專利名稱：用于傳遞治療性化合物的以正常微生物群為基礎(chǔ)的臨床級(jí)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0002本發(fā)明通過(guò)臨床應(yīng)用級(jí)載體將治療性成分直接傳遞到所需解剖位置，從而治療、減輕或預(yù)防疾病。特別指出的是本發(fā)明所用的臨床應(yīng)用級(jí)別載體是以天然正常菌群為基礎(chǔ)，而且不含抗生素抗性選擇標(biāo)記，專門設(shè)計(jì)以限制轉(zhuǎn)化的核酸序列在體內(nèi)播散。
背景技術(shù)：
0003過(guò)去25年，分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域均取得了巨大的科學(xué)進(jìn)步。我們對(duì)許多疾病的基因功能、異源基因表達(dá)和分子基礎(chǔ)的了解也隨著這些科學(xué)的進(jìn)展而相應(yīng)地得到發(fā)展。然而，許多有前景的、更好的分子生物學(xué)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用尚未實(shí)現(xiàn)。對(duì)于醫(yī)務(wù)工作者和病人來(lái)說(shuō)，新的分子基礎(chǔ)的治療和預(yù)防方法在變成可行的選擇之前，仍需克服許多技術(shù)上和倫理上的挑戰(zhàn)。
0004總起來(lái)講，目前研究的以基因?yàn)榛A(chǔ)的臨床申請(qǐng)包括疫苗、基因替代療法和治療成分傳遞。宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化可通過(guò)基因傳遞載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，其載體包括非復(fù)制性病毒(見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)(USPN)5,824,544)，裸DNA(見(jiàn)USPN6,261,834)，包含重組表達(dá)單位的脂質(zhì)體(見(jiàn)USPN6,271,207)，微生物載體(見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/353,885和60/353,923)?？煞置诤?或表面表達(dá)治療成分的基因傳遞載體(見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/353,885和60/353,923)。其他分子水平治療成分傳遞方法包括表面表達(dá)異源蛋白的非復(fù)制性重組病毒(見(jiàn)USPN6,376,236)。
0005目前重組治療藥物已在體外制備。大規(guī)模生物反應(yīng)器可以增加細(xì)胞分泌的治療藥物的產(chǎn)量，同時(shí)收集和濃縮重組治療藥物的上清液。使用傳統(tǒng)的藥理學(xué)技術(shù)將治療成分提取、純化及合成。這一過(guò)程非常的昂貴，產(chǎn)量低且經(jīng)常得到變性的蛋白質(zhì)。因此，藥物研究者已經(jīng)試圖通過(guò)使用重組微生物載體、無(wú)生命的載體和裸露DNA來(lái)研制體內(nèi)藥物表達(dá)的方法。
0006重組微生物載體包括重組細(xì)菌(見(jiàn)USPN5,547,664)和重組病毒如α病毒(見(jiàn)USPN6,391,632)，牛痘病毒(見(jiàn)USPN6,267,965)，腺病毒(見(jiàn)USPN5,698,202)和腺伴隨病毒(AVA)(見(jiàn)USPN6,171,597)。無(wú)生命的載體包括脂質(zhì)基因傳遞載體如DNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，包裹DNA的中性或陰離子脂質(zhì)體，脂質(zhì)體吸附且被聚陽(yáng)離子致密的DNA(LPDI和LPDII)(見(jiàn)C.1999.脂質(zhì)體作為基因傳遞系統(tǒng).Braz J Med Biol Res；32(2)163-9)。然而細(xì)菌與病毒載體用于體內(nèi)基因傳遞尚有許多技術(shù)難題需要克服。而且尚未見(jiàn)到使用脂質(zhì)載體的成功臨床實(shí)驗(yàn)。
0007對(duì)基因傳遞載體的認(rèn)識(shí)成為基因治療領(lǐng)域的前驅(qū)工作。“基因治療”是描述三種不同治療模型的術(shù)語(yǔ)?；蛑委熥畛Ｒ?jiàn)的形式是基因替代治療，將不能提供必要基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞(目標(biāo)細(xì)胞)轉(zhuǎn)變成為基因產(chǎn)物提供細(xì)胞?；蛱娲芯客ǔ＜性谝恍┻z傳性疾病上，如囊性纖維化、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶缺陷(OTCD)。其他的基因治療方法包括基因產(chǎn)品的體內(nèi)合成，其中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品本身是治療劑或減輕劑。例如，編碼細(xì)胞毒素的載體已被用于癌癥患者。此載體轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞(目標(biāo)細(xì)胞)所得的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可殺死癌細(xì)胞。第三種模型與第二種類似，然而不是作為治療劑，此轉(zhuǎn)基因的序列可在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)刺激或增強(qiáng)存在的凋亡機(jī)制，轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
0008目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可在體外或體內(nèi)完成，取決于細(xì)胞本身，轉(zhuǎn)基因的性質(zhì)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞被重輸入宿主細(xì)胞，緊接著轉(zhuǎn)化基因在體內(nèi)表達(dá)(見(jiàn)USPN5,399,346)。體內(nèi)轉(zhuǎn)化要求包括載體的轉(zhuǎn)基因本身即為治療劑(見(jiàn)USPN6,015,694)。不管細(xì)胞如何轉(zhuǎn)化，基因治療均由一種目標(biāo)細(xì)胞和與其相關(guān)的基因傳遞載體組成，該基因傳遞載體具有編碼治療基因的核酸結(jié)構(gòu)。由此，對(duì)于上述的遺傳性疾病，“治療基因”代替了一個(gè)缺失或缺陷的宿主基因。因此，宿主細(xì)胞變?yōu)檗D(zhuǎn)化細(xì)胞，生產(chǎn)出基因產(chǎn)物，而此產(chǎn)物是受者本身細(xì)胞中不存在的。
0009體外與體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有很大的區(qū)別。體外宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，載體不直接進(jìn)入宿主體內(nèi)。因此，相對(duì)于載體直接進(jìn)入宿主身體，降低了與載體有關(guān)的惡性反應(yīng)的危險(xiǎn)。例如，基因治療成功的例子之一，W French Anderson和他的同事在體外情況下用一個(gè)基因編碼的腺苷脫氨酶(ADA)轉(zhuǎn)化SCID患者的T淋巴細(xì)胞。結(jié)果非常成功，以至于ADA轉(zhuǎn)化基因治療法已作為SCID的治療法(除美國(guó)之外)。(Anderson W F，Balese RM，Culver K.1990.ADA人體基因治療臨床方案對(duì)臨床草案反應(yīng)考慮要點(diǎn)，1990年7月6日。Hum Gene Ther Fall；1(3)331-62；見(jiàn)Balese RM，Culver KW，Chang L，Anderson WF，Mullen C，NienhuisA，Carter C，Dunbar C，Leitman S，Berger M等，1993。使用人ADA基因轉(zhuǎn)化的CD34+的自身固有的外周血細(xì)胞治療由于腺苷脫氨酶缺失所致的嚴(yán)重的免疫缺陷綜合癥(SCID)，改善的臨床研究方案，方案90-C-195，1992年1月10日。HumGene TherAug；4(4)521-7)。
