膠G-50進(jìn)行純化。
本發(fā)明提供的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)的制備方法可表示如下:
本發(fā)明與己有技術(shù)相比較顯著效果在于其一，兩親性的大分子阿霉素前藥在水介質(zhì)中自組裝成納米尺度的膠束結(jié)構(gòu)；其二，聚乙二醇為聚合物納米膠束的殼層，保證了納米膠束微粒在血液中能夠長(zhǎng)效循環(huán)；其三，聚乙二醇遠(yuǎn)端的肝癌細(xì)胞靶向因子，一方面可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)聚合物納米膠束的吞噬作用，另一方面可將治療藥物選擇性地運(yùn)送到肝腫瘤部位，定向殺傷肝腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝部腫瘤細(xì)胞水平的主動(dòng)靶向；其四，納米膠束通過細(xì)胞吞噬作用克服細(xì)胞膜屏障后，首先進(jìn)入內(nèi)涵體、溶酶體等細(xì)胞器，由于內(nèi)涵體、溶酶體等細(xì)胞器的pH值顯酸性(5.(XpIK6.5),治療藥物與載體間的連接鍵發(fā)生酸催化降解，釋放出治療藥物和促使溶酶體膜破裂的高分子鏈段(PEI的"質(zhì)子海綿"效應(yīng))，隨著溶酶體膜的破裂，化療藥物阿霉素逃逸溶酶體，進(jìn)入發(fā)揮治療作用的場(chǎng)所——細(xì)胞核，從而能最大限度地降低阿霉素等細(xì)胞毒類藥物治療肝癌的毒副作用，提高現(xiàn)有肝癌治療藥物的臨床療效和生物利用度，降低其毒副作用。對(duì)肝癌細(xì)胞具有靶向性的智能納米膠束藥物載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)思想具有原創(chuàng)性，是一種新型的抗腫瘤大分子藥物，可望克服目前肝癌臨床治療效果不理想的瓶頸。


圖1、 PEI的結(jié)構(gòu)示意圖。從圖中我們可以看出，PEI含有大量的l'，2',3'氨基基團(tuán)，質(zhì)子海綿效應(yīng)明顯。
圖2、 PEI接上靶向基團(tuán)D-半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)后得到的Gal-PEG-PEI 'HNMR譜圖。
圖3、 Gal-PEG-PEI接上阿霉素后得到的Gal-PEG-PEI-ADR紫外譜圖。
圖4、肝靶向型智能納米膠束前藥的粒徑、粒徑分布圖(Size Distribution byIntensity)(橫軸代表粒徑，單位nm，縱軸代表強(qiáng)度，曲線代表粒徑分布)。
圖5、肝靶向型智能納米膠束的透射電鏡圖。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。
其中，聚乙烯亞胺PEI (Polyethyleneimine)購(gòu)于Aldrich公司，半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)購(gòu)買于北京鍵凱科技有限公司，葡聚糖凝膠G-50購(gòu)買于上海摩速科學(xué)器材有限公司；水為三次蒸餾水；其余試劑均為市售AR試劑。
用英國(guó)MARLVEN公司Zetasizer3000HS型激光粒度散射儀，對(duì)本發(fā)明基于聚乙烯亞胺的肝耙向型智能納米膠束前藥的粒徑及粒徑分布進(jìn)行表征，測(cè)試時(shí)的溫度為25°C，入射激光的波長(zhǎng)為633nm，其偏振方向與散射檢測(cè)光平面垂直。并使用透射電鏡(TEM)對(duì)純化后的納米粒子的形貌進(jìn)行表征。用BRUKERAVANCE 500核磁共振儀(NMR)對(duì)Gal-PEG-PEI的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。用亞研電子有限公司的紫外-可見分光光度計(jì)UV1900PC對(duì)Gal-PEG-PEI-ADR進(jìn)行了表征。
實(shí)施例1:
第 一 步分別將0.1834g(0.0054mmo1)半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)(分子量為35000Da)， 0.3773g507。的PEI水溶液(分子量為1800Da^0.1048mmo1)溶于10mlDMF中。在冰鹽浴條件下，將Gal-PEG-NHS溶液滴加到PEI溶液中，并在冰鹽浴條件下反應(yīng)12小時(shí)，然后在室溫下反應(yīng)72小時(shí)。所得產(chǎn)物用7000Da的透析袋在三蒸水中透析96小時(shí)，所得透析液冷凍干燥72小時(shí)，得到白色絮狀產(chǎn)物(Gal-PEG-PEI)，取少量該產(chǎn)物，溶于重水中，其NMR表征結(jié)果見附圖3。
第二步取Gal-PEG-PEI 0.2733g，用20ml三蒸水溶解于100ml圓底燒瓶中，并加入50倍過量的琥珀4-(氮maleimidomethyl)環(huán)己烷-1一磺酸鈉SMCC,室
6溫下攪拌反應(yīng)72小時(shí)，反應(yīng)液用7000Da的透析袋在三蒸水中透析72小時(shí)，所得透析液凍干72小時(shí)，得白色固體Gal-PEG-PEI-SMCC 。
