專利名稱：放射性標(biāo)記的喹啉和喹啉酮衍生物及其作為代謝性谷氨酸受體配體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表現(xiàn)出代謝性谷氨酸受體拮抗活性，尤其是mGlu1受體活性的放射性標(biāo)記的喹啉和喹啉酮衍生物及其制備；進(jìn)一步涉及了含有它們的組合物以及它們在診斷方法中的用途，特別是在標(biāo)記和識別代謝性谷氨酸受體位點和使器官顯影的診斷方法中的用途。
介紹神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸被認(rèn)為是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。該神經(jīng)遞質(zhì)與代謝性谷氨酸受體(mGluRs)的結(jié)合激活了多種細(xì)胞內(nèi)第二信使系統(tǒng)，親代謝性谷氨酸受體是G蛋白偶聯(lián)受體的亞科，包含mGluRs的8種不同亞型，即mGluR1至mGluR8。根據(jù)氨基酸序列同源性，受體利用的第二信使和藥理特征，mGluRs可被分成3組。包含mGluR亞型1和5的I組mGluRs與磷脂酶C偶聯(lián)，它們的激活引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子活動。II組mGluRs(mGluR2和3)和III組mGluRs(mGluR4，6，7和8)與腺苷酰環(huán)化酶偶聯(lián)，它們的激活引起第二信使cAMP的減少和神經(jīng)元活性的降低。使用I組mGluR拮抗劑的治療方法已經(jīng)顯示可作用于平行聯(lián)會染色體導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放減少并降低經(jīng)突觸后機制的谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮。由于影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多病理生理過程和疾病狀態(tài)被認(rèn)為是由過量谷氨酸誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮引起的，因此I組mGluR的拮抗劑，特別是mGluR1拮抗劑在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其是精神疾病和神經(jīng)疾病中是有治療效果的。
然而，迄今為止沒有得到特異性的mGluR1配體，這種缺乏嚴(yán)重阻礙了mGlu1受體的研究，尤其阻礙了通過放射自顯影研究這些受體在腦中的明確分布和豐度...對第I組而言，目前為止只能使用[3H]谷氨酸，其作用于大鼠(Thomsen等，Brain Res.61922-28，1993)或人(Kingston等，Neuropharmacology37277-287，1998)的mGlu1a受體。對于mGlu1a受體和mGlu5受體而言可使用[3H]使君子氨酸，然而，所述的受體不是特異性mGlu1受體(它也與AMPA受體結(jié)合)，并且是競爭性的，例如，它取代谷氨酸(Mutel等，J.Neurochem.752590-2601，2000)。
本發(fā)明的目的在于提供合適的特異性的，尤其是非競爭性的mGlu1受體配體。
發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一組特殊的化合物(以放射性標(biāo)記形式)提供了合適的特異性的，尤其是非競爭性的mGlu1受體配體，并提供了一種用于標(biāo)記和識別代謝性谷氨酸受體位點以及使器官顯影的方法。
在本申請中，術(shù)語“特異性的”指配體優(yōu)選地與mGlu1受體位點結(jié)合。術(shù)語“非競爭性的”指配體與mGlu1受體位點結(jié)合時不置換或只是邊緣置換谷氨酸。
WO02/28837公開了本發(fā)明的非放射性化合物。
WO99/26927公開了具有喹啉結(jié)構(gòu)的I組mGluRs拮抗劑用于治療神經(jīng)疾病和神經(jīng)紊亂。
WO99/03822公開了二環(huán)代謝性谷氨酸受體配體，它們不具有喹啉或喹啉酮結(jié)構(gòu)。
WO94/27605公開了1，2，3，4-四氫喹啉-2，3，4-三酮-3或4-肟及用其治療和預(yù)防神經(jīng)元損失，神經(jīng)退行性疾病，興奮性氨基酸活動過度及焦慮的不良后果，和其放射性標(biāo)記的化合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有式(I-A)*或(I-B)*的放射性標(biāo)記的化合物 其N-氧化物，其藥學(xué)上可接受的加成鹽，其季胺與其立體異構(gòu)體，式中X代表O；C(R6)2，其中R6是氫，可任意被氨基或單或二(C1-6烷基)氨基取代的芳基或C1-6烷基；S或R7是氨基或羥基的N-R7；R1代表C1-6烷基；芳基；噻吩基；喹啉基；C3-12環(huán)烷基或(C3-12環(huán)烷基)C1-6烷基，其中C3-12環(huán)烷基部分可任意包含雙鍵，環(huán)C3-12烷基部分中的一個碳原子可被氧原子或NR8-部分取代，R8是氫，苯甲基或C1-6烷氧羰基；其中C1-6烷基部分或C3-12環(huán)烷基部分中的一個或多個氫原子可任意被C1-6烷基，羥基C1-6烷基，鹵代C1- 6烷基，氨基C1-6烷基，羥基，C1-6烷氧基，芳基C1-6烷氧基，鹵素，C1-6烷氧羰基，芳基，氨基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷氧羰基氨基，鹵素，哌嗪基，吡啶基，嗎啉基，噻吩基或式-O-，-O-CH2-O或-O-CH2-CH2-O-的二價基團取代；或式(a-1)的基團 其中Z1是單共價鍵，O，NH或CH2；Z2是單共價鍵，O，NH或CH2；n是整數(shù)0，1，2或3；和其中苯環(huán)中的每一個氫原子可獨立地任意地被鹵素，羥基，C1-6烷基，C1-6烷氧基或羥基C1-6烷基取代；或X和R1可用碳原子連接在一起，形成式(b-1)，(b-2)或(b-3)的基團； R2代表氫；鹵素；氰基；C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-6烷硫基；C1-6烷基羰基；C1-6烷氧羰基；C1-6烷基羰基氧C1-6烷基；C2-6烯基；羥基C2-6烯基；C2-6炔基；羥基C2-6炔基；三(C1-6烷基)甲硅基C2-6炔基；氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷硫基C1-6烷基)氨基；芳基；芳基C1-6烷基；芳基C2-6炔基；C1-6烷氧基C1-6烷基氨基C1-6烷基；任意被C1-6烷基，C1-6烷氧基C1-6烷基，C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或吡啶基C1-6烷基取代的氨基羰基；選自噻吩基，呋喃基，吡咯基，噻唑基，噁唑基，咪唑基，異噻唑，異噁唑基，吡唑基，吡啶基，吡嗪基，噠嗪基，嘧啶基，哌啶基哌啶基和哌嗪基的雜環(huán)，任意的N被C1-6烷氧基C1-6烷基，嗎啉基，硫代嗎啉基，二噁烷基或二噻烷基取代；基團-NH-C(＝O)R9其中R9代表任意被C3-12環(huán)烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷氧基羰基，芳基，芳基氧基，噻吩基，吡啶基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷硫基，芐硫基，吡啶硫基或嘧啶硫基取代的C1-6烷氧基；C3-12環(huán)烷基；環(huán)己烯基；氨基；芳基C3-12環(huán)烷基氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基)氨基；單或二(C2-6烯基)氨基；單或二(芳基C1-6烷基)氨基；單或二芳基氨基；芳基C2-6烯基；呋喃基C2-6烯基；哌啶基；哌嗪基；吲哚基；呋喃基；苯并呋喃基；四氫呋喃基；茚基；金剛烷基(adamantyl)；吡啶基；吡嗪基；芳基；芳基C1-6烷硫基；或式(a-1)基團；磺胺類-NH-SO2-R10其中R10代表C1-6烷基，單或多鹵素C1-6烷基，芳基C1-6烷基，芳基C2-6烯基，芳基，喹啉基，異噁唑基或二(C1-6烷基)氨基；R3和R4分別獨立代表氫；鹵素；羥基；氰基；C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷基羰基；C1-6烷氧基羰基；C2-6烯基；羥基C2-6烯基；C2-6炔基；羥基C2-6炔基；三(C1-6烷基)甲硅基C2-6炔基；氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷硫基C1-6烷基)氨基；芳基；嗎啉基C1-6烷基或哌啶基C1-6烷基；或R2和R3可一起連接形成-R2-R3-，代表式-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，-CH＝CH-CH＝CH-，-Z4-CH＝CH-，-CH＝CH-Z4-，-Z4-CH2-CH2-CH2-，CH2-Z4-CH2-CH2-，-CH2-CH2-Z4-CH2-，-CH2-CH2-CH2-Z4-，-Z4-CH2-CH2-，-CH2-Z4-CH2-或-CH2-CH2-Z4-的二價基團，其中Z4是O，S，SO2或NR11，R11是氫，C1-6烷基，苯甲基或C1-6烷氧基羰基；其中每一個二價基團任意被C1-6烷基取代。
或R3和R4可一起連接形成-CH＝CH-CH＝CH-或-CH2-CH2-CH2-CH2-的二價基團；R5代表氫，C3-12環(huán)烷基；哌啶基；氧代噻吩基；四氫噻吩基；芳基C1 -6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或C1-6烷基，任選的用C(＝O)NRxRy基團取代，其中Rx和Ry各自獨立地是氫，C3-12環(huán)烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，任選地用氰基，C1-6烷氧基，C1 -6烷氧基羰基，呋喃基，，吡咯烷基，苯甲硫基，吡啶基，吡咯基或噻吩基取代。
Y代表O或S；或Y和R5可一起連接形成＝Y(jié)-R5-，＝Y(jié)-R5-代表-CH＝N-N＝(c-1)；-N＝N-N＝(c-2)；或-N-CH＝CH-(c-3)的基團；芳基代表任意用一種或多種取代基取代的苯基或萘基，取代基選自鹵素，羥基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，苯氧基，硝基，氨基，硫基，C1-6烷硫基，鹵代C1-6烷基，多鹵代C1-6烷基，多鹵代C1-6烷氧基，羥基C1-6烷氧基C1-6烷基，氨基C1-6烷基，單或二(C1-6烷基)氨基，單或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基，氰基，-CO-R12，-CO-OR13，-NR13SO2R12，-SO2-NR13R14，-NR13C(O)R12，-C(O)NR13R14，-SOR12，-SO2R12；其中R12，R13和R14分別獨立地代表C1-6烷基；C3-6環(huán)烷基；苯基；用鹵素，羥基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，鹵素C1-6烷基，多鹵素C1-6烷基，呋喃基，噻吩基，吡咯基，咪唑基，噻唑基或噁唑基取代的苯基；當(dāng)R1-C(＝X)部分與不是7位或8位的另一個位置連接時，所述7位和8位可以用R15和R16取代，其中R15和R16分別或都為C1-6烷基，C1-6烷氧基，或R15和R16一起連接形成-CH＝CH-CH＝CH-的二價基團。
如上述定義，以下作為一組或一組的部分C1-6烷基包括具有1-6個碳原子的直鏈和支鏈飽和烴基團，例如，甲基，乙基，丙基，丁基，戊基或己基；作為一組或一組的部分的C2-6烯基包括具有一個雙鍵的2-6個碳原子的直鏈和支鏈烴基，例如乙烯基，丙烯基，丁烯基，戊烯基，己烯基，3-甲基丙烯基等；作為一組或一組的部分的C2-6炔基定義為具有一個三鍵的2-6個碳原子的直鏈和支鏈烴基，例如乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基，，3-甲基丁炔基等；C3-6環(huán)烷基包括單環(huán)烷基環(huán)狀結(jié)構(gòu)，例如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基和環(huán)己基；C3- 12環(huán)烷基包括單-，雙-或三環(huán)烷基環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常例如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基，環(huán)辛基，降冰片烷基(norbornanyl)，金剛烷基。
術(shù)語鹵素一般指氟，氯，溴和碘。如上述和下文中所使用的，作為一組或一組的部分多鹵代C1-6烷基定義為單或多鹵取代的C1-6烷基，尤其用一個或多個氟原子取代的甲基，例如，雙氟甲基和三氟甲基。當(dāng)多于一個的鹵原子連接到定義的多鹵代C1-6烷基的烷基，他們可以相同或不同。
在任意結(jié)構(gòu)中變量，如芳基，存在不止一次時，每一個定義是獨立的。
引入環(huán)結(jié)構(gòu)的任意鍵意指相應(yīng)的取代基可以與所述環(huán)結(jié)構(gòu)的任意原子連接。例如R1-C(＝X)部分可以與喹啉或喹啉酮的5，6，7，8位連接，也可以與3或4位連接。
術(shù)語“放射性標(biāo)記的化合物”指式(I-A)*或(I-B)*的任意化合物，其N氧化物，藥學(xué)上可接受的加成鹽，季胺形式或立體異構(gòu)體包含至少一個放射性原子。在本申請中，不包含放射性原子的化合物用不帶星號的分子式表示，包含放射性原子的化合物用帶星號的分子式表示?；衔锟捎谜踊蜉椛洇昧Ｗ拥姆派湫院怂貥?biāo)記。對放射配體結(jié)合技術(shù)(膜受體分析法)而言，[3H]原子或[125I]原子是其選擇的原子。對于顯影而言，最常用的輻射正子的(PET)放射性核素是11C，18F，15O和13N，所有這些原子都是加速器產(chǎn)生的，半衰期分別為20，100，2和10分鐘。
由于這些放射性核素的半衰期非常短，只能在具有加速器的研究機構(gòu)里即時的生成并使用，因此限制了它們的使用。最廣泛使用的放射性核素是18F，99mTc，201Tl和123I。
特別地，放射性原子選自氫，碳，氮，硫，氧和鹵素。優(yōu)選地，放射性原子選自氫，碳和鹵素。
特別地，放射性原子選自3H，11C，18F，122I，123I，125I，131I，，75Br，76Br，77Br和82Br。優(yōu)選地，放射性原子選自3H，11C和18F。
術(shù)語“本發(fā)明化合物”是指式(I-A)*或(I-B)*的化合物，其N氧化物，藥學(xué)上可接受的加成鹽，季胺或立體異構(gòu)體。
對體內(nèi)使用而言，式(I-A)*或(I-B)*化合物的鹽中的相反離子是藥學(xué)上可接受的。然而，非藥學(xué)上可接受的酸鹽或堿鹽也是可以使用的，例如，用于制備或純化藥學(xué)上可接受的化合物。無論是藥學(xué)上可接受的或非藥學(xué)上可接受的所有的鹽都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語“體內(nèi)”是指將本發(fā)明化合物施用于活體動物的任何應(yīng)用。
上述的藥學(xué)上可接受的加成鹽包含式(I-A)*或(I-B)*的化合物所能形成的具有治療活性的非毒性的酸加成鹽形式。后者能通過用適當(dāng)?shù)乃崽幚韷A式化合物方便地獲得，適當(dāng)?shù)乃崛鐭o機酸，例如，氫鹵酸，例如鹽酸，氫溴酸等；硫酸；硝酸；磷酸等；或有機酸，例如，醋酸，丙酸，羥乙酸，2-羥基丙酸，2-氧代丙酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，，馬來酸，富馬酸，蘋果酸，酒石酸，2-羥基-1，2，3-丙三酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，4-甲基苯磺酸，環(huán)己氨磺酸，2-羥基苯甲酸，4-氨基-2-羥基苯甲酸等。反之，鹽形式可通過使用堿處理而轉(zhuǎn)換成游離堿形式。
含有酸質(zhì)子的式(I-A)*或(I-B)*的化合物可以通過用適當(dāng)?shù)挠袡C和無機堿處理轉(zhuǎn)換成具有治療活性的非毒性金屬或胺加成鹽形式。適當(dāng)?shù)膲A性鹽形式包含，例如，銨鹽，堿金屬鹽和堿土金屬鹽，例如，鋰鹽，鈉鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等，有機堿的鹽，例如，一級，二級和三級脂肪胺和芳香胺例如甲基胺，乙基胺，丙基胺，異丙基胺，四丁基胺異構(gòu)體，二甲基胺，二乙基胺，二乙醇胺，二丙胺，二異丙胺，二正丁基胺，吡咯烷，哌啶，嗎琳，三甲胺，三乙胺，三丙胺，奎寧，吡啶，喹啉和異喹啉，the benzathine，N-甲基-D-葡萄糖胺，2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇，三乙醛縮二胺鹽，和與氨基酸例如精氨酸，賴氨酸等成的鹽。反之，鹽形式可通過使用酸處理而轉(zhuǎn)換成游離酸形式。
術(shù)語“加成鹽”也包含式(I-A)*或(I-B)*的化合物能形成的水合物和溶劑合物的形式。例如水合物，醇合物等。
上述的術(shù)語“季胺”定義為能通過式(I-A)*或(I-B)*的化合物的堿性氮與適當(dāng)?shù)募句@化試劑反應(yīng)形成的式(I-A)*或(I-B)*的化合物的季銨鹽，適當(dāng)?shù)募句@化試劑如任意被取代的烷基鹵，芳基鹵或芳基烷基鹵，例如，碘甲烷或碘代苯甲烷。也可以使用其他具有很好離去基團的試劑，例如烷基三氟甲磺酸酯，烷基甲磺酸酯和烷基p-甲苯磺酸酯。季胺具有帶正電荷的氮。藥學(xué)上可接受的反離子包括氯離子，溴離子，碘離子，三氟醋酸根和醋酸根。使用離子交換樹脂引進(jìn)選擇的反離子。
應(yīng)注意本發(fā)明的一些化合物可包括一個或多個手性中心，存在立體異構(gòu)體形式。
上述的術(shù)語“立體異構(gòu)體”定義為本發(fā)明化合物或生理功能的衍生物的所有可能的立體異構(gòu)體形式。除非另有提示或暗示，指定的化合物指的是所有可能的立體異構(gòu)體形式的混合物，所述混合物包含基本分子結(jié)構(gòu)的所有非對映異構(gòu)體和對映體，以及本發(fā)明化合物每一個獨立的異構(gòu)體形式，基本純凈，及，所含的其它異構(gòu)體低于10％，優(yōu)選5％，尤其低于2％，更優(yōu)選低于1％。本發(fā)明化合物的立體異構(gòu)體形式顯然應(yīng)包括本發(fā)明的范圍。此處描述同樣適用于制備本發(fā)明化合物終產(chǎn)物的中間體。
此處使用的術(shù)語順式和反式與美國化學(xué)文摘命名法一致。
在一些本發(fā)明化合物和用于它們制備的中間體中，絕對立體構(gòu)型還沒有被確定。在這種情況下，不用參考實際的立體構(gòu)型，首先分離出來的立體異構(gòu)體被命名為“A”，其次的為“B”。然而，所述的“A”和“B”立體異構(gòu)體能用物理化學(xué)特性清楚地表征，例如它們的旋光度，因為“A”和“B”具有光學(xué)異構(gòu)關(guān)系。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能使用本領(lǐng)域已知的方法例如X-射線衍射來確定化合物的絕對構(gòu)型。當(dāng)“A”和“B”是立體異構(gòu)體混合物時，它們可被進(jìn)一步地分離，不用參考實際的立體構(gòu)型，各自首先分離出來的組分命名為“A1”和“B1”，其次的為“A2”和“B2”。
本發(fā)明化合物的N-氧化物是指包含式(I-A)*或(I-B)*的化合物，其中一個或幾個氮原子被氧化成所謂的N-氧化物。
本發(fā)明的一些化合物也可以以它們互變異構(gòu)體形式存在。這種形式盡管沒有明確在上式中暗示，意指包括本發(fā)明化合物的范圍。那些立體化學(xué)純化的式(I-A)*或(I-B)*的化合物是特別令人感興趣。
一組令人感興趣的化合物是那些式(I-A)*或(I-B)*的化合物，式中X代表O；R6是氫或芳基的C(R6)2；或R7是氨基或羥基的N-R7；R1代表C1-6烷基；芳基；噻吩基；喹啉基；C3-12環(huán)烷基或(C3-12環(huán)烷基)C1-6烷基，其中C3-12環(huán)烷基的一部分可任意包含雙鍵，和環(huán)C3-12烷基部分中的一個碳原子可被氧原子或NR8-部分取代，R8是苯甲基或C1-6烷氧羰基；其中C1-6烷基部分或C3-12環(huán)烷基部分中的一個或多個氫原子可任意被C1-6烷基，鹵代C1-6烷基，羥基，C1-6烷氧基，芳基C1-6烷氧基，鹵素，芳基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷氧羰基氨基，鹵素，哌嗪基，吡啶基，嗎啉基，噻吩基或式-O-或-O-CH2-CH2-O-的二價基團取代；或式(a-1)的基團 其中Z1是單共價鍵，O或CH2；Z2是單共價鍵，O或CH2；n是整數(shù)0，1，或2；和其中苯環(huán)中的每一個氫原子可獨立地任意地被鹵素或羥基取代；或X和R1可用碳原子連接在一起，形成式(b-1)，(b-2)或(b-3)的基團； R2代表氫；鹵素；氰基；C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-6烷硫基；C1-6烷基羰基；C1-6烷氧基羰基；C2-6烯基；羥基C2-6烯基；C2-6炔基；羥基C2-6炔基；三(C1-6烷基)甲硅基C2-6炔基；氨基；單或二(C1 -6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基C1-6烷基)氨基；單或二(C1 -6烷硫基C1-6烷基)氨基；芳基；芳基C1-6烷基；芳基C2-6炔基；C1-6烷氧基C1-6烷基氨基C1-6烷基；任意被C1-6烷氧基羰基C1-6烷基取代的氨基羰基；雜環(huán)選自噻吩基，呋喃基，噻唑基，哌啶基，任意N取代的嗎啉基或硫代嗎啉基；基團-NH-C(＝O)R9其中R9代表任意被C3-12環(huán)烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷氧基羰基，芳基，芳基氧基，噻吩基，吡啶基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷硫基，苯甲硫基，吡啶硫基或嘧啶硫基取代的C1-6烷氧基；C3-12環(huán)烷基；環(huán)己烯基；氨基；芳基C3-12環(huán)烷基氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基)氨基；單或二(C2-6烯基)氨基；單或二(芳基C1-6烷基)氨基；單或二芳基氨基；芳基C2-6烯基；呋喃基C2-6烯基；哌啶基；哌嗪基；吲哚基；呋喃基；苯并呋喃基；四氫呋喃基；茚基；金剛烷基；吡啶基；吡嗪基；芳基或式(a-1)基團；磺胺類-NH-SO2-R10其中R10代表C1-6烷基，單或多鹵素C1-6烷基，芳基C1-6烷基或芳基R3和R4分別獨立代表氫；C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基；或R2和R3可連接在一起形成-R2-R3-，代表-(CH2)4-，-(CH2)5-，-Z4-CH＝CH-，-Z4-CH2-CH2-CH2-或-Z4-CH2-CH2-的二價基團，其中Z4是O，S，SO2或NR11，R11是氫，C1-6烷基，苯甲基或C1-6烷氧基羰基；其中每一個二價基團任意被C1-6烷基取代。
或R3和R4可一起連接形成-CH＝CH-CH＝CH-或-CH2-CH2-CH2-CH2-的二價基團；R5代表氫；哌啶基；氧代噻吩基；四氫噻吩基；芳基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或C1-6烷基，任選的用C(＝O)NRxRy基團取代，其中Rx和Ry各自獨立地是氫，C3-12環(huán)烷基，C2-6炔基或C1-6烷基，任選地用氰基，C1-6烷氧基，C1-6烷氧基羰基取代。