0010令人遺憾的是，并非所有的遺傳性疾病都可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)化而得到很好的治療。另外，同體外重組治療產(chǎn)品一樣，體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化也是一個(gè)困難且費(fèi)時(shí)間的工作，不宜大范圍使用。因此，用于基因治療的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法同疫苗一樣也是一個(gè)較有活力的研究領(lǐng)域。
0011最初，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)集中在使用重組病毒載體，然而，當(dāng)Pennsylvania大學(xué)研究者對(duì)局部OTCD患者進(jìn)行體內(nèi)基因替換治療實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用病毒載體作為基因治療和疫苗的理論上的危險(xiǎn)性變的很明確(見(jiàn)Batshaw ML，Wilson JM，RaperS，Yudkoff M，Robinson MB.1999。局部OTCD患者體內(nèi)重組腺病毒基因轉(zhuǎn)化。美國(guó)費(fèi)城Pennsylvania大學(xué)臨床研究中心醫(yī)院19104。Hum Gene Ther Sep 20；10(14)2419-37)。在一次實(shí)驗(yàn)中，一位18歲的OTCD患者被給藥含有鳥氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)化載體，此載體假定不能復(fù)制且對(duì)人安全，令人遺憾的是，靜脈注射給藥4天后，患者出現(xiàn)大范圍的系統(tǒng)炎癥免疫反應(yīng)，最終死亡。
0012然而，嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)僅是與以病毒為基礎(chǔ)的、傳染性載體有關(guān)的許多安全問(wèn)題之一。其它的危險(xiǎn)包括繼發(fā)性腫瘤，重組形成復(fù)制性病毒，載體引起的全身免疫反應(yīng)使得以后使用該載體時(shí)功效降低或喪失。因此，研究者正致力于非病毒轉(zhuǎn)基因載體的研究。雖然非病毒載體不及病毒載體有效，但非病毒載體具有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)，如低毒、非限制性的轉(zhuǎn)基因位置、潛在的可定位性、較容易大量生產(chǎn)等。更重要的是，非病毒載體通常無(wú)免疫原性，可反復(fù)使用同一種載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
0013近年研究開發(fā)了一種體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和治療的新方法，它是利用重組天然正常菌群作為載體(見(jiàn)本發(fā)明人USPPASN60/353,885和60/353,923)。來(lái)源的微生物的載體包括(但不僅限于)乳酸菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、釀酒酵母等。這些載體優(yōu)點(diǎn)很多，因?yàn)檎Ｎ⑸锶壕哂泻艽蟮拿庖叨栊浴o(wú)致病性、較好的特征且存在于食物中，由此被管理機(jī)構(gòu)“一般認(rèn)為安全”(GARS)。另外，當(dāng)被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生免疫性的抗原時(shí)，不論是表面表達(dá)或是分泌表達(dá)，重組天然微生物載體將轉(zhuǎn)導(dǎo)它們攜帶的抗原直接到達(dá)免疫活性的細(xì)胞，如腸壁的M細(xì)胞。
0014另外，研究者開發(fā)了由人體致病菌衍生而得的細(xì)菌載體(與天然菌群不同)，包括志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、李斯特菌單胞質(zhì)基因(見(jiàn)例USPNs6,287,556；6,210,663和6,004,815)。但是，有潛在致病性的細(xì)菌所衍生的載體，盡管它們的細(xì)胞侵入性質(zhì)很吸引人，但其生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用時(shí)會(huì)對(duì)健康有危害。因此，由病原體所得的載體不能在人體醫(yī)學(xué)中廣泛使用。
0015不管是GARS菌(如正常菌群)還是減毒病原體(如腸道細(xì)菌)用于治療申請(qǐng)，載體本身必須安全且容易適應(yīng)變化的生產(chǎn)環(huán)境。其中最困難的挑戰(zhàn)是不使用以抗菌素抗性為基礎(chǔ)的選擇性標(biāo)記來(lái)開發(fā)細(xì)菌載體。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)一個(gè)細(xì)菌群被含轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，只有一小部分可以被成功轉(zhuǎn)化。因此，如何將轉(zhuǎn)化細(xì)菌與未轉(zhuǎn)化細(xì)菌區(qū)別開就顯得很重要。這需要一個(gè)選擇性標(biāo)記或鑒定標(biāo)記，或兩者均需。對(duì)于臨床應(yīng)用級(jí)載體，宜使用一個(gè)更合適的選擇性標(biāo)記。而最常用于分子生物學(xué)的選擇性標(biāo)記是抗生素抗性基因?？股乜剐曰蚺c質(zhì)體核酸相連接，通常在基因的下段，由同一啟動(dòng)子調(diào)控。但是此結(jié)構(gòu)也可變更。轉(zhuǎn)化之后，細(xì)菌群置于一個(gè)含殺菌或抑菌抗生素的培養(yǎng)基中，細(xì)菌成功的轉(zhuǎn)化將表達(dá)抗生素抗性基因；未轉(zhuǎn)化細(xì)菌無(wú)此功能。因此含治療基因的轉(zhuǎn)化細(xì)菌將很容易被鑒定出，進(jìn)而被純化。
0016這樣選擇的轉(zhuǎn)基因載體也同樣具有抗生素抗性基因(可存在于染色體外的質(zhì)粒或整合到其基因中)。每一種情況均有危險(xiǎn)—抗生素抗性標(biāo)記會(huì)被傳輸給宿主細(xì)胞或環(huán)境中其他微生物。另外，如果根據(jù)上述所引用的美國(guó)專利中的建議，將減毒腸道病原體作為載體，病原回復(fù)變異和抗生素抗性同時(shí)存在一個(gè)難以接受的公共健康問(wèn)題。因此，仍需要一種非病原的免疫惰性的轉(zhuǎn)基因載體在體內(nèi)高效表達(dá)，可以直接到達(dá)特殊的靶細(xì)胞，且不存在轉(zhuǎn)導(dǎo)抗生素抗性標(biāo)記到非目的宿主細(xì)胞的危險(xiǎn)。
發(fā)明概要0017本發(fā)明提供了將治療成分直接轉(zhuǎn)導(dǎo)到所需解剖位置的重組載體。本發(fā)明中的臨床應(yīng)用級(jí)載體來(lái)源于天然正常菌群，該天然微生物可分泌和/或表面表達(dá)治療性成分。按本發(fā)明的技術(shù)制備的傳遞載體由可表達(dá)及分泌治療蛋白的非致病性酵母或細(xì)菌組成。本發(fā)明的非致病性酵母或細(xì)菌載體與其它非致病性酵母或細(xì)菌載體相比具有明顯的優(yōu)越性。尤其是，本發(fā)明的非致病性酵母或細(xì)菌載體不使用抗生素作為重組細(xì)菌和/或酵母的選擇標(biāo)記。
0018按本發(fā)明技術(shù)制備的傳遞載體(delivery vector)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是避免基因向環(huán)境或體內(nèi)的酵母和細(xì)菌傳播。本發(fā)明也提供了運(yùn)送酵母和細(xì)菌載體到腸道及其他黏膜的方法及組成成分。
0019本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，載體的選擇是將天然菌群的一個(gè)或多個(gè)看家基因從基因組刪除或者使其不可操作。因此，缺少該基因功能的微生物不能生存和/或復(fù)制。
0020本發(fā)明另一具體實(shí)施例有功能的基因與質(zhì)粒上的目的基因相連，且由同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。本發(fā)明的微生物載體用帶有目的基因和看家基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可旺盛生長(zhǎng)，但未轉(zhuǎn)化者不能增殖。
0021本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例微生物載體的一個(gè)關(guān)鍵的復(fù)制酶發(fā)生突變，例如但不局限于胸苷酸合成酶(thyA)。