第三步阿霉素巰基衍生物ADR-SH的合成取70mg (0.22mmo1) 3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)用3ml四氫呋喃(THF)溶解于圓底燒瓶中，在冰水浴的條件下，向此溶液加入0.3ml 1M肼的異丙醇溶液，在0"C下反應(yīng)20分鐘。將上述反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，然后用無(wú)水碳酸鉀干燥。21mg上述產(chǎn)物，48mg阿霉素鹽酸鹽(ADM-HC1)(0.083mol)用5ml甲醇溶解于圓底燒瓶中，室溫下避光攪拌反應(yīng)6天，然后將反應(yīng)液用反向薄層色譜柱進(jìn)行分離，濃縮。將濃縮后的產(chǎn)物溶解于水中，加過量的二硫蘇糖醇(DTT)，室溫下攪拌2小時(shí)，硅膠柱分離，得到產(chǎn)物ADR-SH。
第四步
取Gal-PEG-PEI-SMCC0.2554g，用20ml三蒸水溶解于100ml圓底燒瓶中，并加入過量的ADR-SH，在室溫下攪拌反應(yīng)72小時(shí)，將所得產(chǎn)物用葡聚糖凝膠G-50柱進(jìn)行，然后在冷凍干燥72小時(shí)后，得Gal-PEG-PEI-ADR。
實(shí)施例2
同實(shí)施例1法，固定PEI的分子量為1800Da，采用分子量為25000Da的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3
同實(shí)施例1法，固定PEI的分子量為1800Da，采用分子量為10000Da的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4
同實(shí)施例1法，固定PEI的分子量為1800Da，分別采用分子量為3500Da，的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5
同實(shí)施例1法，固定PEI的分子量為1800Da，分別釆用分子量為1800Da的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例6
同實(shí)施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量為3500Da,采用分子量為60000Da的聚乙烯亞胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例7
同實(shí)施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量為3500Da,采用分子量為10000Da的聚乙烯亞胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例8
同實(shí)施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量為3500Da,采用分子量為1800Da的聚乙烯亞胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例9
同實(shí)施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量為3500Da,采用分子量為1200Da的聚乙烯亞胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例10
同實(shí)施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量為3500Da,采用分子量為600Da的聚乙烯亞胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例11
同實(shí)施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量為3500Da,采用分子量為423Da的聚乙烯亞胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施例12
同實(shí)施例1法，把D-半乳糖聚乙二醇NHS酯，改換成乳糖聚乙二醇NHS酯,進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例13
同實(shí)施例1法，把D-半乳糖聚乙二醇NHS酉旨，改換成多肽聚乙二醇NHS酯,進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例14
同實(shí)施例1法，改變D-半乳糖聚乙二醇NHS酉旨、阿霉素巰基衍生物(ADR-SH)的用量比，進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)
用核磁共振對(duì)實(shí)施例l產(chǎn)物進(jìn)行表征，結(jié)果見附圖3，譜圖中出現(xiàn)了聚乙烯亞胺、聚乙二醇的化學(xué)位移峰，說明半乳糖的聚乙二醇衍生物已經(jīng)接到支化的聚乙烯亞胺上；用上述紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行產(chǎn)物進(jìn)行表征，結(jié)果見附圖4，產(chǎn)物在495nm處有吸收峰，此處正是阿霉素的特征吸收峰，說明阿霉素接到聚乙烯亞胺上;用激光粒度儀PCS測(cè)量產(chǎn)物的粒徑，結(jié)果見圖5，其粒徑為小于100nm，粒徑分布均勻。由于其他實(shí)施例的表征與實(shí)施例1的表征相似，故不再羅列。