Y代表O或S；或Y和R5可一起連接形成＝Y(jié)-R5-，＝Y(jié)-R5-代表-CH＝N-N＝(c-1)；或-N＝N-N＝(c-2)；芳基代表任意用一種或多種取代基取代的苯基或萘基，取代基選自鹵素，C1-6烷氧基，苯氧基，單或二(C1-6烷基)氨基和氰基；當(dāng)R1-C(＝X)部分與不是7位或8位的另一個位置連接時，所述7位和8位可以用R15和R16取代，其中R15和R16分別或都為C1-6烷基，C1-6烷氧基，或R15和R16連接在一起形成-CH＝CH-CH＝CH-的二價基團。
另一組最令人感興趣的化合物是那些式(I-A)*或(I-B)*的化合物，其中X代表O；R1代表C1-6烷基；C3-12環(huán)烷基或(C3-12環(huán)烷基)C1-6烷基，其中C1-6烷基部分或C3-12環(huán)烷基部分中的一個或多個氫原子可任意被C1-6烷氧基，芳基，鹵素，噻吩基取代；R2代表氫；鹵素；C1-6烷基或氨基；R3和R4分別獨立代表氫或C1-6烷基；或R2和R3可連接在一起形成-R2-R3-，代表-Z4-CH2-CH2-CH2-或-Z4-CH2-CH2-的二價基團，其中Z4是O或NR11，R11是C1-6烷基；其中每一個二價基團任意被C1-6烷基取代。
或R3和R4可連接在一起形成-CH2-CH2-CH2-CH2-的二價基團；R5代表氫；Y代表O；芳基代表任意用鹵素取代的苯基。
另一組令人感興趣的化合物是那些式(I-A)*或(I-B)*的化合物，其中R1-C(＝X)部分與喹啉或喹啉酮的6位連接。
特別令人感興趣的是以下放射性化合物
本發(fā)明所有化合物顯示了中等到強烈的mGluR1活性。這種活性歸功于所述化合物與mGlu1受體特異性結(jié)合，這使得化合物在診斷方法例如標(biāo)記和檢測mGlu1受體位點中是有效的。因此本發(fā)明也涉及用于診斷方法的本發(fā)明放射性標(biāo)記化合物。
第一優(yōu)選實施方案(輻射γ粒子的放射性核素)本發(fā)明第一優(yōu)選實施方案的放射性標(biāo)記的化合物包括至少一個[3H]原子或一個[125I]原子。[3H]原子通過部分或全部用放射性同位素取代分子式中一個或多個非放射性[1H]氫原子方便地獲得。使用[3H]或[125I]放射性配體的選擇部分取決于獲得相當(dāng)昂貴的液體閃爍計數(shù)器(LSC)的難易。[125I]配體可使用γ計數(shù)器或LSC定量，而[3H]配體必需使用LSC。
包含至少一個[3H]原子或一個[125I]原子的放射性標(biāo)記化合物方便地用于放射性配體結(jié)合技術(shù)中，尤其是用于標(biāo)記或測定生物物質(zhì)中mGlu1受體的體外膜受體分析。
由于本發(fā)明化合物具有方便的和意料不到的迅速通過血腦屏障的能力，包含至少一個[3H]原子或一個[125I]原子的放射性標(biāo)記化合物也方便地用于體內(nèi)腦部mGlu1受體放射自顯影。
因此本發(fā)明也涉及用于由標(biāo)記或測定生物物質(zhì)中mGlu1受體組成的診斷方法中的本發(fā)明放射性標(biāo)記化合物，和本發(fā)明化合物在用于體內(nèi)或體外標(biāo)記或測定生物物質(zhì)中mGlu1受體的診斷工具制造中的用途。
在本申請中，術(shù)語“生物物質(zhì)”意指包括具有生物基源的任何材料。特別地，它涉及組織樣品，血液，體液，體部分和來自溫血動物和本質(zhì)上是溫血動物尤其是人類的器官。
將膜受體分析系統(tǒng)用于標(biāo)記或測定生物物質(zhì)中mGlu1受體的基礎(chǔ)實驗是飽和實驗，抑制實驗，聯(lián)合動態(tài)實驗和分解動態(tài)實驗。這些方法適用于大多數(shù)的神經(jīng)遞質(zhì)和激素受體系統(tǒng)，包括mGluR1受體(Methods for Neurotransmitter Receptor Analysis，Henry I.Yamamura等，Raven Press Ltd.，New York，，1990)。最終，將放射性標(biāo)記化合物施于生物物質(zhì)以標(biāo)記mGlu1受體，檢測來自放射性標(biāo)記化合物的輻射以測定mGlu1受體的量或位置，例如用于體外受體放射自顯影。
包含至少一個[3H]原子或一個[125I]原子的放射性標(biāo)記化合物也可作為顯像測試化合物是否具有占據(jù)mGlu1受體位置或與mGlu1受體位置連接的能力的試劑。測試化合物從mGlu1受體位置置換本發(fā)明化合物的程度將顯示測試化合物占據(jù)mGlu1受體位置或與mGlu1受體位置連接的能力，因此可作為mGlu1受體的促效劑，拮抗劑或促效劑/拮抗劑混合物。
包含至少一個[3H]原子或一個[125I]原子的放射性標(biāo)記化合物可方便地通過用氚原子取代鹵原子制備，這記載于以下的實施例部分。
第二優(yōu)選實施方案(輻射正子的放射性核素)第二優(yōu)選實施方案中的放射性化合物包含至少一個放射性碳或鹵原子。原則上，包含碳或鹵原子的式(I)中的任何化合物傾向于通過用適當(dāng)?shù)姆派湫酝凰厝〈蓟螓u原子或使用放射性標(biāo)記試劑制備式(I)化合物來放射性標(biāo)記。為此適當(dāng)?shù)柠u原子放射性同位素是放射性碳原子，例如[11C]；放射性碘原子，例如[122I]，[123I]，[131I]；放射性溴原子，例如[75Br]，[76Br]，[77Br]和[82Br]；和放射性氟原子，例如[18F]。優(yōu)選的放射性標(biāo)記化合物是那些式(I-A)*和(I-B)*的化合物，其中R1包含放射性碳或鹵原子，尤其是[11C]，[18F]，[123I]，[75Br]，[76Br]或[77Br]。
放射性化合物的制備放射性鹵原子的引進(jìn)可通過例如以下描述的適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)來完成， 其中式(I-A-a)和(I-A-a)*中全部取代基如式(IA)*中所定義，并且鹵素是鹵原子。適當(dāng)?shù)幕衔?I-A-a)與H[18F]反應(yīng)以使喹啉環(huán)上的鹵原子通過親核置換反應(yīng)被放射性[18F]原子取代。
為取得式(I-B)*的放射性標(biāo)記化合物，可采用同等的方法進(jìn)行放射性標(biāo)記，例如通過以下描述的反應(yīng)方案。顯然地，也能夠用同等的方法取得式(I-A)*化合物，例如通過標(biāo)記R1取代基。

其他用于氚標(biāo)記的方法公開于例如Peng等的FusionTechnology，American Nuclear Society，21(2)307-311，1992和Brundish等的Journal of Labelled Compounds andRadiopharmaceuticals25(12)1361-1369(1988)。
放射性[11C]的引入可使用如下反應(yīng)方案完成，其中適當(dāng)?shù)幕衔?I-A-a)首先甲錫烷基化，然后采用例如鈀催化的[11C]碘甲烷的“Stille-type”偶合反應(yīng)引入放射性[11C]。(Scott，W.J.；Crisp，G.T.；Stille，J.K.J.Am.Chem.Soc.，1984，106，4630)。
在式(I-A-a)，(I-A-b)和(I-A-c)*中，全部取代基具有如式(I-A)*中定義的相同意義，鹵素是鹵原子并且R17是甲基或丁基。
由于它們具有意想不到的輕易穿透血腦屏障的性質(zhì)，用適當(dāng)?shù)慕M合物對動物特別是溫血動物在體內(nèi)方便地施用含有放射性鹵原子的放射性化合物，并且使用顯像技術(shù)檢測所述的放射性標(biāo)記的化合物的位置，例如，單光子發(fā)射計算機體層攝影(SPECT)或正電子發(fā)射體層攝影(PET)等。以這種方式能夠檢測遍及體內(nèi)mGlu1受體位點的分布，并且可通過上文提及的顯像技術(shù)顯影包含mGlu1受體位點的器官例如腦部。器官成像的方法也構(gòu)成了本發(fā)明的一個方面，該方法通過施用放射性標(biāo)記的式(I-A)*或(I-A)*化合物，其中式(I-A)*或(I-A)*化合物與mGlu1受體位點結(jié)合，然后檢測放射性化合物的放射。
上述技術(shù)中式(I-A)*和(I-B)*化合物的應(yīng)用構(gòu)成了本發(fā)明進(jìn)一步的方面。本發(fā)明尤其涉及了本發(fā)明化合物制造用于PET中的診斷工具的用途。在PET的使用中，大多優(yōu)選的是本發(fā)明放射性標(biāo)記化合物，其中包含18F(US 4,931,270，Horn等，1990年6月5日公開)。
非放射性化合物的制備本發(fā)明非放射性化合物可用許多種方法制備。
為簡化下列制備過程中的一些化合物和中間體的結(jié)構(gòu)式，在下文中將用符號Q代表喹啉或喹啉酮部分。
或 式(I-A)或(I-B)化合物，其中X代表0，所述的化合物由式(IA/B-a)表示，在下列條件存在下通過氧化式(II)中間體制備得到氧化劑例如高錳酸鉀，適當(dāng)?shù)南噢D(zhuǎn)移催化劑例如三(二氧雜-3，6-庚基)胺，適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氯甲烷。
式(IA/B-a)化合物也可通過式(III)中間體與式(IV)中間體在丁基鋰和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如四氫呋喃的存在下的反應(yīng)制備，其中W1代表鹵原子，例如溴。
另外，式(IA/B-a)化合物也可通過式(V)中間體與式(IV)中間體在丁基鋰和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如四氫呋喃的存在下的反應(yīng)制備。

式(IA/B-a)化合物，其中R1與羰基部分經(jīng)氧原子連接，所述的R1取代基用O-R1a表示而所述的化合物用式(IA/B-a-1)表示，能通過式(VI)中間體與式(VII)中間體在適當(dāng)?shù)乃崂缌蛩岬拇嬖谙碌姆磻?yīng)制備。
式(I-A)化合物，其中R2代表甲基羰基，所述化合物用式(I-A-1)表示，能通過式(VIII)中間體在適當(dāng)?shù)乃崂琨}酸和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如四氫呋喃的存在下的反應(yīng)制備。
式(I)化合物也可用本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)換方法相互轉(zhuǎn)換。
式(I-A)化合物其中R2是鹵原子例如氯，能通過適當(dāng)?shù)柠u化劑例如氟化鉀或碘化鈉在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二甲亞砜或乙腈以及任選地乙酰氯的存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A)化合物，其中R2是其他的鹵原子例如氟或碘。
式(I-A)化合物其中R2是適當(dāng)?shù)碾x去基團例如鹵原子如氯，碘，所述的離去基團用W2表示，所述的化合物用式(I-A-2)表示，能通過適當(dāng)?shù)那枰雱├缛谆桦嬖谶m當(dāng)?shù)膲A例如N，N-二乙基乙胺以及適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缢?三苯基磷)鈀的存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A)化合物，其中R2是氰基，所述的化合物用式(I-A-3)表示。
式(I-A-2)化合物也能通過C2-6炔基三(C1-6烷基)硅烷在CuI，適當(dāng)?shù)膲A例如N，N-二乙基乙胺以及適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缢?三苯基磷)鈀的存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A-4)化合物。式(I-A-4)化合物依次能通過氟化鉀在適當(dāng)?shù)乃崂缫宜岽嬖谙路磻?yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A-5)化合物，或通過適當(dāng)?shù)膲A例如氫氧化鉀在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如醇，如甲醇等存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成(I-A-5)化合物。
式(I-A-2)化合物也能通過(IX)中間體在CuI，適當(dāng)?shù)膲A例如N，N-二乙基乙胺以及適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缢?三苯基磷)鈀的存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A-6)化合物。
式(I-A-2)化合物也能在適當(dāng)?shù)耐榛瘎├鏢n(C1-6烷基)4反應(yīng)存在下轉(zhuǎn)換成一種化合物其中R2是C1-6烷基，所述的化合物用式(I-A-8)表示，或在適當(dāng)?shù)南┗噭├鏢n(C2-6烯基)(C1-6烷基)3存在下轉(zhuǎn)換成一種化合物其中R2是C2-6烯基，所述的化合物用式(I-A-9)表示，兩種反應(yīng)都有適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缢?三苯基磷)鈀和反應(yīng)惰性溶劑例如甲苯或二氧雜環(huán)己烷。
式(I-A-2)化合物也能通過式(X)中間體任選地在適當(dāng)?shù)膲A例如碳酸鉀和反應(yīng)惰性溶劑例如N，N-二甲基甲酰胺存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A-7)化合物，其中Z代表O或S。
式(I-A-2)化合物也能通過適當(dāng)?shù)腃1-6烷基醇和CO在適當(dāng)?shù)拇呋瘎├玮Z(II)醋酸鹽，三苯基鱗，適當(dāng)?shù)膲A例如碳酸鉀和反應(yīng)惰性溶劑例如N，N-二甲基甲酰胺存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A)化合物，其中R2是C1-6烷氧基羰基，所述的化合物用式(I-A-10)表示，以及式(I-A)化合物，其中R2是氫，所述的化合物用式(I-A-11)表示。
式(I-A-11)化合物也能通過式(I-A-2)化合物與Zn在適當(dāng)?shù)乃崂绱姿岽嬖谙路磻?yīng)制備。
式(I-A-2)化合物也能通過式H2N-C1-6烷基-C(＝O)-O-C1-6烷基的中間體在CO，適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缢?三苯基磷)鈀，適當(dāng)?shù)膲A例如N，N-二乙基乙酰胺以及適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如甲苯存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)化成式(I-A)化合物，其中R2是C1-6烷氧基羰基C1-6烷基取代的氨基羰基，所述的化合物用式(I-A-12)表示。
式(I-A-2)化合物也能通過式(XI)，(XII)或(XIII)中間體在適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缢?三苯基磷)鈀和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氧雜環(huán)己烷存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-A)化合物，其中R2是芳基或選自如以上R2定義中描述的雜環(huán)，所述的R2用R2a表示，所述的化合物用式(I-A-13)表示。
式(I-A-2)化合物也能通過甲羰基肼或疊氮鈉在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如乙醇，丁醇或N，N-二甲基甲酰胺中轉(zhuǎn)換成式(I-B)化合物，其中Y和R5連接在一起形成了式(b-1)或(b-2)的基團，所述的化合物用式(I-B-1)或(I-B-2)表示。
式(I-A-11)化合物也能通過適當(dāng)?shù)倪^氧化物例如3-氯-苯甲酰過酸在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氯甲烷中轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的用式(I-A-14)表示的N-氧化物。所述的式(I-A-14)化合物能進(jìn)一步地通過4-甲基-苯磺酰氯在適當(dāng)?shù)膲A例如碳酸鉀和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氯甲烷存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-B)化合物，其中R5是氫，所述的化合物用式(I-B-3)表示。
式(I-B-3)化合物也能通過適當(dāng)?shù)乃崂琨}酸在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如四氫呋喃存在下由式(I-A)化合物制備，其中R2是C1-6烷氧基，所述的化合物用式(I-A-15)表示。
式(I-B-3)化合物能通過適當(dāng)?shù)耐榛瘎├缡?XIV)的中間體，其中W3代表適當(dāng)?shù)碾x去基團例如鹵原子如碘，在叔丁氧基鈉和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如四氫呋喃存在下轉(zhuǎn)換成式(I-B)化合物，其中R5代表C1 -6烷基，所述的化合物用式(I-B-4)表示。
式(I-B-3)化合物也能通過式(XV)的中間體，其中W4代表適當(dāng)?shù)碾x去基團例如鹵原子如溴，氯等，在適當(dāng)?shù)膲A例如氫化鈉和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如N，N-二甲基甲酰胺存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-B)化合物，其中R5是C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或芳基C1-6烷基，所述的R5用R5a表示并且所述的化合物用式(I-B-5)表示。
式(I-A-2)化合物也能通過H2N-C(＝S)-NH2在適當(dāng)?shù)膲A例如氫氧化鉀和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如醇如乙醇或水存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(I-B)化合物，其中R5是氫而Y是S，所述的化合物用式(I-B-6)表示。式(I-B-6)化合物能通過適當(dāng)?shù)腃1-6烷基鹵例如C1-6烷基碘，在適當(dāng)?shù)膲A例如碳酸鉀和適當(dāng)?shù)娜軇├缫彝嬖谙逻M(jìn)一步地轉(zhuǎn)換成式(I-A)化合物，其中R2是C1-6烷硫基，所述的化合物用式(I-A-16)表示。
式(IA/B-a)化合物能通過式(XVI)的中間體，任選地在適當(dāng)?shù)膲A例如N，N-二乙基乙胺存在下和在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如醇如乙醇存在下轉(zhuǎn)換成式(I-A)或(I-B)化合物，其中X是N-R7，所述的化合物用式(IA/B-b)表示。
由于在以上描述的式(I-A-13)化合物的制備過程中已經(jīng)指出了，因此式(I)化合物也可以用本領(lǐng)域公知的將三價氮轉(zhuǎn)換成其氮氧化物的方法轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的N-氧化物形式。所述的N-氧化反應(yīng)通常是通過式(I)原料與適當(dāng)?shù)挠袡C或無機過氧化物反應(yīng)進(jìn)行的。適當(dāng)?shù)臒o機過氧化物包含，例如，過氧化氫，堿金屬或堿土金屬的過氧化物如過氧化鈉，過氧化鉀；適當(dāng)?shù)挠袡C過氧化物可包含過氧酸例如苯甲酰過酸或鹵代苯甲酰過酸，如3-氯苯甲酰過酸，過氧化鏈烷酸如過氧化乙酸，烷基氫過氧化物例如叔丁基氫過氧化物。適當(dāng)?shù)娜軇┦牵?，水，低級鏈烯醇，如乙醇等，烴如甲苯，酮如2-丁酮，鹵代烴如二氯甲烷，以及這些溶劑的混合物。
用于以上反應(yīng)過程中的一些中間體和原料可在商業(yè)上獲得，或可以依照以上已經(jīng)描述的方法合成。
式(II)中間體可通過式(XVII)中間體與式(XVIII)中間體在鎂，乙醚和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如乙醚存在下反應(yīng)制備，其中W5代表適當(dāng)?shù)碾x去基團例如鹵原子如氯，溴等。
式(XVII)中間體可通過在適當(dāng)?shù)难趸瘎├鏜nO2和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氯甲烷存在下氧化式(XIX)中間體制備。
式(XIX)中間體能通過在適當(dāng)?shù)倪€原劑例如氫化鋰鋁和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如四氫呋喃存在下還原式(XX)中間體制備。
式(XX)中間體能通過在3-硝基-苯酚鈉，適當(dāng)?shù)乃崛缌蛩岷瓦m當(dāng)?shù)拇既缂状?，乙醇，丙醇，丁醇等存在下中間體(XXI)和中間體(XXII)的反應(yīng)制備，其中Q代表任意地在3位用C1-6烷基取代的喹啉部分，而羰基部分是在6位，所述的中間體用式(XX-a)表示。
另外，式(II)中間體也能通過在適當(dāng)?shù)脑噭├缍』嚭瓦m當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑如四氫呋喃存在下用式(XXIII)中間體與式(XXIV)中間體反應(yīng)制備，其中W6是適當(dāng)?shù)碾x去基團例如鹵原子如溴，氯等。
式(XXIII)中間體能通過在惰性溶劑例如二氯甲烷中使用Moffatt Pfitzner或Swern氧化反應(yīng)(二甲基亞砜與脫水劑例如DCC，AcO2，SO3，P4O10，COCl2或Cl-CO-COCl合用)氧化式(XXV)中間體制備。
式(XXV)中間體能通過在適當(dāng)?shù)倪€原劑例如氫化鋰鋁和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如苯存在下還原式(XXVI)中間體制備。
式(XXVI)中間體能通過在適當(dāng)?shù)拇祭缂状迹掖?，丙醇，丁醇等和適當(dāng)?shù)乃崂缌蛩岽嬖谙迈セ?XXVII)中間體制備。
式(XXVII)中間體其中R1代表式(a-1)的基團，其中Z1是O，Z2是CH2而n是1，所述的中間體用式(XXVIII)代表，能通過在適當(dāng)?shù)倪€原劑例如氫，適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缁钚蕴急砻娴拟Z和適當(dāng)?shù)乃崂缫宜岽嬖谙逻€原式(XXVIII)中間體制備。當(dāng)中間體(XXVII)的R1代表任意取代的苯基部分時，它也能通過在適當(dāng)?shù)倪€原劑例如Al2O3表面的銠和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如四氫呋喃存在下的還原反應(yīng)轉(zhuǎn)換成任意取代的環(huán)己基部分。
式(IV)中間體其中Q代表2位用鹵素例如氯取代的喹啉部分，所述的中間體用式(IV-a)表示，能通過在POCL3存在下式(IV)中間體的反應(yīng)制備，其中Q代表R5是氫的喹啉部分，所述的中間體用式(IV-b)代表。
式(IV-a)中間體其中R4是氫，所述的中間體用式(IV-a-1)代表，也能通過在N，N-二甲基甲酰胺存在下式(XXIX)中間體與POCL3反應(yīng)制備(遵照成環(huán)作用的Vilsmeier-Haack甲酰化作用)