0022本發(fā)明的另一具體實(shí)施例臨床應(yīng)用級(jí)載體含有克隆到組成性啟動(dòng)子下游的報(bào)告基因作為檢測(cè)工具。適用于本發(fā)明的報(bào)告基因包括但不限于綠熒光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、淀粉酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。
0023上述載體以及根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)制備的載體被命名為“臨床應(yīng)用級(jí)載體”。此處所用的術(shù)語(yǔ)“臨床應(yīng)用級(jí)”是指載體沒(méi)有抗生素抗性基因或使用抗生素抗性作為篩選方法。另外，“臨床應(yīng)用級(jí)載體”也包括被設(shè)計(jì)成在宿主體外存活能力有限或不能存活的突變體。此處所說(shuō)的宿主是本發(fā)明中臨床應(yīng)用級(jí)載體的受者。在這一點(diǎn)上需要注意的是，許多微生物包括用來(lái)制備本發(fā)明中臨床應(yīng)用級(jí)載體的天然正常菌群常常自發(fā)對(duì)一種或多種抗生素有抗性。天然微生物表現(xiàn)出的抗生素抗性(先不管它的機(jī)制與遺傳元件)并非是此處所用的“抗生素抗性基因”。本發(fā)明所指的“抗生素抗性基因”是指賦予天然微生物抗生素抗性，從而作為選擇轉(zhuǎn)化微生物的方法。很明顯，本發(fā)明中作為臨床應(yīng)用級(jí)別載體的許多微生物也許天然存在抗生素抗性基因。
0024本發(fā)明另一具體實(shí)施例臨床應(yīng)用級(jí)載體可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)外源目的基因到宿主細(xì)胞。目的基因可編碼治療分子和轉(zhuǎn)基因，包括(但不局限于)激素(例如α-促黑色素細(xì)胞激素、胰島素、生長(zhǎng)激素和副甲狀腺激素)和細(xì)胞因子(干擾素、白細(xì)胞介素(IL)-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素)。
0025本發(fā)明另一具體實(shí)施例提供了治療或減輕動(dòng)物炎癥疾病的方法。
0026本發(fā)明另一具體實(shí)施例，炎癥疾病是眼葡萄膜炎，動(dòng)物包括但不限于靈長(zhǎng)類動(dòng)物、馬、牛、豬、羊、嚙齒動(dòng)物、魚及鳥類等。
0027本發(fā)明另一具體實(shí)施例通過(guò)給動(dòng)物用表達(dá)α-促黑色素細(xì)胞激素的臨床應(yīng)用級(jí)載體治療或減輕眼葡萄膜炎。


0028圖1和圖2描述了根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)而篩選的thyA-突變種。
0029圖3描述了革蘭氏陽(yáng)性表達(dá)載體pSYMX的構(gòu)建。
0030圖4描述了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)建的啤酒酵母表達(dá)載體p426GPD。
0031圖5描述了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)建的分泌α-促黑色素細(xì)胞激素的表達(dá)載體的流程圖。
0032圖6描述了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)建的酵母細(xì)胞顯示載體(pGPD-dsply)。
0033圖7A和7B描述了本發(fā)明中的表達(dá)載體整合到酵母基因組。
0034圖8描述了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)建的質(zhì)粒pSYMB6。
0035圖9描述了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)建的質(zhì)粒pSYMB3。
0036圖10描述了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)建的thyA刪除菌株和報(bào)告基因結(jié)構(gòu)。
專業(yè)術(shù)語(yǔ)的定義0037在陳述本發(fā)明之前，為更好的理解本發(fā)明，對(duì)文中將用到的某些術(shù)語(yǔ)先進(jìn)行定義。
0038此處定義的“抗生素抗性基因”包括提供給載體作為選擇系統(tǒng)的異源核酸序列。術(shù)語(yǔ)“抗生素抗性基因”不包括賦予自然微生物抗生素抗性的其他機(jī)制或基因。
0039此處定義的“臨床應(yīng)用級(jí)載體”表示由天然微生物的非致病細(xì)菌或酵母構(gòu)建成的用于傳遞治療性成分和/或基因的載體。本發(fā)明的臨床應(yīng)用級(jí)載體不使用抗生素抗性作為選擇標(biāo)記并且/或已被修飾使其在宿主外不能復(fù)制。
0040“可檢測(cè)的免疫反應(yīng)”是指動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)抗原的抗體反應(yīng)(體液的)或細(xì)胞毒反應(yīng)(細(xì)胞的)。該抗原可通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，包括(但不局限于)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫熒光測(cè)定(IFA)、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定(CF)、Western Blot(WB)。
0041此處定義的“目的基因”指編碼我們想要表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的核酸序列。“目的基因”可以包括或不包括啟動(dòng)子或其他的調(diào)節(jié)成分。
0042“基因治療”是指通過(guò)重組載體將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到動(dòng)物體內(nèi)的特定位置。目的基因可以是編碼治療或預(yù)防性多肽或蛋白質(zhì)的基因。其中包括(但不局限于)細(xì)胞因子、抗炎劑、抗增生劑、抗生素、新陳代謝抑制劑/增強(qiáng)劑、免疫活性抗原和片段。另外，“基因治療”同樣包括針對(duì)遺傳或非遺傳性疾病的基因置換技術(shù)。
0043“宿主”指本發(fā)明中治療成分的目的受體。宿主包括所有的動(dòng)物。具體地說(shuō)，宿主包括(但不局限于)靈長(zhǎng)類動(dòng)物、馬、牛、犬、貓、豬、羊、兔、嚙齒動(dòng)物、魚及鳥類等。
0044“看家基因”指在宿主基因組或染色體外DNA上的一個(gè)核酸序列，其表達(dá)只受啟動(dòng)子與RNA聚合酶之間的反應(yīng)控制，不需其他調(diào)控因子(組成性表達(dá))。本發(fā)明中的“看家基因”是細(xì)胞活性的基礎(chǔ)物質(zhì)。該基因發(fā)生突變或?qū)蛲耆珓h除后，細(xì)胞如缺少補(bǔ)充物質(zhì)就不能生長(zhǎng)，除非被有功能的基因轉(zhuǎn)化。
0045“免疫惰性”是指任何物質(zhì)，包括微生物(如正常菌群)不能引起宿主的明顯的免疫反應(yīng)。此處使用的免疫惰性材料包括不銹鋼，生物相容聚合物(如聚-L-丙交酯)，藥用級(jí)塑料和本發(fā)明中的微生物?！帮@著的免疫”反應(yīng)是指可能會(huì)限制或約束根據(jù)本發(fā)明技術(shù)研制的微生物載體在體內(nèi)應(yīng)用的任何免疫反應(yīng)?？蓹z測(cè)的免疫反應(yīng)不一定是“顯著的免疫反應(yīng)”。
0046“分離的核酸”是指與任何天然核酸分子或跨過(guò)三個(gè)基因片段的基因組具有不同結(jié)構(gòu)的核酸。因此它包含(a)一個(gè)具有天然基因組DNA分子部分序列的DNA分子，但其兩端序列與天然基因組中該序列兩端的序列不同；(b)核酸以某種方式整合到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的載體或基因組DNA中，所得的分子與任何天然的載體或基因組不同；(c)一個(gè)插入分子，如cDNA，基因組片段，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段，限制酶切片段；(d)一個(gè)重組核酸序列是雜合基因的一部分，如編碼融合蛋白的基因。不包括在此定義的是在(i)DNA分子，(ii)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，(iii)細(xì)胞克隆的混合物中的核酸分子，例如cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)。