通過上述實(shí)施例，發(fā)現(xiàn)采用3500Da的聚乙二醇NHS酯制得的智能肝靶向納米聚乙烯亞胺藥物載體系統(tǒng)粒徑小，粒徑分布均勻，適合作為肝靶向載藥系統(tǒng)。通過上述實(shí)施例，發(fā)現(xiàn)采用分子量1800Da的支化聚乙烯亞胺制得的智能肝耙向納米聚乙烯亞胺藥物載體系統(tǒng)粒徑小，粒徑分布均勻，適合作為肝耙向載藥系統(tǒng)。
通過實(shí)施例14，發(fā)現(xiàn)n:Fl:4時(shí)，肝靶向納米聚乙烯亞胺藥物載體系統(tǒng)粒徑小，粒徑分布均勻，適合作為肝靶向載藥系統(tǒng)。
在上述實(shí)施例中，制得了粒徑為10 500nm的基于聚乙烯亞胺的肝耙向型智能納米膠束前藥。上述實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明但并不局限于此，應(yīng)該理解在不脫離本發(fā)明的精神范圍內(nèi)還可有多種變通或替換方案。
權(quán)利要求
1、一種肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，其特征在于結(jié)構(gòu)通式為[T-PEG]n-PEI-(ADR)m其中T為D-半乳糖，乳糖或靶向肽；PEG為分子量為35000Da，25000Da，10000Da，3500Da或者1800Da的聚乙二醇；PEI為分子量為60000Da，10000Da，1800Da，1200Da，600Da或者423Da的支化或直鏈PEI聚乙烯亞胺；ADR為阿霉素；n，m為1-350的整數(shù)；納米顆粒粒徑為10～500nm。
2、 如權(quán)利要求l所述的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，其特征在于PEG分子量為3500-25000Da。
3、 如權(quán)利要求1所述的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，其特征在于PEI為支化的PEI。
4、 如權(quán)利要求l所述的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，其特征在于載體與阿霉素之間通過共價(jià)鍵連接。
5、 如權(quán)利要求1所述的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，其特征在于載體與阿霉素之間通過溶酶體可降解的共價(jià)鍵連接。
6、 如權(quán)利要求l、 4或者5所述的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，載體與阿霉素之間的連接鍵可為肼鍵、腙鍵、縮醛鍵或原酸酯鍵。
7、 如權(quán)利要求l所述的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，其特征在于納米顆粒粒徑為100 150nm。
8、 如權(quán)利要求1所述的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于步驟如下第一步聚乙烯亞胺(PEI)與半乳糖聚乙二醇NHS酯先在冰鹽浴中反應(yīng)12小時(shí)，然后在室溫下反應(yīng)72小時(shí)，透析得(T-PEG-PEI);第二步T-PEG-PEI與琥珀-4-(氮maleimidomethyl)環(huán)己烷-l-磺酸鈉SMCC溶解于三蒸水中，室溫下攪拌72小時(shí)，透析得T-PEG-PEI-SMCC;第三步先將3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)肼解，肼解產(chǎn)物與阿霉素鹽酸鹽(ADM-HC1)室溫下攪拌反應(yīng)72小時(shí)，然后透析得阿霉素巰基衍生物(ADR-SH);第四步ADR-SH與T-PEG-PEI-SMCC在室溫下攪拌反應(yīng)72小時(shí)，然后將反應(yīng)液經(jīng)葡聚糖G-50凝膠柱處理，得T-PEG-PEI-ADR。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于聚乙烯亞胺的肝靶向型智能納米膠束前藥系統(tǒng)，提供了制備該大分子前藥的方法。本發(fā)明是以遠(yuǎn)端帶肝靶向基團(tuán)(T)的聚乙二醇修飾毒性較低的聚乙烯亞胺為載體(T-PEG-PEI)，以阿霉素(ADR)作為治療藥物，載體與阿霉素之間通過溶酶體可降解的共價(jià)鍵連接而得前藥(T-PEG-PEI-ADR)。T-PEG-PEI-ADR前藥在水溶液中自組裝成粒徑10～500nm的膠束。該膠束前藥系統(tǒng)在血液中能夠長(zhǎng)效循環(huán)，并能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)聚合物納米膠束的吞噬作用，并能將治療藥物選擇性地運(yùn)送到肝腫瘤部位，定向殺傷肝腫瘤細(xì)胞，降低阿霉素治療肝癌的毒副作用，提高了現(xiàn)有肝癌治療藥物的臨床療效和生物利用度。
文檔編號(hào)A61K47/34GK101574527SQ20071017211
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2007年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日
發(fā)明者余家會(huì), 公彥寶, 劉順英, 羅淑芳 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)