式(XXIX)中間體可通過在適當(dāng)?shù)膲A例如N，N-二乙基乙胺和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氯甲烷存在下式(XXX)中間體與式(XXXI)中間體的反應(yīng)制備，其中W7代表適當(dāng)?shù)碾x去基團例如鹵原子如氯。
式(IV-a)中間體能通過在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如醇如甲醇等存在下與式(XXXII)中間體反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(IV-c)中間體。
式(IV-a)中間體也能通過與式(XXXIII-a)的適當(dāng)?shù)陌贩磻?yīng)轉(zhuǎn)換成式(IV-d-1)中間體，其中Z3和Z4各自獨立的代表氫，C1-6烷基，C1-6烷氧基C1-6烷基，C1-6烷硫基C1-6烷基，或通過在適當(dāng)?shù)膲A例如碳酸鉀和反應(yīng)惰性溶劑例如N，N-二甲基甲酰胺存在下與式(XXXIII-b)的適當(dāng)?shù)陌忿D(zhuǎn)換成式(IV-d-2)中間體，其中Z3和Z4連接在一起形成如以上在R2中定義的至少包含一個氮原子的雜環(huán)。
式(IV-a)中間體，其中R3代表CH2-CH2-CH2-Cl，所述的中間體用式(IV-a-2)表示，也能通過與適當(dāng)?shù)乃崂琨}酸等反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(IV)中間體，其中R2和R3連接在一起形成式-O-CH2-CH2-CH2-的二價基團，所述的中間體用式(IV-e-1)表示。式(IV-a-2)中間體也能通過在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如醇，如乙醇存在下與H2N-C(＝S)-NH2反應(yīng)轉(zhuǎn)換成式(IV)中間體，其中R2和R3連接在一起形成式-S-CH2-CH2-CH2-的二價基團，所述的中間體用式(IV-e-2)表示。
式(V)中間體可以通過在1，1′-羰二咪唑和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氯甲烷存在下式(XXVII)中間體與式CH3-NH-O-CH3中間體反應(yīng)制備。
式(VII)中間體，其中Q代表喹啉部分，尤其喹啉部分中R2是乙基，R3是甲基并且R4是氫，羧基部分在6位，所述的中間體用式(VII-a)表示，能通過在適當(dāng)?shù)娜├鏑H3-CH2-CH(＝O)，(CH2O)n，ZnCl2，F(xiàn)eCl3和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如醇如乙醇存在下式(XXXIV)中間體反應(yīng)制備。
式(VIII)中間體能通過在適當(dāng)?shù)拇呋瘎├缢?三苯基磷)鈀和適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑例如二氧雜環(huán)己烷存在下式(XXXV)中間體與式(XXXVI)中間體的反應(yīng)制備。
依然設(shè)計了一些其他的制備方法，其中的一部分進(jìn)一步公開于本申請的實施例中。
本發(fā)明的化合物和中間體的純立體異構(gòu)體可通過應(yīng)用本領(lǐng)域公知的方法得到。非對映體可通過物理分離方法分離，例如選擇性結(jié)晶和色譜技術(shù)，如使用手性固定相的液相色譜。對映體可通過用與具有光學(xué)活性的酸形成它們非對映體的鹽從而選擇性結(jié)晶而相互分離。另外，對映體可通過使用手性固定相的色譜技術(shù)而分離。假如反應(yīng)立體選擇性或立體特異性地發(fā)生，所述的純立體異構(gòu)體也可由相應(yīng)的適當(dāng)原料的純立體異構(gòu)體得到。優(yōu)選地，假如想得到特定的立體異構(gòu)體，所述化合物將通過立體選擇性或立體特異性的制備方法合成。這些方法將方便地應(yīng)用手性純原料。式(I)化合物的立體異構(gòu)體顯然已包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
式(I-A)或(I-B)化合物的立體異構(gòu)體例如順式可通過在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)惰性溶劑，例如四氫呋喃存在下與適當(dāng)?shù)乃崂琨}酸反應(yīng)轉(zhuǎn)換成另外的立體異構(gòu)體例如相應(yīng)的反式。
本發(fā)明化合物的拮抗活性可在中國倉鼠卵巢細(xì)胞的克隆大鼠mGluR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗和Bennett結(jié)扎的小鼠的冷異常性疼痛試驗中得以證明，如下文所述。
由于它們的mGluR拮抗活性尤其是它們I組mGluR拮抗活性，更特別是它們的mGluR1拮抗活性，因此式(I-A)或(I-B)化合物，它們的N氧化物，藥學(xué)上可接受的加成鹽，季銨和立體化學(xué)異構(gòu)體在治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸介導(dǎo)的疾病中是有效的。
谷氨酸相關(guān)的疾病已經(jīng)被證明了包括藥物成癮性或戒斷(依賴性，阿片樣物質(zhì)耐藥性，阿片脫癮)，含氧量低，缺氧和局部缺血損傷(缺血性發(fā)作，心跳停止)，疼痛(神經(jīng)性疼痛，炎性痛，痛覺過敏)，低血糖，涉及神經(jīng)元損傷的疾病，腦外傷，頭部創(chuàng)傷，脊髓損傷，脊髓病，癡呆，焦慮，精神分裂癥，抑郁癥，認(rèn)知受損，健忘癥，雙向性精神障礙，行為紊亂，阿耳茨海默氏病，血管性癡呆，綜合性癡呆(阿耳茨海默氏病和血管性癡呆)，Lewy Body病，妄想癥或精神混亂，帕金森癥，亨廷頓氏舞蹈病，唐綜合癥，癲癇癥，老化，肌萎縮性側(cè)索硬化，多發(fā)性硬化癥，艾滋病(獲得性免疫缺乏綜合癥)和艾滋病相關(guān)的綜合癥(ARC)。
本發(fā)明也提供了施用于哺乳動物尤其是人類的組合物，包含治療有效量的放射性標(biāo)記的式(I-A)*或(I-B)*化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，尤其用于診斷，更特別地用于器官成像。
因此，本發(fā)明化合物或其任何亞組可以按配方制造成用于給藥目的的不同藥物形式。適當(dāng)?shù)慕M分可以引用所有通常用于系統(tǒng)給藥藥物的組分。為制備本發(fā)明的藥物組合物，治療有效量的特殊化合物，以堿或加成鹽形式，作為活性成分直接與藥學(xué)上可接受的載體混合，載體可取決于期望給藥的制劑形式而采用廣泛的形式。這些藥物組合物期望以適合的單一劑型，優(yōu)選地，用于口服給藥，直腸給藥，局部給藥，經(jīng)皮或注射給藥。例如，在制備口服劑型的組合物中，可應(yīng)用任何常用的藥學(xué)介質(zhì)，例如水，乙二醇，油，乙醇等在口服液體制劑中例如混旋液，糖漿劑，乳劑，酏劑和溶液或固體載體例如淀粉，糖，高嶺土，潤滑劑，粘合劑，崩解劑等在粉末，丸劑，膠囊和片劑。由于片劑和膠囊劑易于給藥，它們代表最方便的口服劑型，其中明顯應(yīng)用了固體藥物載體。對注射用組合物而言，載體通常包含至少大量無菌水，然而可包括其他組分例如助溶劑。例如，可制備注射用溶液其中載體包含鹽水溶液，葡萄糖溶液，或鹽水溶液和葡萄糖溶液的混合物。也可制備注射用混懸液其中應(yīng)用了適當(dāng)?shù)囊后w載體，混懸劑等。也包括在使用前不久可轉(zhuǎn)換成液體形式制劑的固體形式制劑。用于局部應(yīng)用的適當(dāng)?shù)慕M分也可引用通常用于局部給藥藥物中的所有組分，局部給藥藥物例如乳劑，凝膠劑，敷劑，洗發(fā)劑，酊劑，糊劑，軟膏劑，油膏劑，散劑等。在適用于經(jīng)皮給藥的組合物中，載體任意地包含促滲劑和/或適當(dāng)潤濕劑，任意地與適當(dāng)?shù)妮^小比例的天然添加劑組合，其中添加劑不會引起對皮膚的顯著有害作用。所述的添加劑可促進(jìn)對皮膚給藥和/或有助于制備期望的藥物組合物。這些組合物可通過多種方式給藥，例如透皮貼劑，spot-on，軟膏劑。
將上述的藥物組合物按配方制造成單位劑量形式尤其有利于給藥方便和劑量均一度。此處用于說明書和權(quán)利要求書中的單位劑量形式指的是適于作為單元劑量的物理分離的單位，每一單位包含通過計算產(chǎn)生預(yù)期治療效果而得到的預(yù)定數(shù)量的活性成分與所需的藥物載體。這樣的單位劑量形式的例子有片劑(包括刻痕片或包衣片)，膠囊劑，丸劑，栓劑，散劑包，糯米紙囊劑，注射用溶液或混懸劑，茶匙量，湯匙量等，及其分離倍數(shù)。
特征的給藥有效劑量和頻率取決于使用的特定式(I-A)*或(I-B)*化合物和進(jìn)行治療的哺乳動物的特定狀況，這對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是已知的。
下列實施例旨在說明而非限制本發(fā)明的范圍。
實驗例部分下文中，“DMF”定義為N，N-二甲基甲酰胺?！癉IPE”定義為二異丙醚，“DMSO”定義為二甲基亞砜，“BHT”定義為2，6-二(1，1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚，“THF”定義為四氫呋喃。
A.中間體的制備實施例A1制備 (中間體1)50℃氫化(在3巴H2壓力下)THF(220ml)中的4-(1-甲基乙氧基)苯甲酸(0.083mol)和Rh/Al2O35％(10g)的混合物過夜?；旌衔锿ㄟ^硅藻土過濾，用THF洗滌并蒸發(fā)。收率16g中間體1(100％)。
實施例A22-乙基-3-甲基-6-喹啉羧酸(中間體2)的制備在室溫下攪拌乙醇(250ml)中的4-氨基苯甲酸(0.299mol)混合物。加入ZnCl2(0.0367mol)和(CH2O)n(10g)。分批加入FeCl3.6H2O(0.5mol)，溫度升高至60-65℃。在兩小時之內(nèi)滴加完丙醛(30ml)?；旌衔锘亓?個小時，保持室溫12個小時。將混合物傾入水中，通過硅藻土過濾。用HCl 6N酸化至PH＝7，將混合物蒸發(fā)至干燥。殘留物不需進(jìn)一步的純化即可使用。收率56.1g 2-乙基-3-甲基-6-喹啉羧酸(中間體2)。
實施例A3制備 (中間體3)在5℃時加入戊酰氯(0.2784mol)至CH2Cl2(400ml)中的4-溴苯胺(0.232mol)和N，N-二乙基乙胺(0.2784mol)的混合物中。在室溫下攪拌混合物過夜，倒入水中，用CH2Cl2萃取。分離有機層，用濃縮的NH4OH溶液和水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。從乙醚中結(jié)晶殘留物(60g)。過濾沉淀物，干燥。在CH2Cl2中吸收殘留物(35g，63％)。分離有機層，以10％的K2CO3溶液洗滌，水洗，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。收率30g中間體(3)(54％)。
實施例A4制備 (中間體4)在60℃時攪拌POCl3中的6-溴-2(1H)-喹啉酮(0.089mol)混合物過夜，然后在100℃時攪拌3個小時，蒸發(fā)溶劑。在CH2Cl2中吸收殘留物，倒入冰水中，用濃縮的NH4OH堿化，通過硅藻土過濾，用CH2Cl2萃取。分離有機層，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。收率14.5g中間體(4)(67％)。
實施例A5a)制備 (中間體5)10℃時在N2流中滴加DMF(37ml)至POCl3(108ml)中。滴加完成后，允許混合物升至室溫。分批加入N-(4-溴苯基)丁酰胺(0.33mol)。在85℃時攪拌混合物過夜，然后允許冷卻至室溫，倒在冰上(放熱反應(yīng))。過濾沉淀物，用少量水洗，干燥(真空)。用EtOAc/乙醚洗滌殘留物，干燥。產(chǎn)率44.2g中間體(5)(50％)。
b)制備 (中間體6)甲醇(600ml)中中間體(5)(0.162mol)和35％的甲醇鈉的甲醇溶液(154ml)的混合物攪拌回流過夜?；旌衔锏乖诒?。過濾沉淀物，用少量水洗，在CH2Cl2中吸收。加入10％的K2CO3溶液，用CH2Cl2萃取。分離有機層，水洗，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。收率31.9g中間體(6)(74％)。
實施例A6制備 (中間體7)分批加入1，1′-羰基二-1H-咪唑(0.074mol)至CH2Cl2(200ml)中的4-甲氧基環(huán)己烷羧酸(0.063mol)混合物中。在室溫下攪拌混合物一小時。然后加入N-甲氧基甲胺(0.074mol)。在室溫下攪拌混合物過夜，倒入水中，用CH2Cl2萃取。分離有機層，用少量水洗，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。收率12.6g中間體7。
實施例A7a)以Pd/C(3g)作催化劑氫化在乙酸(400ml)中6-氟-4-氧代-4H-1-苯并呋喃-2-羧酸(0.30mol)混合物。在H2(3當(dāng)量)吸收后，過濾催化劑。蒸發(fā)濾液。在石油醚中攪拌殘留物。過濾沉淀物，干燥(真空；70℃)。用CHCl3/CH3OH重結(jié)晶后，過濾沉淀物，干燥(真空；80℃和高真空；85℃)。產(chǎn)率8.8g 6-氟-3，4-二氫-2H-1-苯并呋喃-2-羧酸(中間體8)(15.0％)。
b)在乙醇(400ml)和H2SO4(5ml)中中間體(8)(0.255mol)混合物攪拌回流8個小時。蒸發(fā)溶劑直至干燥。殘留物溶解于CH2Cl2中。分離有機層，以10％的K2CO3溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。收率45g 6-氟-3，4-二氫-2H-1-苯并呋喃-2-羧酸乙酯(中間體9)(79％)。
c)在N2下反應(yīng)。3.4M(0.44mol)二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉的70％重量甲苯溶液溶于苯溶液(150ml)(回流)中，并于一小時之內(nèi)將此混合物滴加至回流的中間體9(0.22mol)和苯(600ml)混合物中。在回流溫度下攪拌2.5小時，混合物冷卻至15℃。通過滴加乙醇(30ml)和水(10ml)分解混合物?；旌衔锏谷氡?水中，用濃縮的鹽酸酸化?；旌衔镉靡颐?500ml)萃取。水洗分離的有機相，干燥，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠柱色譜(洗脫液CHCl3)純化。收集期望的組分，蒸發(fā)洗脫液。產(chǎn)率34g 6-氟-3，4-二氫-2H-1-苯并呋喃-2-甲醇(中間體10)(85％)。
d)在N2下反應(yīng)。將亞磺酰基二[甲烷](30ml)在10分鐘內(nèi)加入至攪拌的冷卻的(-60℃；2-丙酮/CO2浴)CH2Cl2(350ml)中乙二醇二氯(0.1mol)混合物中。攪拌10分鐘后，在5分鐘內(nèi)加入CH2Cl2(90ml)中中間體10混合物。攪拌15分鐘后，加入N，N-二乙基乙胺(125ml)。當(dāng)混合物升溫至室溫時，倒入水中。用CH2Cl2提取產(chǎn)物。用水，HCl(1M)，水，NaHCO3(10％)和水洗滌有機相，干燥，蒸發(fā)。殘留物溶解于乙醚中，水洗，干燥，過濾，蒸發(fā)。殘留物通過硅膠柱色譜(洗脫液CHCl3)純化。收集期望的組分，蒸發(fā)洗脫液。產(chǎn)率21.6g 6-氟-3，4-二氫-2H-1-苯并呋喃-2-甲醛(中間體11)(67％)。
e)制備 (中間體12)在-70℃下緩慢滴加正丁基鋰1.6M(0.056mol)至中間體(5)(0.046mol)的THF(100ml)溶液中。在-70℃下攪拌混合物30分鐘。緩慢滴加中間體11(0.056mol)的THF(100ml)混懸液。在-70℃下攪拌混合物1小時，然后回至室溫，倒入H2O中，用EtOAc萃取。分離有機層，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(21g)通過硅膠柱色譜(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 80/10；15-35μm)純化。收集期望的組分，蒸發(fā)洗脫液。產(chǎn)率9.5g中間體12(55％)。
實施例A8a)制備 和 (中間體13)(中間體14)在120℃下攪拌DMF(500ml)中中間體(5)(0.1127mol)，2-甲氧基乙胺(0.2254mol)和K2CO3(0.2254mol)混合物15小時，然后冷卻。蒸發(fā)溶劑，在CH2Cl2和H2O中吸收殘留物。分離有機層，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑直至干燥。殘留物(33.53g)通過硅膠柱色譜(洗脫液CH2Cl2/CH3OH 99.5/0.5；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率5.7g中間體14(38％)和中間體13(34％)。
b)制備 (中間體15)在120℃下攪拌DMF(200ml)中中間體(5)(0.0751mol)，硫代嗎啉(0.0891mol)和K2CO3(0.15mol)混合物12個小時。蒸發(fā)溶劑直至干燥。在CH2Cl2和H2O中吸收殘留物。分離有機層，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(26g)通過硅膠柱色譜(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 80/20；20-45μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。結(jié)合兩種組分。產(chǎn)率9.4g中間體15(37％)；mp.82℃。
實施例A9a)將4-氨基苯甲酸(0.219mol)加入至3-硝基苯磺酸鈉(0.118mol)的H2SO470％(230ml)溶液中，攪拌并回流。滴加2-丙烯-1，1-二醇，2-甲基-，雙乙酸酯(0.216mol)，混合物回流4個小時。加入乙醇(200ml)，在80℃下攪拌混合物48個小時。蒸發(fā)混合物，將殘留物倒入冰水/NH4OH中，用CH2Cl2萃取。干燥(MgSO4)并蒸發(fā)有機層。通過硅膠柱色譜(洗脫液CH2Cl2/2-丙醇99/1)純化。收集純化組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率21g 3-乙基-6-喹啉羧酸乙酯(中間體16)(45％)。
b)在0℃，N2下將THF(270ml)中的中間體16(0.098mol)加入至LiAlH4(0.098mol)的THF溶液中。添加完成，加入水(10ml)。沉淀過濾，用CH2Cl2洗滌。干燥(MgSO4)有機層，過濾并蒸發(fā)。產(chǎn)物不需進(jìn)一步純化即可使用。產(chǎn)率16.71g 3-甲基-6-喹啉甲醇(中間體17)。
c)將MnO2(0.237mol)加入至中間體17(0.096mol)的CH2Cl2(200ml)溶液中，在室溫下攪拌混合物12個小時?；旌衔锿ㄟ^硅藻土過濾，濾液再次與MnO2(20g)一起攪拌12個小時。再次加入MnO2(10g)。攪拌混合物12個小時。混合物通過硅藻土過濾并蒸發(fā)。產(chǎn)物不需進(jìn)一步純化即可使用。產(chǎn)率11.71g 3-甲基-6-喹啉甲醛(71％)(中間體18)。
d)在10℃下將溴環(huán)己烷(0.14mol)的1，1′-氧二乙烷(1，1′-oxybisethane)(50ml)和Mg屑(50ml)溶液加入至1，1′-氧二乙烷(10ml)中THF(0.14mol)的混合物中。在5℃下小心加入中間體18(0.07mol)的Mg屑(100ml)溶液中，將混合物倒入冰水中，用EtOAc萃取。產(chǎn)率11.34g(±)-α-環(huán)己基3-甲基-6-喹啉甲醇(63％)(中間體19)。
實施例A10制備 (中間體20)在80℃下，攪拌1，4-二氧雜環(huán)己烷(5ml)中的化合物(5)(0.001507mol)，三丁基(1-乙氧乙烯基)氫化錫(0.00226mol)和Pd(PPh3)4(0.000151mol)的混合物3個小時。加入水?；旌衔镉肊tOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化。產(chǎn)率1.4g中間體20。
實施例A11制備 (中間體21)在室溫下，攪拌NaOH 3N(5ml)和iPrOHO(1.7ml)中的化合物(45)(依照B6制備)(0.00125mol)的混合物過夜，然后倒入H2O中，用HCl 3N酸化并用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)溶劑。用乙醚吸收殘留物。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.26g中間體21(56％).(mp.232℃)。
實施例A12a.制備 (中間體22) (中間體23)在80℃下攪拌NaOH3N(500ml)中5-溴-1H-吲哚-2，3-二酮(0.221mol)的混合物30分鐘，回至室溫，加入2-戊酮(0.221mol)?；旌衔飻嚢璨⒒亓?小時30分鐘，用AcOH酸化直至pH＝5。沉淀過濾，水洗，干燥。得到52.3g中間體22和中間體23(總產(chǎn)率80％)。
b.制備 (中間體24) (中間體25)在-78℃，N2流中，滴加nBuLi 1.6M(0.0816mol)至中間體22(0.034mol)和中間體23(0.034mol)的THF(300ml)混懸液中。在-78℃下攪拌混合物30分鐘。滴加nBuLi 1.6M(0.0816mol)。攪拌混合物1個小時。緩慢加入THF(250ml)中的中間體9(0.102mol)混合物。攪拌混合物從-78℃至-20℃，倒入H2O/HCl 3N中，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，蒸發(fā)溶劑直至干燥。產(chǎn)率20.89g中間體24和中間體25化合物(86％)。
實施例A13a.制備 (中間體26)在室溫下，將4-氨基-3-甲氧苯甲酸(0.054mol)分批加入至3-氯-2-乙基-2-丁烯醛(0.065mol)的AcOH(100ml)溶液中。混合物攪拌并回流8個小時，蒸發(fā)至干燥。殘留物用CH2Cl2吸收，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從2-丙酮中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率2.5g中間體26(18％)。
b.制備 (中間體27)在室溫下，將CDI(0.012mol)加入至中間體26(0.011mol)的CH2Cl2(30ml)溶液中。在室溫下攪拌混合物1個小時。加入甲氧氨基甲烷(0.012mol)，在室溫下攪拌混合物8個小時。加入H2O。沉淀過濾。用CH2Cl2萃取濾液。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.95g中間體27(31％)(mp.148℃)。
實施例A14制備 (中間體28)在室溫下，將4-溴苯胺(0.034mol)加入至3-氯-2-乙基-2-丁烯醛(0.041mol)的AcOH(60ml)溶液中?；旌衔飻嚢璨⒒亓?個小時，回至室溫，蒸發(fā)至干燥。產(chǎn)物從EtOAc中結(jié)晶。沉淀過濾，以K2CO310％洗滌，在CH2Cl2中吸收。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率4,6g中間體28(54％)。
實施例A15a.制備 (中間體29)在5℃下，將KOH(0.326mol)的H2O(150ml)溶液緩慢加入至1，3-環(huán)己二酮(0.268mol)的H2O(150ml)溶液中。溫度不必達(dá)到12℃。逐步加入KI(2g)和2-溴-1-(4-硝基苯基)乙酮(0.294mol)。在室溫下攪拌混合物48個小時。沉淀過濾，水洗后以乙醚洗滌，干燥。產(chǎn)率63g(85％)。