0047“正常菌群”指與人體有關(guān)的天然非致病性細(xì)菌和酵母。非限制性舉例包括乳酸菌及酵母。這些細(xì)菌和酵母通常不刺激宿主及受體的免疫反應(yīng)，且普遍存在于所有動(dòng)物中。
0048兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的“同一性百分率(同源)”使用Karlin和Altschul運(yùn)算法則定義(Proc.Natl.Acad.Sci.US 872264-2268，1990)，以Karlin和Altschul運(yùn)算法則進(jìn)行修改(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。此運(yùn)算法則合并到NBLAST和XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST核苷研究應(yīng)用NBLAST程序，score＝100，字長(zhǎng)＝12，得到與發(fā)明中核酸分子相同的核苷序列。BLAST蛋白質(zhì)研究應(yīng)用XBLAST程序，score＝50，字長(zhǎng)＝3，得到與參考多肽相同的氨基酸序列(e.g.，SEQ ID NO2).。為獲得有間隙的基線達(dá)到比較的目的，使用Altschul中描述的Gapped BLAST程序(Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。當(dāng)利用BLAST和有缺口的BLAST程序時(shí)，使用每一程序的默認(rèn)參數(shù)(e.g.，XBLAST and NBLAST)。見(jiàn)http//www.ncbi.nim.nih.gov。
0049“報(bào)告基因”(reporter gene)是在編碼目的基因的核酸上整合一個(gè)核酸序列，提供轉(zhuǎn)化載體一個(gè)易于選擇的表型。報(bào)告基因的非限制性舉例包括(但不局限于)綠色熒光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、淀粉酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
0050“篩選標(biāo)記”指將一種可鑒定的特征(表型)提供給根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體。本發(fā)明的具體實(shí)施例中，篩選標(biāo)記是一個(gè)報(bào)告基因。
0051“選擇性標(biāo)記”，“選擇性基因”，“報(bào)告基因”，“報(bào)告標(biāo)記”(指下文所說(shuō)的“選擇性標(biāo)記”)指編碼表型特征的核酸序列，利用該表型特征可以快速鑒別和分離轉(zhuǎn)化的細(xì)菌載體。一般來(lái)講，根據(jù)本發(fā)明制備的“臨床應(yīng)用級(jí)”的細(xì)菌載體應(yīng)用的選擇性標(biāo)記不編碼抗生素抗性。
0052“轉(zhuǎn)基因”指利用cDNA技術(shù)，將一個(gè)基因以某種方式插入到細(xì)胞中，確使其功能、復(fù)制和遺傳均如正?；颉?br> 0053“轉(zhuǎn)化的核酸序列”指含編碼目的基因的核酸序列的質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)盒。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，此核酸序列可以編碼與某一缺陷或缺失的看家基因有關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，此轉(zhuǎn)化的核酸序列可編碼目的基因和看家基因?！稗D(zhuǎn)化的核酸序列”還可以被用于表示此發(fā)明的某一具體化的“轉(zhuǎn)基因”。“轉(zhuǎn)化的核酸序列”亦可包括啟動(dòng)子和其它調(diào)控元素的核酸序列。發(fā)明的詳述1.引言0054將治療成分和核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)到人體中特定的靶位是藥物發(fā)展工業(yè)面臨的挑戰(zhàn)。本發(fā)明人開發(fā)了由非病原性微生物組建的臨床應(yīng)用級(jí)載體，該微生物能夠在表面表達(dá)或分泌治療性的肽和/或蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，非病原微生物包括(但不局限于)革蘭氏陽(yáng)性乳酸菌(LAB)例如嗜酸乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌、德氏乳桿菌屬保加利亞菌、瑞士乳桿菌、Lactobacillus pentosus、發(fā)酵乳桿菌、Lactobacillus amylovorus、乳球菌、Lactococcuscremoris、鏈球菌、戈氏鏈球菌；革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、新月莖菌和酵母。
0055本發(fā)明包含新的成分及其制備和使用方法。在本發(fā)明的實(shí)施例中，此臨床應(yīng)用級(jí)載體使用非致病性微生物構(gòu)建。此非病原菌包括乳酸菌、大腸桿菌、新月莖菌和啤酒酵母。此臨床應(yīng)用級(jí)載體可被編碼具有治療功能的蛋白質(zhì)或多肽基因轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的臨床應(yīng)用級(jí)載體可被用于局部的或全身的治療或減輕疾病。
0056在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，治療性蛋白如(但不局限于)抗炎劑、神經(jīng)肽、白細(xì)胞介素，都可提呈到所需位置。在列舉的一個(gè)非限制性實(shí)例中，本發(fā)明用于轉(zhuǎn)導(dǎo)重組α-促黑色素細(xì)胞激素到眼部，用于治療眼葡萄膜炎。
0057按照本發(fā)明的技術(shù)使用時(shí)，乳酸桿菌(LAB)是轉(zhuǎn)導(dǎo)治療成分及其相應(yīng)的核酸的理想候選載體。簡(jiǎn)言之，LAB是哺乳動(dòng)物胃腸道中正常寄生的微生物，在宿主微生態(tài)學(xué)上扮演重要角色，且被認(rèn)為具有明確的治療作用。這些治療性質(zhì)包括(但不局限于)內(nèi)臟微生態(tài)學(xué)、生理、免疫調(diào)節(jié)和抗菌效應(yīng)。其他LAB相關(guān)的特征包括釋放到腸腔的酶與LAB粘附物互相促進(jìn)來(lái)減輕腸吸收障礙的癥狀。另外，LAB酶幫助調(diào)節(jié)腸道pH值，促進(jìn)芳香族氨基酸的降解。[Fuller，R.益生菌食物—現(xiàn)在的使用與未來(lái)的發(fā)展，IFI NR 323-26(1993)；Mitsuoka，T.雙歧桿菌的分類學(xué)和生態(tài)學(xué)。雙歧桿菌微生物311(1984)；Gibson，G.R.et al.，益生菌和腸道感染，p.10-39.In R.Fuller(ed.)，Probiotics 2Applications and practical aspects.Chapman and Hall，London，U.K.(1997)；Naidu AS，et al.，乳酸菌的益生菌譜(LAB).Crit Rev Food Sci Nutr 393-126(1999)；Naidu，A.S.，Clemens，R.A.Probiotics，p.431-462.In A.S.Naidu(ed.)，天然食品抗菌系統(tǒng)Natural Food AntimicrobialSystems.CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(2000)].本發(fā)明所指的乳酸菌包括鏈球菌、腸球菌、乳球菌、乳酸桿菌、明串珠菌、小球菌和雙歧菌。
0058一般來(lái)講，正常微生物群作為體內(nèi)使用的重組載體有許多優(yōu)點(diǎn)。正常微生物群是非致病性的，具有免疫惰性，有很好的表型和遺傳型特征。微生物通常不需要復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)，且繁殖較快，因此它們適用于大規(guī)模的生產(chǎn)。而微生物普遍存在于食物和天然產(chǎn)品中，人類食用通常認(rèn)為安全(GARS)。但目前的細(xì)菌載體，包括LAB，使用抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記，因而不適于體內(nèi)使用。本發(fā)明提供了不需使用抗生素抗性基因作為鑒定轉(zhuǎn)化株的方法。