部分組分(1g)從EtOH中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.5g中間體29(42％)(mp.100℃)。
b.制備 (中間體30)在室溫下，攪拌H2SO4(40ml)中的中間體29(0.145mol)混合物1小時，倒入冰中，以NH4OH堿化，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從EtOH中結(jié)晶，沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率31g(58％)。部分組分(1g)從EtOH中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.7g中間體30(58％)(mp.200℃)。
c.制備 (中間體31)在室溫，3bar壓力下，將EtOH(100ml)中的中間體30(0.039mol)，蘭尼鎳(10g)混合物氫化1小時?；旌衔锿ㄟ^硅藻土過濾，用CH2Cl2洗滌。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(9.5g)從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率4.6g(52％)。蒸發(fā)濾液。殘留物(2.7g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH；99/1；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率1.6gF1和1.2g F2。F2從EtOH中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.24g中間體31(2％)(mp.202℃)。
d.制備 (中間體32)在室溫下，將中間體30(0.02mol)加入至3-氯-2-乙基-2-丁烯醛(0.04mol)的AcOH(50ml)溶液中?；旌衔飻嚢璨⒒亓?個小時。蒸發(fā)溶劑直至干燥。殘留物從EtOAc中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。殘留物用CH2Cl2吸收。混合物以K2CO310％堿化，用CH2Cl2中萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從EtOH中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率2.5g中間體32(40％)。
實施例A16制備 (中間體33)在室溫，3bar壓力下，將EtOH(200ml)中的2-(4-硝基苯基)-1-苯乙烯(0.083mol)，蘭尼鎳(20g)混合物氫化1小時，然后通過硅藻土過濾，用CH2Cl2/CH3OH洗滌并干燥。產(chǎn)率17.5g中間體33(97％)。
實施例A17a.制備 (中間體34)在5℃下滴加DMF(12.4ml)至POCl3(0.7536mol)中。加入4′-溴-5-氯valeranilide(0.1032mol)，在75℃下攪拌混合物6個小時，在室溫下冷卻，倒入冰水中。過濾不溶物，水洗并干燥。產(chǎn)率25.7g中間體34(78％)。
b.制備 (中間體35)HCl 6N(250ml)中的中間體34(0.094mol)的混合物攪拌并回流2天，冷卻，倒入水(100ml)中，用NH4OH(濃縮的)中和。過濾不溶物，水洗后以EtOH洗滌。產(chǎn)率19g。蒸發(fā)濾液。殘留物(9.4g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH 99.25/0.75；15-35μm)純化。收集一種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率8g中間體35(32％)。
B.非放射性化合物的制備實施例B1制備 (化合物306)在5℃下將POCl3(0.024mol)緩慢加入到DMF(0.024mol)中。在室溫下攪拌混合物30分鐘，然后冷卻至5℃。緩慢加入3-氧代-丁酸乙酯(0.024mol)。在室溫下攪拌混合物30分鐘。逐漸加入1-(4-氨基苯基)-2-苯乙酮(0.024mol)。在90℃下攪拌混合物3個小時，溶解于CH2Cl2中。加入冰水。混合物用NH4OH堿化，用CH2Cl2中萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從2-丙酮/乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.9g化合物306(11％)(mp.136℃)。
實施例B2制備 (化合物2)在室溫下將KMnO4(10g)逐漸加入到 (按照實施例A7.e制備)(0.022mol)的三(二氧雜-3，6-庚基)胺(1ml)和CH2Cl2(100ml)溶液中。在室溫下攪拌混合物8個小時，通過硅藻土過濾，用CH2Cl2洗滌并干燥。殘留物(6g，100％)從乙醚/石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率2g化合物(2)(33％)；mp.82℃。
實施例B3
a)制備 (化合物3)在-70℃下將nBuLi 1.6M(0.07mol)緩慢加入到中間體(5)(0.058mol)的THF(150ml)的溶液中。在-70℃下攪拌混合物30分鐘。緩慢加入2，3-二氫-1H-茚-2-腈(0.07mol)的THF(100ml)溶液。在-70℃下攪拌混合物1小時，緩慢回至室溫，用H2O水解(hydrolized)，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(22g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/環(huán)己烷80/20-100；15-35μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。第二組分從2-丙酮/乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.11g化合物(3)。濃縮濾液。產(chǎn)率0.55g化合物(3)；mp.145℃。
b)制備 和 順(化合物4)反(化合物5)在-70℃下將nBuLi 1.6M(0.022mo )緩慢加入到中間體(5)(0.018mol)的THF(50ml)的溶液中。在-70℃下攪拌混合物1小時，回至-40℃，然后冷卻至-70℃。緩慢加入中間體7(0.018mol)的THF(40ml)溶液。在-70℃下攪拌混合物1小時，然后回至-20℃，用H2O水解，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(6.5g)通過硅膠色譜柱(洗脫液甲苯/EtOAc90/10；15-40μm)純化。收集兩種組分(F1和F2)，蒸發(fā)溶劑。F1(2.4g)從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率1.8g化合物(4)(29％)；mp.123℃。F2(0.9g)從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.2g化合物(5)(3％)；mp.120℃。
c)制備 和 順 反(化合物7) (化合物8)在-78℃，N2流下將nBuLi 1.6M(0.107mol)滴加到中間體(6)(0.089mol)的THF混合物中。在-78℃攪拌混合物1小時。在78℃，N2流下加入中間體7(150ml)的混合物。在-78℃攪拌混合物2個小時，回至0℃，倒入H2O中，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(31g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc85/15；20-45μm)純化。收集兩種純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率11g化合物(7)(38％)和8.2g化合物(8)(28％)。
d)制備 (化合物503)將氯甲苯(chloromethylbenzeen)(0.0069mol)的乙醚(8ml)溶液緩慢加入至Mg(0.0069mol)的少量乙醚混懸液中。在室溫下攪拌混合物30分鐘(Mg的差異)，然后冷卻至5℃。緩慢加入中間體27(0.0027mol)的THF(8ml)溶液。在5℃下攪拌混合物15分鐘，然后在室溫下攪拌2個小時，倒入水中，通過硅藻土過濾。用EtOAc洗滌沉淀。濾液用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1g)通過kromasil色譜柱(洗脫液CH2Cl2100-CH2Cl2/CH3OH 99/1；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.5g，56％)從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.14g化合物503(15％)。
實施例B4修改末端基團的實施例
反a)制備(化合物156)在60℃下，攪拌HCl 3N(60ml)和THF(60ml)中 反 (化合物8)(依照實施例B3.c制備)(0.018mol)的混合物過夜。混合物用K2CO310％溶液堿化，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率4.6g化合物(156)(82％)。
順制備 (化合物9)攪拌并回流HCl 3N(40ml)和THF(40ml)中 順 (化合物7)(依照實施例B3.c制備)(0.0122mol)的混合物過夜，倒入水中，用K2CO310％溶液堿化，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 40/60；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率2g化合物(9)(52％)；mp.226℃。
c)制備 順(化合物10) 和 (反)(化合物11)
在140℃下，攪拌DMF(5ml)中化合物(4)(0.0015mol)，2-甲氧基乙胺(0.003mol)和K2CO3(0.003mol)的混合物48個小時。加入H2O?；旌衔镉肊tOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 60/40；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。兩種組分分別從戊烷中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.05g化合物(10)(9％；mp.115℃)和0.057g化合物(11)(10％；mp.107℃)。
d)制備 順(化合物12)和 (反)(化合物13)在120℃下，攪拌2-(甲基硫)乙胺(2ml)中化合物(4)(0.0015mol)的混合物8個小時。加入K2CO310％?；旌衔镉肅H2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(2.2g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 70/30；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。第一種組分從乙醚/石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.08g化合物(12)(14％)；mp.120℃。第二種組分從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.18g化合物(13)(31％)；mp.125℃。
e)制備 順(化合物14)在100℃下，攪拌N，N-二乙基乙胺(5ml)中化合物(4)(0.001507mol)，乙炔基三甲基硅烷(0.003013mol)，CuI(0.000151mol)和Pd(PPh3)4(0.000151mol)的混合物24個小時。加入水?；旌衔锿ㄟ^硅藻土過濾，用EtOAc洗滌，濾液用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.3g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 85/15；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物從戊烷中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.11g化合物(14)(18％)；mp.114℃。
f)制備 (化合物15)順在室溫下，攪拌乙酸(50ml)中化合物(0.013mol)和KF(0.038mol)的混合物2個小時。加入H2O，混合物用乙醚萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(4.4g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/Et0Ac 70/30；15-40μm)純化。收集一種組分，蒸發(fā)溶劑。該組分(3g，73％)從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率2.45g化合物(15)(60％)；mp.132℃。
g)制備 順(化合物15)和反(化合物17)在室溫下，攪拌KOH[1M，H20](10ml)和甲醇(30ml)中 順(化合物14)和反(化合物16)(按照實施例B.7.a制備)的混合物(0.0056mol)1小時，倒入水中，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(2.2g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 85/15至70/30；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。第一種組分從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.2g化合物(15)(11％)；mp.133℃。第二種組分從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.3g化合物(17)(16％)；mp.128℃。
h)制備 (化合物18)在100℃下，攪拌N，N-二乙基乙胺(5ml)中化合物(4)(0.001205mol)，2-丙炔基-1-醇(0.002411mol)，Pd(PPh3)4(0.000121mol)和CuI(0.000121mol)的混合物2個小時。加入水?；旌衔锿ㄟ^硅藻土過濾，用EtOAc洗滌，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.7g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH98/2；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物從石油醚和乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.1g化合物(18)(23％)；mp.113℃。
i)制備 順(化合物19)和(反)(化合物20)在140℃下，攪拌DMSO(20ml)中化合物(4)(0.006027mol)和KF(0.024108mol)的混合物。蒸發(fā)溶劑直至干燥。殘留物在水和乙醚中固化?；旌衔镉靡颐演腿?。分離有機相，用乙醚洗滌，用NaCl飽和溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.7g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 85/15；15-40μm)純化。收集三種組分，蒸發(fā)溶劑。第一種組分從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.21g化合物(19)(11％)；mp.92℃。
第二種組分從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.33g化合物(20)(17％)；mp.114℃。
j)制備 (化合物21)順攪拌并回流CH3CN(10ml)中化合物(4)(0.003013mol)，乙酰氯(0.003315mol)和碘化鈉(0.006027mol)的混合物1小時。加入K2CO310％?；旌衔镉肅H2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 80/20；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。第一種組分從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.12g化合物(21)；mp.110℃。
k)制備 (化合物22)順在100℃下，攪拌N，N-二乙基乙胺(5ml)中化合物(21)(0.000898mol)，三甲基硅烷腈(0.001347mol)和Pd(PPh3)4(0.00009mol)的混合物2個小時。加入水?；旌衔镉肊tOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.4g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 80/20；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.18g，62％)從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.13g化合物(22)(45％)；mp.138℃。
l)制備
順(化合物23) (反)(化合物24) 順(化合物25) (反)(化合物26)在90℃，CO 5bar壓力下，攪拌CO(氣體)和甲醇(40ml)中化合物(4)(0.00603mol)，Pd(OAc)2(0.000603mol)，PPh3(0.00904mol)和K2CO3(0.012054mol)的混合物8個小時。加入水?；旌衔镉肊tOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(6g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH 100/0至98/2；15-35μm)純化。收集四種組分(F1-F4)，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.13g(順)F1；0.02gF2(順，化合物25)；0.055g F3(反，3％)和0.11g F4(反；化合物26)。F1從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.03g化合物(23)(1％)；mp.91℃。F3從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.035g化合物(24)(1％)；mp.99℃。
m)制備 (化合物25)順在60℃下，攪拌乙酸(30ml)中化合物(4)(0.009mol)和Zn(0.027mol)的混合物4個小時，通過硅藻土過濾，用CH2Cl2洗滌，蒸發(fā)直至干燥，溶解于CH2Cl2中，用K2CO310％洗滌。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(4g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 75/25；15-40μm)純化。收集一種組分，蒸發(fā)溶劑。該組分(1g 37％)從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率化合物(25)；mp.88℃。
n)制備 (化合物27)順攪拌并回流甲苯(5ml)中化合物(4)(0.001502mol)，Sn(CH3)4(0.003004mol)和Pd(PPh3)4(0.00015mol)的混合物3個小時。加入K2CO310％?；旌衔镉肊tOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.7g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc85/15；15-40μm)純化。收集兩種組分(F1和F2)，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.27g(F1，原料)和0.14g(F2)。
F2從戊烷和石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.08g化合物(27)(17％)；mp.110℃。
o)制備 (化合物28)順在80℃下，攪拌二氧雜環(huán)己烷(5ml)中化合物(4)(0.001507mol)，三丁基乙烯基氫化錫(0.002260mol)和Pd(PPh3)4(0.000151mol)的混合物8個小時。加入水?；旌衔锿ㄟ^硅藻土干燥，用EtOAc洗滌，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.65g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 90/10；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.07g化合物(28)(14％)；mp.108℃。
p)制備 (化合物29)反在80℃下，攪拌二氧雜環(huán)己烷(5ml)中化合物(5)(0.001507mol)，三苯基(苯甲基)氫化錫(0.002260mol)和Pd(PPh3)4(0.000151mol)的混合物8個小時。加入水。混合物用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.4g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/EtOAc 96/4；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.38g)從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.16g化合物(29)(28％)；mp.112℃。
q)制備 (化合物30)順在80℃下，攪拌二氧雜環(huán)己烷(5ml)中化合物(4)(0.001507mol)，三丁基-2-噻吩基氫化錫(0.002260mol)和Pd(PPh3)4(0.0001507mol)的混合物8個小時。加入K2CO310％?；旌衔镉肊tOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.7g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 85/15；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.65g)從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.35g化合物(30)(61％)；mp.142℃。
r)制備 (化合物31)順攪拌并回流化合物(4)(0.0015mol)，3-噻吩基硼酸(0.00226mol)，Pd(PPh3)4(0.00015mol)和二氧雜環(huán)己烷(5ml)的混合物24個小時。加入K2CO310％?；旌衔镉肊tOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.8g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 80/20；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.4g，70％)從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.39g化合物(31)(68％)；mp.113℃。
s)制備 (化合物32)順在100℃，CO 5bar壓力下，攪拌Et3N(2ml)和甲苯(10ml)中化合物(4)(0.003mol)，甘氨酸甲酯單鹽酸鹽(0.0066mol)和Pd(PPh)4(0.0003mol)的混合物8個小時，通過硅藻土過濾，用CH2Cl2洗滌，蒸發(fā)。殘留物(2g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc80/20；75-35μm)純化。收集一種組分，蒸發(fā)溶劑。該組分(1g 80％)從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.46g化合物(32)(37％)。
t)制備 順(化合物33) (反)(化合物34)攪拌并回流1-丁醇(15ml)中化合物(4)(0.003mol)和肼羧酸酐(hydrazinecarboxaldehyde)(0.0045mol)的混合物過夜，倒入水中，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 95/5/0.1；15-40μm)純化。收集兩種組分(F1和F2)，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.3g F1和0.3g F2。
F1從CH3CN和乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.102g化合物(33)；mp.224℃。
F2從CH3CN和乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.2g化合物(34)；mp.185℃。
u)制備 (化合物35)順在140℃下，攪拌DMF(50ml)中化合物4(0.015mol)和NaN3(0.045mol)的混合物2個小時。加入K2CO310％，混合物用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(6g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 60/40；15-40μm)純化。收集第一種組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率1.26g化合物(35)(24％)；mp.160℃。
v)制備 順 反(化合物36) (化合物37)攪拌并回流乙醇(30ml)中化合物(4)(0.009mol)和硫脲(0.0099mol)的混合物12個小時，緩慢加入KOH(0.0149mol)的H2O(5ml)溶液。混合物攪拌并回流1小時，倒入水中，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 70/30；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率1.1g F1(37％)和0.4g F2(13％)。F1從2-丙酮中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。得到化合物(36)。F2從2-丙酮中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。得到化合物(37)。
w)制備 順 反(化合物38)(化合物39)在室溫下，將CH3I(0.0034mol)緩慢加入到化合物(36)(0.0015mol)，化合物(37)(0.0015mol)和K2CO3(0.0034mol)的丙酮(15ml)溶液中。在室溫下攪拌混合物8個小時。加入水，混合物用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.2g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 85/15；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.6g F1(57％)和0.18g F2(17％)。F1從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.28g化合物(38)(27％)。F2從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.065g化合物(39)(6％)。
x)制備 (化合物40)順攪拌并回流HCl 3N(5ml)和THF(5ml)中按照實施例B3.B制備的 化合物(41)(0.0014mol)的混合物1個周末，然后倒入H2O中，用K2CO3堿化，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.5gF。該組分從2-丙酮中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.35g化合物(40)(74％)。
y)制備 (化合物188)在200℃下，攪拌并回流化合物(5)(0.045mol)，乙酰胺(0.90013mol)和K2CO3(0.225mol)的混合物2個小時，冷卻至室溫，倒入H2O/CH2Cl2中；用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑直至干燥。殘留物(14.4g)從CH30H中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。蒸發(fā)濾液。殘留物(11.27g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.1；15-35μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率4.2g化合物(188)(65％)。
z)制備 (化合物248)在室溫下，攪拌CH2Cl2(2ml)中化合物(188)(0.00032mol)，苯甲酸(1.5當(dāng)量，0.00048mol)，1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺。HCI(1∶1)(1.5當(dāng)量，0.00048mol)，N-羥基苯并三唑(1.5當(dāng)量，0.00048mol)和Et3N(1當(dāng)量，0.00032mol)的混合物15個小時。蒸發(fā)溶劑。殘留物通過HPLC純化，收集產(chǎn)品組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.066g化合物(205)(49.50％)。
aa)制備 (化合物6)反在室溫下，攪拌HCl 3N(10ml)和THF(10mol)中中間體20(0.001507mol)的混合物8個小時，用K2CO3堿化，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.2g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 85/15；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物(0.4g)從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.3g化合物(6)(58％)；mp.108℃。
ab)制備 (化合物419)順攪拌并回流CH3OH(25ml)中化合物213(按照B4制備)(0.00305mol)和CH3ONa(在CH3OH中30％)(0.00916mol)的混合物15個小時，然后冷卻至室溫，倒入H2O中，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑直至干燥。殘留物(1.1g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 40/60；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.3g F1和0.5g F2(50％)。F2從乙醚/石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.26g。F1從戊烷中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.19g。該組分通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH；98/2；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.1g。該組分通過kromasil色譜柱(洗脫液CH3OH/H2O；70/30)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.09g。(9％)。該組分從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.08g化合物419(8％)。
實施例B5制備 順(化合物42)(反)(化合物43)
在5℃，N2流下，將碘甲烷(0.00456mol)加入到THF(30ml)中化合物(9)(0.0019mol)，化合物(8)(0.0019mol)和tBuOK(0.00456mol)的混合物中。在室溫下攪拌混合物過夜，倒入H2O中，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 65/35；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.35g化合物(42)(30％；mp.125℃)和0.35g化合物(43)(30％；mp.116℃)。
實施例B6a)制備 順(化合物44)(反)(化合物45)在0℃，N2流下，將NaH 60％(0.01068mol)加入到化合物(8)和化合物(9)(0.0089mol)的混合物中。攪拌混合物30分鐘。在0℃下加入溴乙酸乙酯(0.01068mol)。在室溫下攪拌混合物1小時，用水水解，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 60/40；15-40μm)純化。收集期望的組分(F1-F4)，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.11g F1；0.13g F2；0.75g F3和0.8g F4。
F3從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率化合物(44)；mp.152℃。
F4從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率化合物(45)；mp.147℃。
b)制備 順(化合物46)(反)(化合物47)在0℃，N2流下，將溴甲基苯(0.007mol)滴加到化合物(8)和化合物(9)(0.0064mol)以及NaH 60％(0.007mol)的DMF(40ml)溶液中。在室溫下攪拌混合物1個小時，用水水解，用EtOAc萃取。分離有機相，水洗，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 70/30；15-40μm)純化。收集期望的組分(F1-F4)，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.15g F1，0.1g F2，0.6g F3(23％)和0.8g F4。
F3從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.13g化合物(46)；mp.137℃。
F4從DIPE和石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率化合物(47)；mp.130℃。
實施例B7a)在0℃下將3-氯苯過碳酸(0.088mol)加入到化合物(48)(按照實施例B2制備)(0.044mol)的CH2Cl2(200ml)溶液中，在室溫下攪拌混合物12個小時?；旌衔镉肒2CO310％洗滌。干燥有機相(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從(C2H5)2O中結(jié)晶。產(chǎn)率8.2g環(huán)己基(3-甲基-6-喹啉基)甲酮，1-氧化物(化合物49)(69％)。
b)將4-甲基苯磺酰氯(0.043mol)加入到化合物(49)(0.028mol)的K2CO3(400ml)和CH2Cl2(400ml)溶液中，在室溫下攪拌混合物1個小時?；旌衔镉肅H2Cl2萃取。干燥有機相(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從(C2H5)2O中結(jié)晶。產(chǎn)率6.64g6-(環(huán)己基羰基)-3-甲基-2(1H)-喹啉酮(化合物50)(85％)；mp.256.1℃。
實施例B8
a)制備 [1α(A)，4α](化合物51) [1α(B)，4α](化合物52)攪拌并回流乙醇(100ml)中化合物(7)(0.0229mol)，羥胺(0.0252mol)和N，N-二乙基乙胺(0.0252mol)的混合物6個小時，倒入水中，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物從CH3CN中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/EtOAc 80/20；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率2.8g化合物(51)(36％；mp.133℃)和3g化合物(52)(38％；mp.142℃)。
b)制備 (化合物53)[1α(Z)，4α]在室溫下將肼(0.41mol)加入到化合物(7)(0.015mol)的乙醇(75ml)溶液中?；旌衔飻嚢璨⒒亓?夜，倒入水中，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 98/2/0.1)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。殘留物從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.8g化合物(53)(15％)；mp.110℃。
實施例B9
制備 (化合物520)用于化合物400，401，402，403，404和405的步驟。在室溫下，攪拌CH2Cl2(2ml)中中間體21(按照A11制備)(0.000269mol)，鹽酸金剛胺(0.000404mol；1.5當(dāng)量)，N′-(乙基carbonimidoyl)-N，N-二甲基-1，3-丙二胺鹽酸鹽(0.000404mol；1.5當(dāng)量)，1-羥基-1H-苯并三唑(0.000404mol；1.5當(dāng)量)和Et3N(0.000269mol)的混合物12個小時。蒸發(fā)溶劑。殘留物通過HPLC純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.063g化合物520(46.37％)。
實施例B10制備 (化合物233)順攪拌并回流EtOH(380ml)和濃H2SO4(19ml)中中間體27(0.0026mol)和中間體26(0.0026mol)的混合物15個小時，然后冷卻至室溫，倒入冰水中，用K2CO3堿化，用EtOAc萃取。分離有機相，水洗，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(17.9g)通過硅膠色譜柱(洗脫液環(huán)己烷/EtOAc 80/20；15-35μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.85g F1，1.1gF2和11.5gF3。F1和F2分別各自從石油醚結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.34g化合物233。
實施例B11
制備 (化合物511)攪拌并回流HCl(3N)(20ml)和THF(20ml)中化合物22(按照B4制備)(0.004mol)的混合物8個小時，倒入冰中，用NH4OH堿化，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.2g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH/NH4OH；93/7/0.5；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.5gF1(41％)和0.4gF2。F1從石油醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.17g化合物511(14％)。
實施例B12制備 (化合物514)攪拌并回流EtOH(15ml)中化合物524(按照B9a制備)(0.0018mol)和KOH 85％(0.0094mol)的混合物24小時，倒入H2O中，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/EtOAc 80/20；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.35g F1(64％)和0.17g(SM)。F1從乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.33g化合物514(60％)(mp.185℃)。
實施例B13制備 (化合物515)
攪拌并回流二氧雜環(huán)己烷(25ml)和Na2CO3[2](25ml)中中間體28(0.019mol)，2-苯并呋喃硼酸(0.028mol)，Pd(PPh3)4(0.001mol)和BHT(少量)的混合物8小時，用EtOAc萃取。用NH4OH堿化含水層，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(3.6 g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH 99/1；15-40μm)純化。收集純組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率1.8g(33％)。該組分從2-丙酮/乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.39g化合物515(7％)(mp.134℃)。
實施例B14制備 (化合物526)在室溫下，將三乙基硅烷(0.0012mol)緩慢加入到中間體32(0.004mol)的CF3COOH(5ml)和AcOH(10ml)的溶液中。在N2流下逐漸加入NaBH4(0.0012mol)。在室溫下攪拌混合物8小時，倒入冰中，用K2CO3堿化，用CH2Cl2萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(1.2g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/CH3OH99/1；15-40μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.5g F1(43％)和0.4g F2。F1溶解于iPrOH中。加入HCl/iPrOH(1當(dāng)量)。沉淀過濾并干燥；產(chǎn)率0.32g化合物526(mp.248℃)。
實施例B15制備 (化合物471)攪拌并回流AcOH(200ml)中中間體33(0.082mol)和3-氯-2-乙基-2-丁烯醛(0.098mol)的混合物8小時。蒸發(fā)溶劑直至干燥。殘留物溶解于CH2Cl2中，用K2CO3洗滌。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑。殘留物(27g)通過硅膠色譜柱(洗脫液CH2Cl2/EtOAc 95/5至92/8；15-35μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率0.7gF1和5.3g F2。F1從2-丙酮/乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率0.25g化合物471(2％)(mp.140℃)。
實施例B16制備 (化合物498)在-78℃，N2流下，將nBuLi(0.0417mol)滴加至中間體35(按照A17.B制備)(0.0379mol)的THF(200ml)溶液中。攪拌混合物30分鐘。在-78℃下滴加4-溴-N-甲氧基-N-甲基苯基乙酰胺(0.0568mol)的THF(100ml)溶液。在-78℃至0℃下攪拌混合物，倒入H2O中，用EtOAc萃取。分離有機相，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)溶劑至干燥。殘留物(20.9g)通過硅膠色譜柱(洗脫液甲苯/EtOAc 60/40至50/50；15-35μm)純化。收集兩種組分，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)率4g組分1和4g組分2(28％)。組分2中乙醚中結(jié)晶。沉淀過濾并干燥。產(chǎn)率1g化合物528(m.p.195℃)。
表1-8列出了按照上述實施例制備的式(I-A)和(I-B)化合物表1











表2
圖5顯示的是本發(fā)明的各數(shù)據(jù)模塊之間建立關(guān)聯(lián)關(guān)系流程圖。系統(tǒng)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)關(guān)系采取會計貸記方式，對每筆金額的流向在數(shù)據(jù)庫中均予以記載。
各數(shù)據(jù)模塊之間關(guān)聯(lián)關(guān)系建立如以下表1～9所示訂貨合同主要數(shù)據(jù)見表1
發(fā)票主要數(shù)據(jù)見表2
發(fā)票與訂貨合同關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)建立見表3，該表通過選擇方式產(chǎn)生







表3

表4

表5
表6


表7




表8
C.放射性標(biāo)記化合物的制備C.1[3H]-標(biāo)記的化合物 化合物498化合物528將精確量的鈀/碳(10％，0.872mg)加入到化合物498(I，0.919mg，2.4μmol)和三乙基胺(0.92μl，6.6μmol)的鈉干燥的四氫呋喃(175μl)溶液中。反應(yīng)燒瓶與氚化多支管系統(tǒng)相連，小心移除反應(yīng)混合物中的氣體。鈾氚化物產(chǎn)生氚氣(1017mbar壓力下19.5Ci)，在室溫下使其進(jìn)入攪拌的反應(yīng)混合物中。30分鐘后，用液氮冷凍反應(yīng)混合物，過量的氚氣用鈾海綿再捕獲。低壓凍干反應(yīng)混合物中的溶劑。為移除不穩(wěn)定的氚，引入甲醇(100μl)并低壓凍干。該步驟重復(fù)兩次以上。殘留物在乙醇中吸收，通過GHP Acrodisk 13mm注射器式濾器過濾，用乙醇減少至總?cè)萘?0.0ml。包含了在67％放射化學(xué)純度下由[3H]-化合物528(II)產(chǎn)生的71mCi放射性強度。從50.0ml中取出5.0ml，通過制備HPLC(Kromasil KR 100-10，柱規(guī)格4.6mm ID×300mm)。在265nm處進(jìn)行UV檢測。在2.0ml/min的流速下用水-甲醇-乙腈-二異丙胺(47∶26.5∶26.5∶0.2；v/v/v/v)進(jìn)行等度洗脫。30℃，真空條件下將包含組分的產(chǎn)物組合濃縮。殘留物溶解于乙醇(5.0ml)中，再濃縮。該步驟重復(fù)兩次以上。剩余的殘留物最終溶解于乙醇(20.0ml)，保存。該批產(chǎn)品包含[3H]-化合物528(II)，在純度＞98％下總放射性強度為3.83mCi，比放射性約為25Ci/mmol。
D.藥理學(xué)實驗例D1.CHO細(xì)胞中克隆大鼠mGlu1受體的信號傳導(dǎo)將用于表達(dá)mGlu1受體的CHO細(xì)胞置于預(yù)涂布的黑色96-孔板上。次日，用熒光分析法評估本發(fā)明化合物對谷氨酸活化的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響。用氟-3AM裝載細(xì)胞，在室溫下于暗處孵化培養(yǎng)基1小時，洗滌細(xì)胞，加入本發(fā)明化合物至細(xì)胞20分鐘。此孵化期之后，使用熒光成像板讀數(shù)器(FLIPR，Molecular Devices Inc.)記錄每一孔的由谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+隨時間函數(shù)的增長。記錄相對熒光單位，從而得到四孔平均數(shù)據(jù)曲線。濃度-靈敏度曲線建立在試驗化合物的每一濃度的熒光峰值(1-90秒之間的最大信號)基礎(chǔ)上。pIC50值是試驗化合物對谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增長抑制率為50％時化合物濃度的負(fù)對數(shù)值。