0059選擇標(biāo)記為研究者和技術(shù)人員提供了一個(gè)區(qū)別混合群中的轉(zhuǎn)化微生物和未轉(zhuǎn)化微生物的便利的方法。最古老且最有效的鑒別轉(zhuǎn)化微生物的方法是將一個(gè)可選擇標(biāo)記的核酸序列整合到含有目的基因的質(zhì)粒中。選擇標(biāo)記序列通常插入目的基因的下游且受同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。結(jié)果，目的基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將同樣被選擇標(biāo)記核酸序列轉(zhuǎn)化。如抗生素抗性被用作選擇標(biāo)記，僅有已轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以在含抗生素的培養(yǎng)基中存活和/或生長(zhǎng)。
0060當(dāng)開發(fā)轉(zhuǎn)化株時(shí)，抗生素抗性是一個(gè)便利且有用的表型。然而，用抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記的載體，可能發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，賦予其他微生物抗生素-抗性表型。當(dāng)用微生物如LAB作為治療性載體時(shí)，危險(xiǎn)性很大。因此，管理機(jī)構(gòu)不允許在活的減毒疫苗種中使用抗生素-抗性標(biāo)記。
0061為使用正常微生物群作為人體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，本發(fā)明人發(fā)明臨床應(yīng)用級(jí)載體系統(tǒng)，它不使用抗生素選擇標(biāo)記。本發(fā)明中取代抗生素抗性作為選擇標(biāo)記的臨床應(yīng)用級(jí)載體在關(guān)鍵的看家基因中有染色體刪除或致命突變。進(jìn)而將一個(gè)有功能的看家基因插入到編碼目的基因的質(zhì)粒。因此，看家基因成為快速鑒別和分離轉(zhuǎn)化株的選擇性標(biāo)記。基礎(chǔ)的看家基因可以編碼任何代謝調(diào)節(jié)劑和/或酶類，包括(但不局限于)激酶、蛋白酶、合成酶、脫氫酶和其它酶類。本發(fā)明提供的取代抗生素抗性基因的另一種臨床應(yīng)用級(jí)別載體是將報(bào)告基因整合到含有目的基因的質(zhì)粒中。本發(fā)明描述的報(bào)告基因包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、淀粉酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。
0062本發(fā)明的另一具體實(shí)施例中，相似的看家基因與靶基因包含在一個(gè)整合表達(dá)盒中(integrated expression cassette)。該整合表達(dá)盒被結(jié)合到宿主基因組DNA中，而不是染色體外質(zhì)粒中。
0063本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，臨床應(yīng)用級(jí)載體選擇了胸苷酸合成酶(胸苷酸合成酶)的基因。DNA合成需要胸苷酸合成酶。它刺激dUMP和5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為dTMP和7，8-二氫葉酸。胸苷酸合成酶突變株在缺乏或含有少量的胸苷或胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明人選擇乳桿菌的胸苷酸合成酶突變株開發(fā)本發(fā)明中的臨床應(yīng)用級(jí)選擇系統(tǒng)。細(xì)菌學(xué)家和分子生物學(xué)家也廣泛了解如何檢測(cè)特異缺失突變株的細(xì)菌菌群.。簡(jiǎn)言之，胸苷酸合成酶突變株的鑒別是以三甲氧芐二氨嘧啶的抗性為基礎(chǔ)，其阻礙了通過(guò)胸苷酸合成酶基因產(chǎn)品使5，10-亞甲基四氫葉酸到7，8-二氫葉酸的轉(zhuǎn)化。(見(jiàn)Fu，X和JG Xu.2000。利用胸苷酸合成酶基因作為選擇性標(biāo)記，開發(fā)嗜酸乳桿菌的染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)。Microbiol.Immunol.44(7)，551-556)為選擇甲氧芐氨嘧啶抗性突變株(thyA突變株)，乳酸菌(LAB)在一個(gè)含20μg/ml甲氧芐氨嘧啶和50μg/ml胸腺嘧啶的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(圖1)。然后甲氧芐氨嘧啶-抗性突變株用包含胸苷酸合成酶基因的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株在改良的無(wú)腺嘧啶MRS培養(yǎng)基中被選擇出來(lái)。
0064與本發(fā)明表述相一致的整合表達(dá)盒可被整合到酵母和細(xì)菌染色體中。例如，異源基因一般可以在游離基因質(zhì)粒表達(dá)到酵母中，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定性需要持續(xù)不斷的選擇性壓力，這種壓力通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中成分產(chǎn)生。雖然可以在體外控制生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的成分，但體外營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)通常并不可能實(shí)現(xiàn)。因此，可能出現(xiàn)酵母細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒的缺失和酵母蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)功能的降低。為了解決這一潛在的問(wèn)題，本發(fā)明人已設(shè)計(jì)出利用同源重組將表達(dá)試劑盒整合到酵母染色體之中的新方法。染色體的整合使表達(dá)試劑盒穩(wěn)定存在，且改變對(duì)特殊設(shè)計(jì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的要求。染色體整合的一個(gè)尤為重要的優(yōu)點(diǎn)是防止DNA分子水平轉(zhuǎn)移到其它酵母菌株或種屬。
0065為將表達(dá)試劑盒整合進(jìn)入酵母染色體之中提供了兩種方法。其中實(shí)施例之一是提供一個(gè)整合的載體，此載體缺乏在酵母中復(fù)制必需的序列，但包含一個(gè)特殊染色體位點(diǎn)的同源序列。一旦轉(zhuǎn)入到酵母中，此整合的載體在同源染色體位點(diǎn)通過(guò)同源重組進(jìn)入染色體(見(jiàn)圖7B)。然而，目標(biāo)染色體序列也有可能在表達(dá)盒染色體整合上被復(fù)制(見(jiàn)7A)。這些已復(fù)制序列之間的染色體內(nèi)同源重組可以顛倒表達(dá)盒的染色體結(jié)合，得到表達(dá)盒。
0066因此，本發(fā)明人提供了可選擇的方法，使表達(dá)盒缺失最小化。在本發(fā)明的實(shí)施例中，在缺失質(zhì)粒的情況下，表達(dá)盒被作為一個(gè)PCR產(chǎn)物整合，見(jiàn)圖7B。染色體結(jié)合由PCR產(chǎn)品末端序列促成，與染色體目標(biāo)位置的側(cè)位序列同源。因此，此方法提供了同源重組目標(biāo)序列的基因轉(zhuǎn)化，使得染色體結(jié)合不能取消。
0067前述的非限制性樣例適用于其他的臨床受體，其受體包括裸露質(zhì)粒DNA或整合表達(dá)盒。但是，下述本發(fā)明中的非限制性示范實(shí)施例的四種不同生物體將被使用。這些是革蘭氏陰性菌大腸桿菌和新月莖菌，革蘭氏陽(yáng)性乳酸乳球菌，以及酵母。酵母內(nèi)表達(dá)應(yīng)在游離基因載體上，同樣在進(jìn)入酵母染色體的整合載體上。每一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)所用的載體可購(gòu)買或由已知的技術(shù)制備。每一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的詳細(xì)情況列于下表1。
表1 本發(fā)明的示范載體

1Invitrogen Life Technologies 1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA 920082Lu，Z.et al.(1995)Bio/Technology 13366-3723Mumberg D.et al.(1995)Gene 156119-1224Yim et al.(1998)Methods Cell Sci.2013-20.