本發(fā)明化合物顯示了pIC50值至少為5。
表1-8中的化合物顯示了pIC50值至少為6。
一組特殊的化合物顯示了pIC50值為7-8。該組化合物列于表9中。
表9
一組特殊的化合物顯示了pIC50值至少為8。該組化合物列于表10中。
表10




D2.與本發(fā)明[3H]-標(biāo)記的化合物的體外結(jié)合實驗此處使用的[3H]-標(biāo)記的化合物為化合物528，以下命名為[3H]化合物A，它是化合物432的氚標(biāo)記物。
在下一段落中將公開一項顯示本發(fā)明放射性標(biāo)記化合物用途的研究。
原料所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑從Invitrogen(Carlsbad，USA)獲得。谷氨酸從Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)獲得；[3H]使君子氨酸(29Ci/mmol)，[3H]Ro 48-8587(53Ci/mmol)，肌紅蛋白-[3H]-肌醇(22Ci/mmol)和[35S]GTPγS(1030Ci/mmol)從Amersham(Paisley，UK)獲得。[3H]MK-801(22.5Ci/mmol)和[3H]CGP39653(20-50Ci/mmol)從NEN(Zaventem，Belgium)獲得。GDP從BoehringerManheim(Basel，Switzerland)獲得，甘氨酸從BioRad(CA，USA)獲得。[3H]L689560(10-30Ci/mmol)，[3H]LY341495(34.61Ci/mmol)，[3H]MPEP(50.2Ci/mmol)，(S)-4C3HPG，(1S，3R)-ACPD，(S)-3，5-DHPG，(S)-4CPG，AIDA，MCPG，MPEP，CPCCOEt，L-SOP和L-使君子氨酸購自Tocris Cookson(Essex，UK)。BAY36-7620，NPS 2390和苯環(huán)利定是室內(nèi)合成。氟-3-AM和钚酸(pluronic acid)從Molecular Probes(Leiden，The Netherlands)獲得。丙磺舒，番木鱉鹼，D-絲氨酸和聚乙二醇辛基苯基醚購自Sigma-Aldrich(Steinheim，Germany)。其余試劑來自Merck(Darmstadt，Germany)。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)人類Glu1a受體的L929sA細(xì)胞按照Lavreysen等，Pharmacol.611244-1254，2002中描述的方法獲得，在添加了10％熱滅活透析的胎小牛血清，0.1mg/ml硫酸鏈霉素和100單位/ml青霉素的Glutamax-I介質(zhì)中培養(yǎng)。穩(wěn)定表達(dá)大鼠mGlu1a，-2，-3，-4，-5和-6受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞受贈于S.Nakanishi(東京大學(xué)，日本)，將其在DMEM培養(yǎng)基中與添加了10％熱滅活透析的胎小牛血清，0.4mM L-脯氨酸，0.2mg/ml硫酸鏈霉素和200單位/ml青霉素的Glutamax-I一起培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃，含有5％CO2的大氣中保存。
大鼠和人類mGlu1a受體表達(dá)細(xì)胞和大鼠mGlu5受體表達(dá)細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+應(yīng)答使用熒光成像板讀數(shù)器(FLIPR，Molecular Devices，CA，USA)測量人類Glu1a受體表達(dá)L929sA細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)，如Lavreysen等，Mol.Pharmacol.611244-1254，2002中所描述。同樣的方法可用于表達(dá)大鼠mGlu1a受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞。對大鼠mGlu5受體而言，在實驗前2天以30.000個細(xì)胞/孔接種細(xì)胞。
大鼠mGlula受體表達(dá)CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞中IP應(yīng)答按照Lavreysen等，Mol.Pharmacol.611244-1254，2002中的描述測量IP累積。簡而言之，在24孔板中以30.000個細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，并以2.5μCi/ml的肌紅蛋白-[3H]-肌醇標(biāo)記過夜。在實驗當(dāng)天，洗滌細(xì)胞，用10mM LiCl孵化10分鐘。用漸增濃度的[3H]化合物A孵化30分鐘后，加入1N HClO4，并4℃放置平板。在應(yīng)用離子交換色譜前加入KOH/磷酸鹽溶液和包含了30mMNa2B4O7.10H2O和3mM EDTA的溶液。
表達(dá)大鼠mGlu1a，-2，-3，-4，-5和-6受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞的膜制備在冰冷的磷酸鹽緩沖生理鹽水中洗滌融合細(xì)胞，在-20℃下保存直至膜制備。解凍后，細(xì)胞混懸于pH7.4的50mM Tris-HCl中，在23,500g，4℃下離心分離10分鐘，收集細(xì)胞。細(xì)胞溶解于pH7.4的10mM低滲Tris-HCl中。在30,000g，4℃下再次離心分離20分鐘之后，使用超回轉(zhuǎn)頭均化器(Ultra Turrax homogenizer)在pH7.4的50mM Tris-HCl中使丸均質(zhì)化。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，通過生物鐳蛋白分析法(Bio-Rad protein assay)測定蛋白濃度。GTPγS與表達(dá)大鼠mGlu1 2，-3，-4和-6受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞膜的結(jié)合將膜在冰上解凍，用包含100mM NaCl，3mM MgCl2，3μM GDP和10μg/ml皂角苷的pH7.4的10mM羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和10mM羥乙基哌嗪乙磺酸鹽稀釋。實驗化合物包含10μg膜蛋白，將其在37℃下用化合物或緩沖液預(yù)孵化30分鐘。然后，加入谷氨酸，在37℃下進(jìn)一步孵化實驗化合物30分鐘。在37℃下30分鐘內(nèi)加入[35S]GTPγS至最終濃度為0.1nM。采用96孔Packard濾紙的Unifilter-96 GF/B濾板(Packard，Meriden，CT)速濾后終止反應(yīng)。過濾器用冰冷的pH7.4的10mM NaH2PO4/10mM Na2HPO4洗滌兩次。在Packard的微量培養(yǎng)板閃爍粒和Luminesence氣流計數(shù)器中記錄過濾器的放射性。
放射性配體與大鼠mGlu1a受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞膜的結(jié)合[3H]化合物A結(jié)合。解凍后，使用超回轉(zhuǎn)頭均化器(Ultra Turraxhomogenizer)將膜均質(zhì)化，混懸于冰冷的包含50mM Tris-Cl(pH7.4)，1.2mM MgCl2，2mM CaCl2的結(jié)合緩沖液中，除非該緩沖液中其余成分另有指明。在與20μg膜蛋白和10種濃度(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1，2，2.5，5和10nM)的放射性配體的表觀結(jié)合平衡(30分鐘孵化)下，進(jìn)行配體飽和實驗。在1μM化合物135存在下評估非特異性結(jié)合。使用手動的40孔多孔過濾器的GF/C玻璃纖維過濾器快速抽濾以停止孵化。為測量聯(lián)合動力學(xué)參數(shù)，在4℃，25℃或37℃，2.5nM[3H]化合物A存在下，孵化膜2，5，10，15，20，30，45，60，90或120分鐘，然后使用手動的40孔過濾器速濾后終止孵化。過濾前在4℃或25℃，2.5nM[3H]化合物A存在下，將1μM化合物135加入到膜預(yù)孵化30分鐘，從而測量分離動力學(xué)參數(shù)。將過濾器轉(zhuǎn)移到閃爍瓶中，加入Ultima-Gold MV后，在Packard閃爍計數(shù)器中讀取過濾器中放射性強度。對抑制實驗而言，在4℃下，含有10-20μg膜蛋白，適當(dāng)?shù)臐舛鹊膶嶒灮衔锖?.5nM[3H]化合物A的0.5ml體積中孵化實驗混合物30分鐘。非特異性結(jié)合如上定義。使用Unifilter-96 GF/C濾版和96孔Packard濾紙進(jìn)行過濾。加入微閃爍圖-O后，在Packard的微量培養(yǎng)板閃爍粒和Luminesence計數(shù)器中讀取過濾器的放射性強度。使君子酸結(jié)合。將解凍的膜均質(zhì)化，混懸于冰冷的結(jié)合緩沖液中。對飽和實驗而言，在25℃下30μg膜蛋白與10種濃度(1，2，5，10，20，40，60，90，120和150nM)的[3H]使君子酸孵化1小時。在1mM L-谷氨酸存在下測定非特異性結(jié)合。使用手動的40孔多孔過濾器的GF/C玻璃纖維過濾器速濾，分離聯(lián)合和單體放射性配體。對抑制實驗而言，在25℃下，30μg膜蛋白在含有適當(dāng)?shù)臐舛鹊膶嶒灮衔锖徒K濃度為10nM[3H]使君子酸的0.5ml體積中孵化1小時。使用Unifilter-96 GF/C濾版和96孔Packard濾紙進(jìn)行過濾。過濾器的放射性強度按如上讀取。
放射性配體與表達(dá)大鼠mGlu12，-3，-4，5-和-6受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞膜的結(jié)合解凍后，使用超回轉(zhuǎn)頭均化器(Ultra Turrax homogenizer)將膜均質(zhì)化，混懸于冰冷的包含50mM Tris-Cl(pH7.4)，1.2mM MgCl2，2mM CaCl2的結(jié)合緩沖液中。對[3H]化合物A結(jié)合而言，需使用20-160μg膜蛋白和終濃度為20nM的[3H]化合物A。如結(jié)論部分指出的，使用不同的空白試劑(blancs)來定義非特異性結(jié)合。孵化時間和溫度以及過濾如大鼠mGlu1a受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞膜所述。大鼠mGlu1 2，-3，-5和-6受體的表達(dá)通過[3H]LY341495(mGlu2，-3和-6)或[3H]MPEP(mGlu5)的特異性結(jié)合證實。對[3H]LY341495結(jié)合而言，需使用1nM(mGlu2和mGlu3)或10nM(mGlu6)[3H]LY341495。使用1mM谷氨酸測定非特異性結(jié)合。在4℃下孵化實驗化合物30分鐘(mGlu2和mGlu3)或60分鐘(mGlu6)。使用手動的40孔多孔過濾器的GF/C玻璃纖維過濾器(Whatman，England)過濾，停止孵化。對大鼠mGlu5受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞膜而言，顯示非特異性結(jié)合需使用10nM[3H]MPEP和10μM MPEP。在4℃下孵化30分鐘。使用40孔過濾單位的GF/C玻璃纖維過濾器(Whatman，England)分離聯(lián)合和單體放射性配體?；衔顰與大鼠腦膜的結(jié)合組織制備。斷頭處死雄性Wistar大鼠(～200g)。迅速移除大腦，立即解剖皮層，海馬組織，紋狀體和小腦。新鮮組織用超回轉(zhuǎn)頭在20體積的pH7.4的50mM Tris-HCI中均質(zhì)化，在23,500g下離心10分鐘。使用DUAL均化器均質(zhì)化后，通過在23,500g下離心10分鐘洗滌膜兩次。最終小丸混懸于10體積的pH7.4的50mMTris-HCl中，在-80℃下冷凍。
體外結(jié)合測定。解凍后，使用DUAL再次均質(zhì)化大鼠皮層，小腦，紋狀體和海馬組織中的膜，混懸于冰冷的包含pH7.4的50mM Tris-Cl，1.2mM MgCl2，2mM CaCl2的結(jié)合緩沖液中。在總體積0.5ml的含有2.5nM[3H]化合物A中進(jìn)行結(jié)合測定分析，膜可分量相應(yīng)的為40μg用于小腦膜，60μg用于海馬組織膜，80μg用于紋狀體膜或150μg用于皮層膜。按照總結(jié)合量與1μM化合物135存在下測定的結(jié)合量的差異計算特異性結(jié)合。4℃下孵化30分鐘后，洗滌標(biāo)記膜，通過使用40孔多孔過濾器的Whatman GF/C玻璃纖維過濾器迅速真空過濾采集，過濾器的放射性強度按如上讀取。Ro 48-8587，[3H]L689560，[3H]CGP39653和[3H]MK-801與大鼠腦膜的結(jié)合組織制備。斷頭處死雄性Wistar大鼠(～200g)。迅速移除大腦，解剖前腦。該組織用超回轉(zhuǎn)頭在20體積冰冷的H2O中均質(zhì)化，在48,000g下離心20分鐘。使用DUAL均化器均質(zhì)化后，通過在48,000g下離心10分鐘洗滌膜。然后將小丸混懸于20體積，pH7.4的含有0.04％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的50mMTris-HCl中，在48,000g下再次離心20分鐘。最終小丸在-80℃下冷凍。
體外結(jié)合測定。在實驗當(dāng)天，解凍小丸，洗滌，使用DUAL均化器在冰冷的pH7.4的50mM Tris-醋酸鹽中再次均質(zhì)化。不同放射性配體的測定條件如下。對[3H]Ro 48-8587和[3H]L689560而言，測定中膜的終濃度是20mg/ml(濕重)，對[3H]CGP39653和[3H]MK-801而言是10mg/ml(濕重)。使用的放射性配體濃度為2nM[3H]Ro 48-8587，2nM[3H]L689560，2nM[3H]CGP39653和3nM[3H]MK-801。1mM KSCN存在下用于[3H]Ro 48-8587的孵化，100μM番木鱉鹼用于[3H]L689560，1μM甘氨酸+1μM谷氨酸用于MK-801結(jié)合。在1mM谷氨酸存在下測定[3H]Ro 48-8587和[3H]L689560的非特異性結(jié)合。對[3H]CGP39653和[3H]MK-801結(jié)合而言，可分別用100μM D-絲氨酸或10μM苯環(huán)己哌啶測定非特異性結(jié)合。對[3H]Ro 48-8587，[3H]L689560，[3H]CGP39653和[3H]MK-801結(jié)合而言，各自的孵化為37℃下1小時，4℃下2小時，25℃下30分鐘和4℃下1小時。孵化后，使用40孔多孔過濾器分離聯(lián)合和單體放射性配體。過濾器的放射性強度按如上讀取?；衔顰的結(jié)合與腦部切片的放射性自顯影組織制備。斷頭處死雄性Wistar大鼠(200g)。立即從顱骨中移除腦部，在干燥冰冷的2-甲基丁醇(-40℃)中迅速冷凍。在-70℃下保存腦部直至切片。使用Leica C3050冷凍切片機(LeicaMicrosystems，Wetzlar，Germany)切成20微米厚的箭頭形切片，在SuperFrost Plus載玻片(Menzle-glaser，Germany)上融裱。在-70℃下保存切片直至使用。
受體放射性自顯影。解凍切片，在冷空氣流中干燥，室溫下在pH7.4的50mM Tris-Cl，1.2mM MgCl2，2mM CaCl2，0.1％BSA中預(yù)孵化(3×5分鐘)。然后在室溫下，在包含50mM Tris-Cl，1.2mMMgCl2，2mM CaCl2，0.1％BSA(pH7.4)和1.5nM[3H]化合物A的緩沖液中孵化切片60分鐘。通過在孵化緩沖液中加入1μM化合物135來測定非特異性結(jié)合。孵化后，在冰冷的包含50mM Tris-Cl，1.2mMMgCl2和2mM CaCl2的緩沖液中洗去過量的放射性配體，然后迅速浸泡于冷蒸餾水中。在冷空氣流中干燥切片，然后在室溫下[3H]暴露于Hyperfilm(Amersham，UK)中6星期。在Kodak D19手工顯影膠片，用Kodak Readymatic固定。一些切片在室溫下暴露于富士成像板(Fuji Imaging Plate)中2天，使用Fujix Bass 2000磷光成像儀掃描。
數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計使用GraphPad Prism程序(GraphPad Prism Software，Inc.，San Diego，CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用非線性回歸分析法分析飽和結(jié)合實驗。使用非線性回歸分析修正抑制曲線和一維競爭方程Y＝Bottom+((Top-Bottom)/1+10X-LgIC50)。使用Cheng-Prusoff方程Ki＝IC50/[1+([C]/KD)]計算Ki值，其中C是放射性配體的濃度，KD是放射性配體的解離常數(shù)(Cheng and Prusoff，Biochem.Pharmacol.22，3099-3108，1973)。使用Prism程序中一元指數(shù)聯(lián)合衰退方程得到聯(lián)合解離曲線，分別計算實測的開(kob)和關(guān)(koff)比率。通過從kob中扣除koff，用放射性配體濃度的區(qū)分計算kon。使用Student氏t測驗統(tǒng)計評價結(jié)合數(shù)據(jù)*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
使用鄧奈特氏檢驗和2元變量分析(化合物濃度和實驗作為因子)分析IP實驗的數(shù)據(jù)。
結(jié)論化合物A對mGlu1受體的選擇性和拮抗作用方式。
在表達(dá)大鼠mGlu1a受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞中，化合物A抑制谷氨酸誘導(dǎo)的[Ca2+]增長，IC50值為21.6±5.0nM(n＝4；

圖1A)，與最近公開的特異性mGlu1受體拮抗劑BAY 36-7620(IC50＝161±38nM，n＝3)相比，顯示出約8倍的效價，與CPCCOEt(IC50＝10.3±0.8μM，n＝3)相比，顯示出500倍的效價，兩者均用同樣的分析方法。對人類mGlu1a受體而言，化合物A的IC50值為10.4±4.7nM(n＝3)?；衔顰的測試濃度直至10μM，也不能夠抑制表達(dá)大鼠mGlu15受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞中的谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+。在重組大鼠mGlu2，-3，-4或-6受體中，對谷氨酸(30μM)誘導(dǎo)的[35S]GTPγS激活作用的抑制作用的IC50值約為30μM。在[35S]GTPγS分析中，化合物A直至濃度為30μM時也沒有顯示出對任何mGlu受體的拮抗活性。此外，研究了化合物A是否能作為這些mGlu受體的正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。為此，我們通過單獨添加谷氨酸或與10μM化合物A一起添加的方式完成了谷氨酸濃度-效應(yīng)曲線。重組大鼠mGlu2，-3，-4或-6受體的[35S]GTPγS分析表明谷氨酸的EC50沒有改變，谷氨酸Emax值沒有隨著化合物A的加入而增大。當(dāng)化合物A與谷氨酸一起加入時，表達(dá)大鼠mGlu15受體的細(xì)胞中谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+活動的IC50值和EC50值沒有改變(數(shù)據(jù)未給出)。同時這些數(shù)據(jù)不包括作用于mGlu2，-3，-4，-5和-6受體的促效劑，拮抗劑或正向變構(gòu)劑。使用[3H]Ro-488587，[3H]L689560，[3H]CGP39653和[3H]MK-801的大鼠前腦放射性配體結(jié)合的研究顯示了化合物A既沒有與AMPA受體結(jié)合，也沒有與甘氨酸，谷氨酸或NMDA受體通道孔位點結(jié)合(實驗直至濃度為10mM)。為分析化合物A如何抑制mGlu1a受體的谷氨酸激活，在沒有化合物A和存在化合物A的條件下比較Ca2+活動對谷氨酸的(圖1B)?；衔顰的存在不僅引起了谷氨酸濃度-效應(yīng)曲線向右移動，而且導(dǎo)致了促效劑誘發(fā)的最大效應(yīng)的戲劇性減少，顯示了化合物A的拮抗作用是非競爭性的。在100nM-1μM化合物A存在條件下觀察mGlu1a受體介導(dǎo)信號的完全抑制。為研究化合物A是否能作為反向激動劑，我們在化合物A存在條件下測量了包含CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞的大鼠mGlu1a受體內(nèi)基礎(chǔ)IP累積。圖1C表明了隨著化合物A濃度的增長，基礎(chǔ)IP產(chǎn)物有明顯的減少。降低1μM化合物A，基礎(chǔ)IP累積降低了24±4％，這種減少具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。當(dāng)使用100μM化合物A時，發(fā)現(xiàn)最大減少量為33±3％。這些數(shù)據(jù)表明化合物A的確能作為mGlu1a受體的反向激動劑。化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的特征4℃下，2.5nM[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜的特異性結(jié)合與膜蛋白的量成比例關(guān)系，經(jīng)分析在10-50μg膜蛋白之間線性增加(圖2)。使用1μM化合物135作為抑制劑確定非特異性結(jié)合。經(jīng)鑒定，化合物135是特異的mGlu1受體拮抗劑，抑制谷氨酸介導(dǎo)的[Ca2+]i活動的效價為7.2±1.2nM(n＝3)。經(jīng)分析，使用20μg蛋白的[3H]化合物A特異性結(jié)合是總結(jié)合量的92％；在典型分析條件下，總結(jié)合量和非特異性結(jié)合量分別在3,800和300范圍內(nèi)。
1.2mM MgCl2和2mM CaCl2的加入引起了特異性結(jié)合的少量增長(數(shù)據(jù)未給出)。進(jìn)一步添加NaCl(10-100-300mM)沒有影響作用。
pH6特異性結(jié)合降低22％，增加pH至10沒有影響作用(數(shù)據(jù)未給出)。
如原料和方法中的描述測定聯(lián)合動力學(xué)。
降低孵化溫度至4℃顯著增強特異性結(jié)合，然而在37℃下發(fā)現(xiàn)低結(jié)合(圖3)。[3H]化合物A與膜的聯(lián)合非常迅速。在4℃下，2分鐘孵化已經(jīng)達(dá)到了約70％的相應(yīng)飽和特異性結(jié)合量。對每一個孵化溫度而言，在5分鐘孵化時間內(nèi)可達(dá)到最大結(jié)合量。聯(lián)合曲線分析反映出觀察到的結(jié)合速率常數(shù)(kob)在4℃，25℃和37℃時分別為0.6285，2.571和1.523min-1。動力學(xué)解離也是迅速的(圖4)。在25℃下，加入1μM化合物135至反應(yīng)管中后僅僅2分鐘內(nèi)放射性配體解離。在25℃下迅速的解離動力學(xué)不能夠使我們計算出精確的解離速率常數(shù)(koff)。當(dāng)在4℃下孵化時解離是漸增的。加入過量的化合物135后在大約45分鐘內(nèi)[3H]化合物A完全被置換。4℃時的解離曲線分析反映出koff為0.1249min-1。4℃時kon(kob-koff/放射性配體濃度)為0.1007nM-1min-1。
在表觀結(jié)合飽和條件下(30分鐘孵化)采用10種濃度的配體進(jìn)行配體飽和實驗。圖5顯示了飽和曲線和[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的斯卡恰特作圖。斯卡恰特作圖是線性的，指示了單個飽和高親和結(jié)合位點的存在。等軸雙曲線的非線性回歸分析顯示了蛋白Bmax為6512±1501fmoles/mg，KD為0.90±0.14nM(n＝3)。
為抑制[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜的結(jié)合而測試了一系列mGlu1受體激動劑和拮抗劑。圖6中顯示了一些拮抗劑的抑制曲線，所有化合物的Ki值在表11中列出。
表11不同的mGlu1受體激動劑和拮抗劑抑制[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的效價。Ki值和Hill系數(shù)是3-4個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
化合物 Ki(nM) Hill系數(shù)化合物A 1.35±0.99 0.94±0.04NPS2390 1.36±0.50 0.97±0.02BAY 36-7620 11.2±0.93 0.95±0.02CPCCOEt 4,900±170 0.93±0.03谷氨酸 ＞1,000,000使君子氨酸 ＞1,000,0001S，3R-ACPD ＞1,000,000(S)-3，5-DHPG＞1,000,000LY367385＞1.000,000(S)-4C3HPG ＞1,000,000AIDA ＞1,000,000(S)-4CPG ＞1,000,000MCPG ＞1,000,000值得注意的是，所有與谷氨酸結(jié)合位點結(jié)合的配體，例如谷氨酸，使君子氨酸，1S，3R-ACPD，(S)-3，5-DHPG，LY-367385，(S)-4C3HPG，(S)-4CPG，MCPG和AIDA，不能抑制[3H]化合物A的結(jié)合。相反，非競爭性mGlu1受體拮抗劑CPCCOEt，BAY 36-7620，NPS 2390和化合物A抑制[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜的結(jié)合，其效價通常與它們抑制mGlu1a受體功能的效價一致?；衔顰和NPS 2390顯示了高親和力，其Ki值分別為1.35±0.99和1.36±0.50nM。BAY 36-7620在納摩爾濃度下也能抑制結(jié)合，而CPCCOEt在微摩爾濃度下就被置換了。
我們也研究了與mGlu2，-3，-4，-5和-6受體相比，[3H]化合物A與mGlu1受體結(jié)合的特異性。當(dāng)使用分別由表達(dá)Glu2，mGlu3或mGlu6受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞中制備的膜時，發(fā)現(xiàn)使用了[3H]LY341495，95，98和40％的特異結(jié)合量。[3H]MPEP用于mGlu5受體的正向調(diào)節(jié)，產(chǎn)生了與包含膜在內(nèi)的大鼠mGlu5受體95％的特異性結(jié)合。20nM[3H]化合物A與由表達(dá)Glu2，mGlu3或mGlu6受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞中制備的膜的總結(jié)合量不高于與制備自野生型CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞的膜的結(jié)合量，也不高于與大鼠Glu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜的非特異性結(jié)合量。此外，使用不同的空白試劑研究[3H]化合物A與這些膜的特異性結(jié)合1μM化合物135，預(yù)計與化合物A相同的位點結(jié)合，谷氨酸和L-SOP，與谷氨酸結(jié)合袋結(jié)合，MPEP與mGlu5受體上的變異位點結(jié)合(見表12)。這些空白試劑沒有置換[3H]化合物。同時，這些數(shù)據(jù)證明了與mGlu2，-3，-4，-5和-6受體亞型相比，[3H]化合物A對mGlu1受體的特異性。
表12與mGlu2，-3，-4，-5和-6受體相比，[3H]化合物A對mGlu1受體是特異的。將20nM[3H]化合物A與40μg來自野生型(CHO-二氫葉酸還原酶)細(xì)胞或來自CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞表達(dá)大鼠mGlu2，-3，-4，-5和-6受體的特異性結(jié)合，同10nM[3H]化合物A與20μg大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜相比較。用不同的化合物限定非特異性結(jié)合。來自大鼠mGlu1a受體CHO-二-氫葉酸還原酶膜的特異性結(jié)合(SB)數(shù)據(jù)是3個重復(fù)實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。其余的SB數(shù)據(jù)是一次實驗重復(fù)測定的平均值(ND＝未測定)。
SB(fmoles/mg mGlu1 wild- mGlu2mGlu3 mGlu4 mGlu5 mGlu6蛋白)type化合物135作空白6057±65 0 0 82 38 0試劑 1456 ND 34a0a57b0c0a不同的空白度劑 NDa使用1mM谷氨酸測定非特異性結(jié)合b使用0.1mM L-SOP測定非特異性結(jié)合c使用10μm MPEG測定非特異性結(jié)合與[3H]使君子氨酸結(jié)合的比較。使用30μg經(jīng)孵化的蛋白和10種濃度(1，2，5，10，20，40，60，90，120和150nM)的Glu1受體激動劑[3H]使君子氨酸進(jìn)行飽和結(jié)合實驗(圖7)。調(diào)整曲線顯示了單個結(jié)合位點，其KD值和Bmax值分別為22.0±10nM和3912±436fmoles/mg蛋白(n＝3)。顯然，與[3H]使君子氨酸相比，[3H]化合物A與mGlu1a的結(jié)合具有更高的親和力。用[3H]使君子氨酸標(biāo)記的結(jié)合位點的數(shù)量是用[3H]化合物A標(biāo)記的結(jié)合位點數(shù)量的～60％。
評價相同化合物對[3H]使君子氨酸與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的抑制作用。圖13概括了進(jìn)行測試的激動劑和拮抗劑的抑制效價和Hill系數(shù)。在這種情況下，已知的產(chǎn)生與谷氨酸競爭相互作用的化合物能抑制[3H]使君子氨酸的結(jié)合，而CPCCOEt，BAY36-7620和NPS 2390不影響[3H]使君子氨酸的結(jié)合。化合物A也沒有[3H]使君子氨酸與大鼠mGlu1a受體的結(jié)合。競爭性mGlu1受體配體置換[3H]使君子氨酸的結(jié)合效價具有如下作用強弱順序使君子氨酸＞谷氨酸＞LY367385＞(S)-3，5-DHPG＞(S)-4C3HPG＞1S，3R-ACPD＞(S)-4CPG＞AIDA＞MCPG。
表13不同的mGlu1受體激動劑和拮抗劑抑制[3H]使君子氨酸與大鼠mGlu1a受體二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的效價。Ki值和Hill系數(shù)是2個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
化合物 Ki(μM) Hill系數(shù)使君子氨酸 0.030±0.00 0.98±0.01谷氨酸 0.40±0.07 0.99±0.01LY367385 1.18±0.47 0.99±0.01(S)-3，5-DHPG 1.42±0.00 0.97±0.00(S)-4C3HPG 1.65±0.06 0.98±0.021S，3R-ACPD1.92±0.20 0.97±0.01(S)-4CPG 4.51±0.78 0.98±0.00AIDA 98.3±15.4 0.98±0.03MCPG 165±0.470.96±0.02化合物A＞1,000NPS 2390 ＞1,000BAY 36-7620＞1,000CPCCOEt＞1,000CPCCOEt，BAY 36-7620，NPS 2390和[3H]化合物A之間競爭結(jié)合的本質(zhì)。非競爭性化合物全部置換[3H]化合物A而不影響[3H]使君子氨酸的結(jié)合，這一事實表明這些拮抗劑除了谷氨酸結(jié)合位點之外還結(jié)合另外位點。為了評價參考化合物CPCCOEt，BAY 36-7620，NPS 2390和新近經(jīng)鑒定的mGlu1受體拮抗劑化合物A是否存在對相同位點或互相排斥位點的競爭，在缺少或存在CPCCOEt(30μM)，BAY 36-7620(100nM)和NPS 2390(10nM)的條件下，用濃度從0.2-20nM的[3H]化合物A進(jìn)行飽和實驗。這些競爭物的存在不影響B(tài)max值，但是引起了[3H]化合物A KD值的顯著性變化(表14)。這在圖8中是直觀的，其中使用直線回歸標(biāo)繪數(shù)據(jù)。在斯卡恰特作圖中，得到的直線的確在X軸上有相同的截距(例如Bmax值)。
表14KD值和Bmax值取自[3H]化合物A飽和結(jié)合曲線的分析，該曲線在mGlu1受體拮抗劑CPCCOEt(30μM)，BAY 36-7620(100nM)和NPS 2390(10nM)缺少或存在的條件下得到。這些數(shù)值是3個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Student氏t檢驗(2組)進(jìn)行系統(tǒng)分析**p＜0.01和***p＜0.001。
對照組 CPCCOEt BAY 36-7620NPS 2390KD(nM) 0.73±0.09 3.17±0.90**5.21±1.2**2.90±0.20***Bmax(fmoles/mg7284±970 7009±1231 5872±1018 6887±2804蛋白)[3H]化合物A在大鼠腦膜和切片中的結(jié)合。我們使用特異的mGlu1受體配體[3H]化合物A檢測在大鼠腦部不同部位的受體結(jié)合。制備大鼠皮層，紋狀體，小腦和海馬組織的膜，測量[3H]化合物A的結(jié)合。與總結(jié)合量相比，小腦中的非特異性結(jié)合量為10％，海馬組織中為30％，皮層和紋狀體中為25％。測定各個腦部區(qū)域的KD值和Bmax值。所有結(jié)構(gòu)中的KD值為約1nM。不同區(qū)域中的Bmax值有顯著的差異。在小腦中[3H]化合物A標(biāo)記了明顯高數(shù)量的mGlu1受體。在紋狀體和海馬組織中約標(biāo)記了小腦中位點數(shù)量的16％。在大鼠皮層中只結(jié)合了小腦中結(jié)合位點數(shù)量的11％。重要的是，用10μM在結(jié)構(gòu)上沒有關(guān)聯(lián)的化合物BAY 36-7620孵化頁能最大程度抑制[3H]化合物A的結(jié)合(圖9)。mGlu5受體選擇性化合物MPEP(測試直至30μM)沒有影響[3H]化合物A與大鼠小腦膜的結(jié)合，再次表明了化合物A的mGlu1受體選擇性。
使用放射性配體自顯影，我們從進(jìn)一步的細(xì)節(jié)上檢測了[3H]化合物A在大鼠腦部的結(jié)合分布(圖10)。研究在箭頭形大鼠腦切片中[3H]化合物A的放射自顯影；使用化合物135測定非特異性結(jié)合(圖10A)。在小腦分子層中觀察到了非常高的特異性結(jié)合。在CA3領(lǐng)域以及海馬結(jié)構(gòu)，丘腦，嗅球，扁桃體和黑質(zhì)網(wǎng)的齒狀回中觀察到中等強度的信號。大腦皮層，尾狀殼核，腹側(cè)蒼白球，橫臥核顯示了較低的標(biāo)記。用BAY 36-7620孵化也能完全抑制[3H]化合物A與大鼠腦切片的結(jié)合(圖10C)。
表15[3H]化合物A與大鼠皮層，海馬結(jié)構(gòu)，紋狀體和小腦的膜的飽和結(jié)合常數(shù)。KD值和Bmax值是3個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
皮層 海馬結(jié)構(gòu) 紋狀體 小腦KD(nM) 1.04±0.400.72±0.220.84±0.23 0.99±0.36Bmax(fmoles/mg471±68 688±125 741±48 4302±2042蛋白)討論迄今為止只發(fā)現(xiàn)了少量的mGlu1受體亞型選擇性拮抗劑。mGlu1受體已經(jīng)顯示了能被CPCCOEt(Litschig等，Mol.Pharmacol.55453-461，1999)和BAY 36-7620選擇性抑制，其效價是不同的，對CPCCOEt而言是微摩爾(6.6μM)，對BAY 36-7620而言是高納摩爾濃度(160nM)。在本研究中，化合物A被鑒定為是一種新穎的mGlu1受體拮抗劑，具有對大鼠mGlu1a受體的低納摩爾拮抗效價(21.6nM)和人類mGlu1a受體的低納摩爾拮抗效價(10.4nM)。
由于在化合物A存在下谷氨酸誘導(dǎo)的mGlu1a受體激活的最大量降低，因此發(fā)現(xiàn)化合物A的拮抗作用是非競爭性的?？赏ㄟ^剩余受體的存在解釋在化合物A存在下實測的谷氨酸EC50的增加。低濃度的非競爭型拮抗劑存在下，由于需要更多的激動劑去補償被拮抗劑抑制的非剩余受體，因此濃度-效應(yīng)曲線將向右側(cè)移動。這些拮抗劑的濃度仍不會影響激動劑效應(yīng)的最大值，而更高的拮抗劑濃度將最終抑制最大效應(yīng)(Zhu等，J.Pharm.Tox.Meth.2985-91，1993)。據(jù)報道BAY 36-7620(Carroll等.，Mol.Pharmacol.59965-973，2001)和CPCCOEt(Hermans等，Neuropharmacology 371645-1647，1998)也有這種現(xiàn)象。我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步地顯示了化合物A可以作為mGlu1a受體的反相激動劑，相對于其他mGlu受體亞型和ionotropic谷氨酸受體而言，化合物A選擇性作用于mGlu1受體。信號傳導(dǎo)數(shù)據(jù)顯示了化合物A沒有顯示出對mGlu2，-3，-4，-5和-6受體的激動，拮抗或正向變構(gòu)的作用，放射性配體結(jié)合研究顯示了[3H]化合物A沒有與mGlu2，-3，-4，-5和-6受體結(jié)合，而且排除了化合物A作為這些受體的中性配體的可能性。選擇性mGlu1受體配體的缺乏和化合物A重要的藥理學(xué)性質(zhì)是標(biāo)記化合物A用于在結(jié)合研究中的mGlu1受體研究的強制性原因。化合物A結(jié)合符合對配體的所有要求，非常適合研究結(jié)合的性質(zhì)，藥理學(xué)和mGlu1受體分布。首先，在大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜中進(jìn)行[3H]化合物A結(jié)合研究。特異性結(jié)合非常高，并隨著蛋白質(zhì)濃度呈線性增長(圖2)。在MgCl2和CaCl2存在下特異性結(jié)合表現(xiàn)出適度的增長，而在pH6時結(jié)合下降了22％，pH增大不產(chǎn)生影響。關(guān)于pH對結(jié)合的影響，值得注意的是化合物A通過計算得到物理化學(xué)性質(zhì)計算的pKa和clogP分別是6.2和4.5。因此pH7.4時，化合物A的電離程度非常低(只有5.9％)。在更高的pH下電離百分比進(jìn)一步地下降(pH8時1.6％，pH9時0.2％，pH10沒有質(zhì)子化)。pH7.4至pH10時clogD值保持在4.5。然而在PH6時，61.3％的化合物A是處于質(zhì)子化形式。相應(yīng)地，clogD降低至4.1。離子化形式配體的更低的結(jié)合表明非離子化配體具有最高的結(jié)合親和力。相反，值得注意的是發(fā)現(xiàn)單胺G蛋白偶聯(lián)受體(例如多巴胺受體)的配體，其通常是強酸并以陽離子形式結(jié)合。對這樣的化合物而言，與受體結(jié)合的驅(qū)動力本質(zhì)上是靜電(Van de Waterbeemd等，J.Med.Chem.29600-606，1986)。我們的數(shù)據(jù)可以表明離子相互作用不是與受體結(jié)合的驅(qū)動力，離子表面作用也沒有作出貢獻(xiàn)。此外，盡管化合物A是強親脂化合物，[3H]化合物A非常低的非特異性結(jié)合是由于非離子形式的化合物A和負(fù)電荷細(xì)胞膜之間沒有靜電作用。結(jié)合隨溫度而變，大體上在4℃時增長(圖3)。由于其迅速的結(jié)合和解離動力學(xué)，因此迅速達(dá)到了結(jié)合平衡。[3H]化合物A表面上是以非常高的親和力(KD＝0.90±0.14nM)標(biāo)記單一種類的位點。相反，[3H]使君子氨酸，迄今可選擇的mGlu1受體配體，顯示出22.0±10nm的更高KD值，這與從Mutel等，J.Neurochem752590-2601，2000中得到的37nM的值非常不一致。除了可觀的高親和力之外，[3H]化合物A比[3H]使君子氨酸顯著地標(biāo)記了更多的(～40％)結(jié)合位點。發(fā)現(xiàn)[3H]化合物A和[3H]使君子氨酸的蛋白質(zhì)Bmax值分別為6512±1501fmoles/mg和3912±436fmoles/mg?？稍谑荏w的G蛋白偶聯(lián)基礎(chǔ)上解釋這種差異。激動劑促進(jìn)了受體與G蛋白的偶聯(lián)，這導(dǎo)致了受體對激動劑具有高親和力的構(gòu)象。根據(jù)這種理論，完全激動劑，例如使君子氨酸，將大部分地標(biāo)記高親和力或G蛋白偶聯(lián)受體位點。拮抗劑將具有對偶聯(lián)和非偶聯(lián)受體同等的親和力，對受體高親和力位點或低親和力位點而言同樣如此。我們關(guān)于[3H]化合物A Bmax值顯著高于[3H]使君子氨酸的發(fā)現(xiàn)是符合這一理論的。
這項研究中驚人的發(fā)現(xiàn)是天然激動劑谷氨酸和使君子氨酸不能抑制[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜的結(jié)合，然而已知的非競爭性拮抗劑CPCCOEt，BAY 36-7620，NPS 2390和化合物A，都能夠最大水平抑制[3H]化合物A與相同部位的結(jié)合(圖6)。用后者對[3H]化合物A的抑制作用符合反曲線，其Hill系數(shù)約為1.0(表11)，這沒有給出多種位點結(jié)合的暗示。著重提到的是盡管在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的類似物用于限定非特異性結(jié)合，然而在大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜中使用1μM或更多的不相關(guān)的化合物例如BAY36-7620也可取得類似的低非特異性結(jié)合(圖6)。對[3H]使君子氨酸而言，所有的氨基酸類似物，已知的競爭性配體，能夠從其結(jié)合位點置換[3H]使君子氨酸。使君子氨酸，谷氨酸，LY367385，(S)-3，5-DHPG，(S)-4C3HPG，IS，3R-ACPD，(S)-4CPG，AIDA和MCPG(表13)的抑制效價均很好地符合Mutel等.J.Neurochem.752590-2601，2000中報道的值。相反，以上非競爭性化合物不能影響它的結(jié)合。對CPCCOEt而言，已經(jīng)報道了它不能影響[3H]谷氨酸與由大鼠mGlu1a受體表達(dá)細(xì)胞制備的膜的結(jié)合(Litschig等，Mol.Pharmacol.55453-461，1999)。此外，已經(jīng)指明了CPCCOEt沒有與谷氨酸結(jié)合位點結(jié)合，但是在跨膜區(qū)VII中與Thr815和Ala818相互干擾。提出了CPCCOEt通過破壞谷氨酸結(jié)合胞外域和跨膜區(qū)VII之間的分子內(nèi)相互作用從而干擾受體信號。Caroll等在Mol.Pharmacol.59965-973，2001中證實了BAY 36-7620沒有從谷氨酸結(jié)合袋中置換[3H]使君子氨酸?？缒わ@示了跨膜螺旋4-7在BAY 36-7620的結(jié)合中起了決定性的作用。我們采用[3H]化合物A和[3H]使君子氨酸進(jìn)行的抑制實驗表明了CPCCOEt，BAY 36-7620，NPS 2390與化合物A相同的位點結(jié)合。在30μM CPCCOEt，100nM BAY 36-7620和10nM NPS 2390缺少和存在的條件下使用[3H]化合物A的飽和實驗進(jìn)一步支持了這些化合物與相同或互相排斥的位點結(jié)合。KD值顯著增長，而Bmax值沒有改變(表14)。這些結(jié)果表明盡管[3H]化合物A親和力降低，高濃度的[3H]化合物A依然能夠從其他化合物的結(jié)合位點置換它們的結(jié)合，這是競爭性相互作用的典型特性。在結(jié)論中，我們的數(shù)據(jù)支持了以下觀點假設(shè)CPCCOEt，BAY 36-7620，NPS 2390和化合物A競爭相同的跨膜束VII，它們作用于與谷氨酸結(jié)合袋不同的位點。
以前進(jìn)行的腦部中I組mGlu受體結(jié)合研究使用了[3H]谷氨酸或[3H]使君子氨酸(Schoepp和True，Neurosci.Lett145100-104，1992；Wright等，J.Neurochem.63938-945，1994；Mutel等，J.Neurochem.752590-2601，2000)。這些放射性配體具有標(biāo)記一種以上谷氨酸受體的缺點。因此，必須加入選擇性抑制劑至孵化緩沖液中，以阻止標(biāo)記其他代謝性或離子移變谷氨酸受體亞型。迄今為止，沒有得到能夠?qū)ｉT研究mGlu1受體的結(jié)合和分布的放射性配體。特異性mGlu1受體標(biāo)記的[3H]化合物A特別有利于大鼠或人類腦部中天然mGlu1受體的研究。使用大鼠皮層，海馬結(jié)構(gòu)，紋狀體和小腦的膜的實驗顯示了在1μM化合物135存在的條件下，[3H]化合物A特異性結(jié)合程度高，尤其是在小腦中(只有10％非特異性結(jié)合)。飽和實驗顯示了[3H]化合物A能顯然地以非常高的親和力再次標(biāo)記單一結(jié)合位點。發(fā)現(xiàn)所有的不同腦部區(qū)域的KD值約為1nM(表15)。發(fā)現(xiàn)Bmax值有顯著的差別在小腦中標(biāo)記了大量的結(jié)合位點，而在海馬結(jié)構(gòu)，紋狀體和皮層中只檢測到中度到低度的受體表達(dá)。