0068表1中的非限制性示范表達(dá)載體和質(zhì)粒用下述疾病模型來(lái)測(cè)試臨床功效。測(cè)試分泌型和表面型表達(dá)模型。正如前面所討論的，本發(fā)明的臨床應(yīng)用級(jí)別載體可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼治療成分的目的基因，包括(但不局限于)激素和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因，(包括但不限于干擾素、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-12、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、胰島素、成長(zhǎng)激素和副甲狀腺激素)。
0069本發(fā)明的臨床應(yīng)用級(jí)別載體的另一方面包括提供載體，該載體可以減少或消除轉(zhuǎn)基因成分?jǐn)U散到環(huán)境中或包括細(xì)菌和酵母菌的微生物中去。治療蛋白表達(dá)的未控制傳播可能導(dǎo)致不理想的副反應(yīng)。因此，本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計(jì)了有效阻止表達(dá)載體散布的方法與成分。
0070在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)盒整合到細(xì)胞(載體)的生長(zhǎng)基礎(chǔ)位置。例如，胸苷酸合成酶位點(diǎn)可能通過(guò)整合而中斷，由此使載體微生物的生長(zhǎng)需要有胸苷的條件。如果胸苷缺失，載體在宿主中生命期將受到限制。
0071在另一個(gè)實(shí)施例中，在微生物中控制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這也許可以通過(guò)操縱轉(zhuǎn)導(dǎo)微生物攜帶可誘導(dǎo)毒素基因來(lái)完成。微生物一旦誘導(dǎo)進(jìn)入宿主，且轉(zhuǎn)導(dǎo)治療蛋白到目標(biāo)位置，細(xì)胞即可通過(guò)毒素基因的表達(dá)的而被清除。一種非常好的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是Peter Quail(UC Berkeley)描述的光激活的啟動(dòng)子(Shimizu-Sato S.，Huq E.，Tepperman J.M.，and Quail P.H.(2002)，Nature Biotech.201041-1044)。該啟動(dòng)子系統(tǒng)的激活依賴無(wú)毒性載色體的存在。毒性基因的表達(dá)可在提供的載色體條件下誘導(dǎo)；在動(dòng)物腸道排泄物中排出微生物載體，激活毒性基因并清除重組微生物。在本發(fā)明中的臨床應(yīng)用級(jí)別載體使用的另一個(gè)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括(但不局限于)pH誘導(dǎo)啟動(dòng)子(見(jiàn)美國(guó)專利No.6,242,194 issued to Kullen等)；大腸桿菌質(zhì)粒中使用的乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子(例如pBluescript from Stratagene)或乳酸菌中的內(nèi)源乳糖啟動(dòng)子；在厭氧生長(zhǎng)條件下的啟動(dòng)子，如乙醇脫氫酶(adhE)啟動(dòng)子。見(jiàn)Aristarkhov，A.等等，″乙醇脫氫酶(adhE)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯產(chǎn)生乙醇脫氫酶需要的RNA酶在大腸桿菌中的修飾″J.Bacteriology，Vol.178，No.14，4327-4332。
0072毒性基因的非限制性樣例包括可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的細(xì)菌自溶素。溶素基因可以通過(guò)使用一個(gè)或多個(gè)上述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子在胃腸道中合適的時(shí)間與位置激活。溶血基因樣例包括但不限于AcmA(Buist G.等，(1997)″通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)剩生產(chǎn)自溶血素達(dá)到乳酸菌的自我分解″Appl.Environ.Microbiol，6327222728)；holin和細(xì)胞溶解酶(Henrich，B.等，(1995)″格氏乳酸菌抗菌素～抗利尿激素裂解基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能分析″J.Bacteriology，Vol.177，No.3，723732)。酵母毒性基因能夠殺死SMK1毒性基因(Suzuki C等，釀酒酵母中殺傷基因SMK1表達(dá)的致命作用.Protein Eng 2000，1373-6)。另外，過(guò)量表達(dá)哺乳動(dòng)物pro-apoptotic Bcl-2家族蛋白Bax的可導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡(Zha等.，酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中proapoptotic蛋白Bax的結(jié)構(gòu)-功能比較。Mol Cell Biol 1996，166494-508)。
0073對(duì)氧敏感的微生物工程菌是能夠限制臨床應(yīng)用級(jí)別載體擴(kuò)散的另一個(gè)方法。人體內(nèi)臟環(huán)境含氧量較低，適合于厭氧微生物的生長(zhǎng)，包括本發(fā)明中的細(xì)菌微生物。因此，一旦從人體腸道排泄物中進(jìn)入氧含量豐富的外部環(huán)境，消除微生物傳遞載體的有效方法就是將工程基因轉(zhuǎn)入對(duì)氧敏感的載體微生物中。
0074另外，本發(fā)明的臨床應(yīng)用級(jí)載體可以通過(guò)感染噬菌體產(chǎn)生裂解。適當(dāng)?shù)氖删w非限制性樣例包括φadh，φLC3，mv4，M13，T4，φ29，Cp-1，Cp-7，and Cp-9。在工程細(xì)菌攝入數(shù)小時(shí)或數(shù)天后引入噬菌體。第一次攝入細(xì)菌培養(yǎng)基可以在腸道內(nèi)定殖和擴(kuò)增。被噬菌體感染的第二次細(xì)菌培養(yǎng)應(yīng)在第一次培養(yǎng)之后數(shù)小時(shí)或數(shù)天后再進(jìn)行。當(dāng)噬菌體裂解腸內(nèi)細(xì)胞時(shí)，噬菌體微?？梢赃M(jìn)一步影響和裂解工程菌，因此防止遺傳物質(zhì)向周圍環(huán)境的擴(kuò)散。
0075本發(fā)明示范性實(shí)施例包括但不限于下列治療蛋白質(zhì)
1α-促黑色素細(xì)胞激素(α-MSH)α-MSH是一個(gè)神經(jīng)肽，作為神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的信號(hào)分子。此分子對(duì)控制發(fā)熱、急性反應(yīng)、免疫和炎癥的中樞和外周反應(yīng)非常重要。