由于[3H]化合物A的特異性，它被證明特別適用于使用放射性配體自顯影的腦部mGlu1受體分布的研究。mGlu1受體放射性自顯影顯示了高度Glu1特異性結(jié)合存在于小腦分子層中。粒細(xì)胞層被微弱標(biāo)記。Mutel等在J.Neurochem.752590-2601，2000中也發(fā)現(xiàn)了這些結(jié)果，他們使用[3H]使君子氨酸研究I組mGlu受體分布。在海馬結(jié)構(gòu)中，CA3樹突和分子層齒狀回顯示出大量的標(biāo)記。CA1區(qū)域顯示出非常低的[3H]化合物A的結(jié)合，完全符合Lujan等，Eur.J.Neurosci.81488-1500，1996和Shigemoto等，J.Neurosci.177503-7522，1997中的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)，他們顯示了在CA1樹突中，mGlu5特異性受體抗體產(chǎn)生了強烈的免疫標(biāo)記而不是mGlu1特異性受體抗體。使用[3H]使君子氨酸的放射自顯影實驗確實顯示出在海馬結(jié)構(gòu)的CA1和CA3區(qū)域中的染色，指示了分別與mGlu1和mGlu5受體的結(jié)合(Mutel等，J.Neurochem.752590-2601，2000)。在丘腦，嗅球，扁桃體和黑質(zhì)網(wǎng)中[3H]化合物A結(jié)合也非常高，在大腦皮層，尾狀殼核，伏核和腹側(cè)蒼白球中有些低。使用[3H]使君子氨酸標(biāo)記相同的結(jié)構(gòu)(Mutel等，J.Neurochem.752590-2601，2000)。使用mGlu1a受體選擇性抗體的mGlu1a受體細(xì)胞定位的免疫化學(xué)結(jié)果也普遍符合我們的數(shù)據(jù)。(Martin等，Neuron.9259-270，1992)。迄今為止，已知[3H]化合物A能標(biāo)記所有的mGlu1受體剪接變體，然而1剪接變體的分布也許不同于我們的放射標(biāo)記。例如，在用放射性配體標(biāo)記的CA3區(qū)域和尾狀殼核中，發(fā)現(xiàn)了mGlu1b受體免疫反應(yīng)性而沒有或有少許mGlu1a受體免疫反應(yīng)性(Martin等，Neuron.9259-270，1992；Shigemoto等，J.Neurosci.177503-7522，1997；Ferraguti等，J.Comp.Neur.400391-407，1998)。在鑒定[3H]化合物A標(biāo)記位點的示范中，重要的一點是發(fā)現(xiàn)了假如充分保證抑制的結(jié)合是純粹的受體特異性而與放射性配體的結(jié)構(gòu)沒有關(guān)系，結(jié)構(gòu)上不同的化合物BAY 36-7620也能全部置換[3H]化合物A與大鼠腦膜結(jié)合(圖9)以及與腦切片的結(jié)合(圖10)。
在本申請中，我們已經(jīng)顯示了在異源表達(dá)系統(tǒng)，大鼠腦部勻漿和腦部中[3H]化合物A對于研究mGlu1受體是優(yōu)良的放射性配體。我們能推斷由于[3H]化合物A具有最小程度的非特異性結(jié)合，高結(jié)合親和力以及顯著的選擇性，因此它是選擇用來進(jìn)一步探索mGlu1受體的配體。[3H]化合物A開創(chuàng)了詳細(xì)研究mGlu1受體亞細(xì)胞定位和細(xì)胞定位，以及研究配體在不同區(qū)域的功能作用和規(guī)則的前景。
附圖目錄圖1化合物A拮抗性簡介。圖1A顯示了在表達(dá)大鼠mGlu1a受體的CHO-二氫葉酸還原酶細(xì)胞中谷氨酸(30μM)誘導(dǎo)的Ca2+移動。數(shù)據(jù)用30μM谷氨酸獲得的信號百分比表示，設(shè)置在100％，為3個實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖1B顯示了谷氨酸單獨存在或與20nM，30nM，60nM，100nM以及1μM化合物A一起的濃度-效應(yīng)曲線。數(shù)值是一個實驗中三次測量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。附加實驗表明了同樣的結(jié)果。圖1C顯示了化合物A濃度增長時的基礎(chǔ)IP累積。數(shù)值用溶劑中基礎(chǔ)IP產(chǎn)物的百分比表示，設(shè)為100％，是3個4重實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖2[3H]化合物A的特異性結(jié)合與膜蛋白的量呈線性。在冰上用2.5nM[3H]化合物A孵化10-50μg大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜30分鐘。數(shù)據(jù)用一個代表性實驗中的3次測量值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
圖3[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的聯(lián)合時間-過程曲線。通過在3組不同的溫度下，在過濾前的不同時間加入2.5nM[3H]化合物A來測量聯(lián)合動力學(xué)。數(shù)據(jù)是3個獨立的雙重實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖44℃和25℃時[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜解離的時間-過程曲線。在指明的時間對每一個數(shù)據(jù)點，在4℃或25℃下孵化樣品30分鐘，然后加入過量的化合物135，接著速濾。數(shù)值是2個獨立的雙重實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的代表性飽和結(jié)合曲線和斯卡恰特作圖。特異性結(jié)合(SB)通過計算在1μM化合物135存在條件下測定的總結(jié)合量(TB)和非特異結(jié)合量(BL)的差額得到特異性結(jié)合量(SB)。對每一個實驗而言，兩次測定數(shù)據(jù)點。實驗重復(fù)3次。
圖6使用不同的mGlu受體抑制劑抑制2.5nM[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜的結(jié)合。數(shù)據(jù)點代表總結(jié)合的百分量，是3-4個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖7[3H]使君子氨酸與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的代表性飽和結(jié)合曲線和斯卡恰特作圖。對每一個實驗而言，兩次測定數(shù)據(jù)點。重復(fù)實驗2次。
圖8在缺少和存在CPCCOEt(30μM)，BAY 36-7620(100nM)和NPS 2390(10nM)的條件下，[3H]化合物A與大鼠mGlu1a受體CHO-二氫葉酸還原酶膜結(jié)合的代表性飽和結(jié)合曲線和斯卡恰特作圖。圖中顯示的是代表性的3個獨立實驗。用特異性結(jié)合nM表示數(shù)據(jù)。對每一個實驗而言，兩次測定數(shù)據(jù)點。
圖9使用BAY 36-7620抑制2.5nM[3H]化合物A與大鼠小腦膜的結(jié)合。數(shù)據(jù)點代表總結(jié)合量的百分?jǐn)?shù)，是2個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖10使用放射自顯影的[3H]化合物A與箭頭形的大鼠腦部的結(jié)合。圖A是顯示了與1.5nM[3H]化合物A的總結(jié)合量的代表形部分。圖B是顯示了在1μM化合物135存在條件下與1.5nM[3H]化合物A非特異性結(jié)合的代表性和鄰近部分。圖C是代表性部分，顯示了在10μMBAY 36-7620存在條件下與1.5nM[3H]化合物A的非特異性結(jié)合。圖A和B的部分暴露于[3H]超膜中，而圖C部分暴露于富士成像板中。Th，丘腦；SNr，黑質(zhì)網(wǎng)；CA3，海馬結(jié)構(gòu)的CA3區(qū)域；Dg，海馬結(jié)構(gòu)的齒狀回；Cer，小腦；Cp，尾狀殼核；Cx，大腦皮層；Ot，嗅球；Am，扁桃體；Vp，腹側(cè)蒼白球；Na，伏核。
權(quán)利要求
1.具有式(I-A)*或(I-B)*的放射性標(biāo)記的化合物， 其N氧化物，其藥學(xué)上可接受的加成鹽，其季胺和其立體化學(xué)異構(gòu)體，式中X代表X代表O；C(R6)2，其中R6是氫，可任意被氨基或單或二(C1-6烷基)氨基取代的芳基或C1-6烷基；S或R7是氨基或羥基的N-R7；R1代表C1-6烷基；芳基；噻吩基；喹啉基；C3-12環(huán)烷基或(C3-12環(huán)烷基)C1-6烷基，其中C3-12環(huán)烷基部分可任意包含雙鍵，環(huán)C3-12烷基部分中的一個碳原子可被氧原子或NR8-部分取代，R8是氫，苯甲基或C1-6烷氧羰基；其中C1-6烷基部分或C3-12環(huán)烷基部分中的一個或多個氫原子可任意被C1-6烷基，羥基C1-6烷基，鹵代C1-6烷基，氨基C1-6烷基，羥基，C1-6烷氧基，芳基C1-6烷氧基，鹵素，C1-6烷氧羰基，芳基，氨基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷氧羰基氨基，鹵素，哌嗪基，吡啶基，嗎啉基，噻吩基或式-O-，-O-CH2-O或-O-CH2-CH2-O-的二價基團取代；或式(a-1)的基團 其中Z1是單共價鍵，O，NH或CH2；Z2是單共價鍵，O，NH或CH2；n是整數(shù)0，1，2或3；和其中苯環(huán)中的每一個氫原子可獨立地任意地被鹵素，羥基，C1-6烷基，C1-6烷氧基或羥基C1-6烷基取代；或X和R1可用碳原子連接在一起，形成式(b-1)，(b-2)或(b-3)的基團； R2代表氫；鹵素；氰基；C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-6烷硫基；C1-6烷基羰基；C1-6烷氧羰基；C1-6烷基羰基氧C1-6烷基；C2-6烯基；羥基C2-6烯基；C2-6炔基；羥基C2-6炔基；三(C1-6烷基)甲硅基C2-6炔基；氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷硫基C1-6烷基)氨基；芳基；芳基C1-6烷基；芳基C2-6炔基；C1-6烷氧基C1-6烷基氨基C1-6烷基；任意被C1-6烷基，C1-6烷氧基C1-6烷基，C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或吡啶基C1-6烷基取代的氨基羰基；選自噻吩基，呋喃基，吡咯基，噻唑基，噁唑基，咪唑基，異噻唑，異噁唑基，吡唑基，吡啶基，吡嗪基，噠嗪基，嘧啶基，哌啶基哌啶基和哌嗪基的雜環(huán)，任意的N被C1-6烷氧基C1-6烷基，嗎啉基，硫代嗎啉基，二噁烷基或二噻烷基取代；基團-NH-C(＝O)R9其中R9代表任意被C3-12環(huán)烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷氧基羰基，芳基，芳基氧基，噻吩基，吡啶基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷硫基，芐硫基，吡啶硫基或嘧啶硫基取代的C1-6烷氧基；C3-12環(huán)烷基；環(huán)己烯基；氨基；芳基C3-12環(huán)烷基氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基)氨基；單或二(C2-6烯基)氨基；單或二(芳基C1-6烷基)氨基；單或二芳基氨基；芳基C2-6烯基；呋喃基C2-6烯基；哌啶基；哌嗪基；吲哚基；呋喃基；苯并呋喃基；四氫呋喃基；茚基；金剛烷基(adamantyl)；吡啶基；吡嗪基；芳基；芳基C1-6烷硫基；或式(a-1)基團；磺胺類-NH-SO2-R10其中R10代表C1-6烷基，單或多鹵素C1-6烷基，芳基C1-6烷基，芳基C2-6烯基，芳基，喹啉基，異噁唑基或二(C1-6烷基)氨基；R3和R4分別獨立代表氫；鹵素；羥基；氰基；C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷基羰基；C1-6烷氧基羰基；C2-6烯基；羥基C2-6烯基；C2-6炔基；羥基C2-6炔基；三(C1-6烷基)甲硅基C2-6炔基；氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷硫基C1-6烷基)氨基；芳基；嗎啉基C1-6烷基或哌啶基C1-6烷基；或R2和R3可一起連接形成-R2-R3-，代表式-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，-CH＝CH-CH＝CH-，-Z4-CH＝CH-，-CH＝CH-Z4-，-Z4-CH2-CH2-CH2-，CH2-Z4-CH2-CH2-，-CH2-CH2-Z4-CH2-，-CH2-CH2-CH2-Z4-，-Z4-CH2-CH2-，-CH2-Z4-CH2-或-CH2-CH2-Z4-的二價基團，其中Z4是O，S，SO2或NR11，R11是氫，C1-6烷基，苯甲基或C1-6烷氧基羰基；其中每一個二價基團任意被C1-6烷基取代?；騌3和R4可一起連接形成-CH＝CH-CH＝CH-或-CH2-CH2-CH2-CH2-的二價基團；R5代表氫，C3-12環(huán)烷基；哌啶基；氧代噻吩基；四氫噻吩基；芳基C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或C1-6烷基，任選的用C(＝O)NRxRy基團取代，其中Rx和Ry各自獨立地是氫，C3-12環(huán)烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，任選地用氰基，C1-6烷氧基，C1-6烷氧基羰基，呋喃基，，吡咯烷基，苯甲硫基，吡啶基，吡咯基或噻吩基取代；Y代表O或S；或Y和R5可一起連接形成＝Y(jié)-R5，＝Y(jié)-R5-代表-CH＝N-N＝(c-1)；-N＝N-N＝(c-2)；或-N-CH＝CH-(c-3)的基團；芳基代表任意用一種或多種取代基取代的苯基或萘基，取代基選自鹵素，羥基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，苯氧基，硝基，氨基，硫基，C1-6烷硫基，鹵代C1-6烷基，多鹵代C1-6烷基，多鹵代C1-6烷氧基，羥基C1-6烷氧基C1-6烷基，氨基C1-6烷基，單或二(C1-6烷基)氨基，單或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基，氰基，-CO-R12，-CO-OR13，-NR13SO2R12，-SO2-NR13R14，-NR13C(O)R12，-C(O)NR13R14，-SOR12，-SO2R12；其中R12，R13和R14分別獨立地代表C1-6烷基；C3-6環(huán)烷基；苯基；用鹵素，羥基，C1-6烷基，C1-6烷氧基，鹵素C1-6烷基，多鹵素C1-6烷基，呋喃基，噻吩基，吡咯基，咪唑基，噻唑基或噁唑基取代的苯基；當(dāng)R1-C(＝X)部分與不是7位或8位的另一個位置連接時，所述7位和8位可以用R15和R16取代，其中R15和R16分別或都為C1-6烷基，C1-6烷氧基，或R15和R16一起連接形成-CH＝CH-CH＝CH-的二價基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的放射性標(biāo)記的化合物，其特征在于X代表O；R6是氫或芳基的C(R6)2；或R7是氨基或羥基的N-R7；R1代表C1-6烷基；芳基；噻吩基；喹啉基；C3-12環(huán)烷基或(C3-12環(huán)烷基)C1-6烷基，其中C3-12環(huán)烷基的一部分可任意包含雙鍵，和環(huán)C3-12烷基部分中的一個碳原子可被氧原子或NR8-部分取代，R8是苯甲基或C1-6烷氧羰基；其中C1-6烷基部分或C3-12環(huán)烷基部分中的一個或多個氫原子可任意被C1-6烷基，鹵代C1-6烷基，羥基，C1-6烷氧基，芳基C1-6烷氧基，鹵素，芳基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷氧羰基氨基，鹵素，哌嗪基，吡啶基，嗎啉基，噻吩基或式-O-或-O-CH2-CH2-O-的二價基團取代；或式(a-1)的基團 其中Z1是單共價鍵，O或CH2；Z2是單共價鍵，O或CH2；n是整數(shù)0，1，或2；和其中苯環(huán)中的每一個氫原子可獨立地任意地被鹵素或羥基取代；或X和R1可用碳原子連接在一起，形成式(b-1)，(b-2)或(b-3)的基團； R2代表氫；鹵素；氰基；C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-6烷硫基；C1-6烷基羰基；C1-6烷氧基羰基；C2-6烯基；羥基C2-6烯基；C2-6炔基；羥基C2-6炔基；三(C1-6烷基)甲硅基C2-6炔基；氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷硫基C1-6烷基)氨基；芳基；芳基C1-6烷基；芳基C2-6炔基；C1-6烷氧基C1-6烷基氨基C1-6烷基；任意被C1-6烷氧基羰基C1-6烷基取代的氨基羰基；雜環(huán)選自噻吩基，呋喃基，噻唑基，哌啶基，任意N取代的嗎啉基或硫代嗎啉基；基團-NH-C(＝O)R9其中R9代表任意被C3-12環(huán)烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷氧基羰基，芳基，芳基氧基，噻吩基，吡啶基，單或二(C1-6烷基)氨基，C1-6烷硫基，苯甲硫基，吡啶硫基或嘧啶硫基取代的C1-6烷氧基；C3-12環(huán)烷基；環(huán)己烯基；氨基；芳基C3-12環(huán)烷基氨基；單或二(C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基C1-6烷基)氨基；單或二(C1-6烷氧基羰基)氨基；單或二(C2-6烯基)氨基；單或二(芳基C1-6烷基)氨基；單或二芳基氨基；芳基C2-6烯基；呋喃基C2-6烯基；哌啶基；哌嗪基；吲哚基；呋喃基；苯并呋喃基；四氫呋喃基；茚基；金剛烷基；吡啶基；吡嗪基；芳基或式(a-1)基團；磺胺類-NH-SO2-R10其中R10代表C1-6烷基，單或多鹵素C1-6烷基，芳基C1-6烷基或芳基；R3和R4分別獨立代表氫；C1-6烷基；C1-6烷氧基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基；或R2和R3可連接在一起形成-R2-R3-，代表-(CH2)4-，-(CH2)5-，-Z4-CH＝CH-，-Z4-CH2-CH2-CH2-或-Z4-CH2-CH2-的二價基團，其中Z4是O，S，SO2或NR11，R11是氫，C1-6烷基，苯甲基或C1-6烷氧基羰基；其中每一個二價基團任意被C1-6烷基取代；或R3和R4可一起連接形成-CH＝CH-CH＝CH-或-CH2-CH2-CH2-CH2-的二價基團；R5代表氫；哌啶基；氧代噻吩基；四氫噻吩基；芳基C1-6烷基；C1-6烷氧基羰基C1-6烷基或C1-6烷基，任選的用C(＝O)NRxRy基團取代，其中Rx和Ry各自獨立地是氫，C3-12環(huán)烷基，C2-6炔基或C1-6烷基，任選地用氰基，C1-6烷氧基，C1-6烷氧基羰基取代；Y代表O或S；或Y和R5可一起連接形成＝Y(jié)-R5，＝Y(jié)-R5-代表-CH＝N-N＝(c-1)；或-N＝N-N＝(c-2)；芳基代表任意用一種或多種取代基取代的苯基或萘基，取代基選自鹵素，C1-6烷氧基，苯氧基，單或二(C1-6烷基)氨基和氰基；當(dāng)R1-C(＝X)部分與不是7位或8位的另一個位置連接時，所述7位和8位可以用R15和R16取代，其中R15和R16分別或都為C1-6烷基，C1-6烷氧基，或R15和R16連接在一起形成-CH＝CH-CH＝CH-的二價基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項中的放射性標(biāo)記的化合物，其特征在于X代表O；R1代表C1-6烷基；C3-12環(huán)烷基或(C3-12環(huán)烷基)C1-6烷基，其中C1-6烷基部分或C3-12環(huán)烷基部分中的一個或多個氫原子可任意被C1-6烷氧基，芳基，鹵素，噻吩基取代；R2代表氫；鹵素；C1-6烷基或氨基；R3和R4分別獨立代表氫或C1-6烷基；或R2和R3可連接在一起形成-R2-R3-，代表-Z4-CH2-CH2-CH2-或-Z4-CH2-CH2-的二價基團，其中Z4是O或NR11，R11是C1-6烷基；其中每一個二價基團任意被C1-6烷基取代；或R3和R4可連接在一起形成-CH2-CH2-CH2-CH2-的二價基團；R5代表氫；Y代表O；和芳基代表任意用鹵素取代的苯基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項中的放射性標(biāo)記的化合物，其特征在于R1-C(＝X)部分與喹啉或喹啉酮的6位連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項中的放射性標(biāo)記的化合物，其特征在于化合物包含至少一個放射性原子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中的放射性標(biāo)記的化合物，其特征在于放射性同位素選自3H，11C和18F。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中的放射性標(biāo)記的化合物，其特征在于化合物是化合物(a)，(b)，(c)，(d)和(e)中的任一個
8.根據(jù)權(quán)利要求6中的放射性標(biāo)記的化合物，其特征在于化合物是化合物(a)。
9.一種施用于哺乳動物的放射性組合物，包含治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物，其用于診斷方法中。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物，其特征在于診斷方法包括標(biāo)記或識別生物物質(zhì)中的mGlul受體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物，其特征在于標(biāo)記包括將放射性化合物施用至生物物質(zhì)，以及識別包括檢測放射性標(biāo)記的化合物的放射情形。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物，其特征在于診斷方法包括熒光屏檢查測試化合物是否有能力占據(jù)生物物質(zhì)中的mGlul受體或與生物物質(zhì)中的mGlul受體結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或組合物，其特征在于生物物質(zhì)選自溫血動物和本質(zhì)上是溫血動物，尤其是人類的組織樣品，血漿液，體液，身體部位和器官。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物，其用于標(biāo)記和識別生物物質(zhì)中mGlul受體的診斷工具的制造中。
16.根據(jù)權(quán)利要求15中的放射性標(biāo)記的化合物或組合物的用途，其特征在于標(biāo)記包括將放射性化合物施用至生物物質(zhì)，以及識別包括檢測放射性標(biāo)記的化合物的放射情形。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物，其用于熒光屏檢查測試化合物是否有能力占據(jù)生物物質(zhì)中的mGlul受體或與生物物質(zhì)中的mGlul受體結(jié)合的診斷工具的制造中。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物，用于使器官顯影的診斷工具的制造中，其特征在于將適當(dāng)?shù)慕M合物中的足量的根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或根據(jù)權(quán)利要求9中的組合物施用至生物物質(zhì)，使所述的放射性標(biāo)記的化合物與生物物質(zhì)中的mGlul受體位點結(jié)合；檢測放射性標(biāo)記的化合物的放射情形。
19.根據(jù)權(quán)利要求18中的放射性標(biāo)記的化合物或組合物在使器官顯影的診斷工具的制造中的用途，其特征在于使用正電子發(fā)射體層攝影(PET)進(jìn)行顯影。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-19中任一項的放射性標(biāo)記的化合物或組合物的用途，其特征在于生物物質(zhì)選自溫血動物和本質(zhì)上是溫血動物，尤其是人類的組織樣品，血漿液，體液，身體部分和器官。
全文摘要
本發(fā)明涉及表現(xiàn)出代謝性谷氨酸受體拮抗活性，尤其是mGlu1受體活性的式(I－A)＊或式(I－B)＊放射性標(biāo)記的喹啉和喹啉酮衍生物及其制備；進(jìn)一步涉及了含有它們的組合物，以及它們在標(biāo)記和識別代謝性谷氨酸受體位點和使器官顯影中的用途。在一個優(yōu)選的實施方案中，X代表O；R
文檔編號A61P25/00GK1642580SQ03807387
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者A·S·J·拉薩格, F·P·比肖夫, C·G·M·詹森, H·拉夫雷森 申請人:詹森藥業(yè)有限公司