2白細(xì)胞介素(IL)-10白細(xì)胞介素(IL)-10是最早認(rèn)識(shí)的“細(xì)胞因子合成抑制因子”(CSIF)，它由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，而且抑制Th1細(xì)胞生產(chǎn)干擾素γ(IFNγ)、白細(xì)胞介素(IL)-2和腫瘤壞死因子(TNFβ)。IL-10同樣可以抑制引起炎癥的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如IL-1α，IL-1β，IL-6 and TNFα，還有趨化因子如IL-8。由于有這些抗炎活性，補(bǔ)充IL-10可以潛在地用于治療炎癥和自體免疫疾病的治療。我們的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可以用于將IL-10轉(zhuǎn)導(dǎo)到體內(nèi)。人體IL-10由160個(gè)氨基酸組成，分子量是18.5KD。人體IL-10在很大程度上與牛、鼠、羊的IL-10序列同源，但存在種屬特異性，因?yàn)槿梭wIL-10不能與鼠的IL-10受體結(jié)合。對(duì)于IL-10活性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，我們將克隆和表達(dá)鼠的IL-10cDNA。
表2 本發(fā)明的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

實(shí)施例0076本發(fā)明用下列例子進(jìn)行舉例說(shuō)明。這些例子是僅為了舉例說(shuō)明的目的，而不是有意限制本發(fā)明。
實(shí)施例1細(xì)菌和酵母菌種及其生長(zhǎng)培養(yǎng)基0077細(xì)菌和酵母菌種及其生長(zhǎng)培養(yǎng)基大腸桿菌K12菌株Top10F’(Invitrogen)用于克隆。使用下列菌株作表達(dá)大腸桿菌GI826(為pFliTrx-基礎(chǔ)載體)，莖細(xì)菌JS4000，干酪乳桿菌，植物乳桿菌，短乳桿菌，嗜酸乳桿菌和乳球菌和其的亞種，釀酒酵母菌株W303-1a(為p426GPD-基礎(chǔ)表達(dá)載體)和Eby100(Invitrogen，為pYD1-基礎(chǔ)表達(dá)載體)。酵母可在YPD或選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從Qbiogene購(gòu)買。大腸桿菌在添加氨芐(50-100μg/ml)或氯霉素(2-15μg/ml)的LB或RM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(for pFLiTrx系統(tǒng))，；莖細(xì)菌在添加氯霉素的M11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Invitrogen)；乳桿菌在添加紅霉素(2-50μg/ml)的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；乳球菌在添加0.1％葡萄糖和紅霉素(2-50μg/ml)M17的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。酵母菌的轉(zhuǎn)化根據(jù)http//www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/method.html.中的手冊(cè)完成。細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化通過(guò)Raya等描述的方法(1992，J.Bact.174(17)5584-5592)。
實(shí)施例2-14質(zhì)粒結(jié)構(gòu)0078所有的限制酶和DNA修改酶均購(gòu)于New England Biolabs。Hotstart pfu和Hotstart Herculase聚合酶購(gòu)于Stratagene。寡聚核苷酸購(gòu)于Genset Oligos，測(cè)序由Qiagen測(cè)序服務(wù)完成。下面所列的所有結(jié)構(gòu)均通過(guò)測(cè)序進(jìn)行校驗(yàn)。所有的質(zhì)粒DNA制備使用Qiagen公司的miniprep kit完成。
實(shí)施例2質(zhì)粒pCX-MSH的制備0079為了在pCX表達(dá)載體中表達(dá)MSH，合成了兩個(gè)包含下列成分的互補(bǔ)的寡核苷酸0080在5’-端的-Bgl II識(shí)別位點(diǎn)，在3’-端的Not I識(shí)別位點(diǎn)。
0081編碼人α-MSH的基因序列，經(jīng)修飾后包含優(yōu)化的密碼子，可在原核細(xì)胞和酵母菌中最優(yōu)化表達(dá)。
0082連接序列由聚甘氨酸和絲氨酸或丙氨酸組成，可保證α-MSH在融合蛋白中的構(gòu)像穩(wěn)定性。
0083兩個(gè)寡核苷酸之一的序列為(SEQ ID NO1)MSHUP SEQ ID NO 3(5’-AGA TCTGGT GGC GGT GGC TCT TAT TCT ATG GAA CAT TTT CGT TGGGGT AAA CCT GTT GGT GGC GGTGCGGCC GCG-3’)。將等量的MSH-編碼的寡核苷酸混合和退火。修飾的pCX用限制酶Bgl II和酶切線性化，同樣的限制酶消化α-MSH基因，用退火后的α-MSH基因片段連接pCX，轉(zhuǎn)入大腸桿菌。
實(shí)施例0084編碼MSH序列的三個(gè)串聯(lián)考貝的雙鏈核苷酸通過(guò)5或6個(gè)氨基酸分開，由Retrogen Inc合成并克隆到PCRBlunt(Invitrogen)質(zhì)粒中得到PCRBluntMSH。其中核苷酸鏈的有意義鏈見(jiàn)SEQ.ID NO2Arg Ser Leu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ser Met Glu His Phe ArgAGA TCTCTA GATGGT GGC GGT GGC TCT TAT TCT ATG GAA CAT TTT CGTBgl II XbaITrp Gly Lys Pro Val Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ser Tyr Ser Met GluTGG GGT AAA CCT GTT GGT GGC GGTGCG GCC GCGTCT TAT TCT ATG GAANotIHis Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Tyr SerCAT TTT CGT TGG GGT AAA CCT GTT GGT GGT GGC GGT GGC TCT TAT TCTMet Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Glu Leu GluATG GAA CAT TTT CGT TGG GGT AAA CCT GTT GGTGAGCTC GAGSacI XhoITAAGGA TCCBamHI0085用BgIII/Xhol酶消化3MSH，分離片段并將其亞克隆到用同樣酶消化的pCX載體(Invitrogen)上，構(gòu)建pCX-3MSH實(shí)施例4質(zhì)粒pSYMB3的制備0086質(zhì)粒pSYMB3包含一個(gè)MSH分泌盒，該分泌盒由干酪乳桿菌乳酸脫氫酶基因啟動(dòng)子(Pldh)、Lb.amylovorus淀粉酶A基因的分泌信號(hào)和編碼MSH三個(gè)串聯(lián)考貝的序列組成。此質(zhì)粒構(gòu)建如下所述首先，通過(guò)兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈核苷酸雜交形成一個(gè)252bp的雙鏈寡核苷酸，將其克隆到pCR-Blunt載體中。所得質(zhì)粒是pCR-Blunt/P-ss。P-ss包含LDH啟動(dòng)子，分泌信號(hào)和淀粉酶A基因的前10個(gè)密碼子。在Pss片段的5’和3’端引入EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)。Pss端的序列顯示如下(SEQ ID NO3.EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)被加下劃線)。5’-GAATTCTGAAAAAGTCTGTCAATTTTGTTTCGGCGAATTGATAATGTGTTATACTCACAATGAAATGCAGTTTGCATGCACATAAGAAAGGATGATATCACCGTGAAAAAAAAGAAAAGTTTCTGGCTTGTTTCTTTTTTAGTTATAGTAGCTAGTGTTTTCTTTATATCTTTTGGATTTAGCAATCATTCTAAACAAGTTGCTCAAGCGGCTAGCGATACGACATCAACTGATCACTCAAGCAATGGTACC-3’然后，Pss片段通過(guò)EcoRI/KpnI酶切位點(diǎn)亞克隆到質(zhì)粒pUC19中。所得到的質(zhì)粒命名為pSYMB1。為了得到MSH序列，以PCRBluntMSH做模板，用tri-MSH核苷酸來(lái)擴(kuò)增三-MSH。(5’-GGGGTACCAGATCTCTAGATGGTGGC-3’，[SEQ IDNO4下劃線是KpnI識(shí)別位點(diǎn))，Tri-MSHRev(5’-CCCAAGCTTGGATCCTTACTCGAGCTCACC-3’，[SEQ ID NO5].下劃線是HindIII識(shí)別位點(diǎn))。得到的PCR產(chǎn)物用KpnI/HindIII酶消化，將其克隆到pSYMB1的相同位點(diǎn)，用amyA分泌序列得到pSYMB2。最后，為了得到pSYMB3，pSYMB2經(jīng)EcoRI/HindIII酶切后的片段中分離出MSH表達(dá)盒，將其克隆到用同樣的酶切的穿梭載體pSYMB中。
實(shí)施例5質(zhì)粒pSYMB4的制備0087構(gòu)建pSYMB4質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增三倍的MSH序列(見(jiàn)上)并將其克隆到pSYMB的XbaI/HindIII位點(diǎn)。
實(shí)施例6質(zhì)粒pXYMX的制備0088質(zhì)粒PSYMX是一個(gè)可在革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌中復(fù)制的穿梭載體。此載體的不同成分組合在質(zhì)粒pBC SK(+)(Stratagene)上；這些成分列如下0089金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pE194(ATCC)的抗性基因(Em)-從pWV01(ATCC)得到的復(fù)制革蘭氏陽(yáng)性菌復(fù)制源。
0090干酪乳桿菌的胸苷酸合成酶基因，在胸苷酸合成酶突變宿主中提供一個(gè)臨床應(yīng)用級(jí)選擇系統(tǒng)。
0091splA基因的轉(zhuǎn)錄終止序列，來(lái)自于短乳桿菌(ATCC 8287)(tslp)0092干酪乳桿菌乳酸脫氫酶基因啟動(dòng)子(Pldh)和分泌信號(hào)來(lái)自于Lb.amylovorus(-ss)淀粉酶A基因。
0093上述不同的成分被裝配到pBC SK(+)上，如下(同樣見(jiàn)圖3)從pE194的ClaI/HpaII酶切片段中分離Em基因，且將其克隆到也用ClaI酶剪切的pBC SK(+)中)，得到pBCE。這一結(jié)構(gòu)的結(jié)果是pBCE僅有一個(gè)ClaI酶切位點(diǎn)，是因?yàn)镃laI和HpaII DNA ends的雜交和后來(lái)的連接破壞了兩種酶的識(shí)別位點(diǎn)。
0094然后，pWV01復(fù)制起始在ClaI酶切片段上分離，將其克隆到同樣酶切的pBCE。在此結(jié)構(gòu)中為了包含thyA基因，利用引物thyAPstIFor SEQ ID NO 6)(5’-AACTGCAGTGCAGGCACAGCTTGATGCG-3’)和thyAHindIIIRev SEQ IDNO 7(5’-cccaagc ttCCTTTTGTGTCATTGGTAAACC-3’)，從干酪乳桿菌染色體中通過(guò)PCR擴(kuò)增，經(jīng)PstI和HindIII酶消化，將其克隆到相同酶切的pBCEW得到pBCEWT。tslp是通過(guò)重疊PCR方法構(gòu)建(見(jiàn)下面質(zhì)粒pgpdl-msh的制備及圖五對(duì)此方法的一般描述)，使用引物tslpABamHI/PstIup SEQ ID NO 8(5’-TGATAATTATTATTTAGGTGAGCTTTGTTGATAAAAAGGTCTTTTCAACGTTTATGTTGGGGAGACC-3’)tslpABamHI/PstIlow SEQ ID NO 9(5’-GTTTTTCCTAACAAAGGCCTAATFTTTTCAATATAAAAAGGTCTCCCCAACATAAACGTTGAAAAGACC-3’)作為長(zhǎng)引物，tslpABamHIFor SEQ ID NO 10(5’-CGGGATCCTGATAATTATTATTTAGGTG-3’)tslpAPstIRev SEQ ID NO 11(5’-AACTGCAGGTTT TTCCTAACAAAGGCC-3’)作為外圍PCR引物。最終的tslp PCR產(chǎn)物用BamH I和Pst I兩種酶消化且克隆到相同的酶切的pBCEWT，得到pBCEWTt。
0095為了得到干酪乳桿菌乳酸脫氫酶(LDH)啟動(dòng)子(ATCC 393)及Lb.amylovorus(-ss)淀粉酶A的分泌信號(hào)，通過(guò)兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈核苷酸雜交形成一個(gè)252bps雙鏈寡核苷酸(P-ss)( )并將其克隆到pCR-Blunt載體中。所得質(zhì)粒是pCR-Blunt/P-ss。P-ss包含LDH啟動(dòng)子，連接著分泌信號(hào)和淀粉酶A基因的前10個(gè)密碼子。Pss末端序列顯示如下SEQ ID NO 125’-GAATTCTGAAAAAGTCTGTCAATTTTGTTTCGGCGAATTGATAATGTGTTATACTCACAATGAAATGCAGTTTGCATGCACATAAGAAAGGATGATATCACCGTGAAAAAAAAGAAAAGTTTCTGGCTTGTTTCTTTTTTAGTTATAGTAGCTAGTGTTTTCTTTATATCTTTTGGATTTAGCAATCATTCTAAACAAGTTGCTCAAGCGGCTAGCGATACGACATCAACTGATCACTCAAGCAATGGTACC-3’0096最后，完成構(gòu)建pSYMX，利用寡核苷酸P-ssSacIIFor SEQ ID NO 13(5’-TCCCCGCGGTGAAAAAGTCTGTCAATTTTG-3’)和P-ssXbaIRev SEQ IDNO 14(5’-GCTCTAGAA TTGCTTGAGTGATCAGTTG-3’)，從pCR-Blunt/P-ss PCR擴(kuò)增P-ss分泌信號(hào)，SacII和XbaI酶消化并克隆到相同酶切的pBCEWTt載體中。
實(shí)施例7質(zhì)粒pSYMX-MSH的制備0097兩個(gè)寡核苷酸MSH/XBAI/BAMHIUP SEQ ID NO15(CTAGATCTTATTCTATGGAACATTTTCGTTGGGGTAAACCTGTTTAATGAG’-3’)和MSH/XBAI/BAMHILOW SEQ ID NO 16(5’-GATCCTCATTAAACAGGTTTACCCCAACGAAAATGTTCCAGAGAATAAGAT-3’)雜交形成一個(gè)編碼MSH的雙鏈DNA分子，且克隆到表達(dá)載體PSYMX相同的末端。將此雙鏈DNA分子克隆到pSYMX的XBAI/BAMHI酶切位點(diǎn)得到pSYMX-MSH。
實(shí)施例8質(zhì)粒pSYMX-IL-10的制備0098，利用引物IL-10XbaIFor SEQ ID NO 17(5’-TCATCTAGAAAAGCAGGGGCCAGTAC AGC-3’)和IL-10BamHIRev SEQ IDNO 18(5’-CCCGGATCCTTAGCTTTTCATTTTGATC-3’)，從一個(gè)鼠淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中PCR擴(kuò)增鼠IL-10的cDNA。IL-10PCR產(chǎn)物用XbaI和BamHI酶消化并連接到相同酶切的pSYMX-MSH載體。所得質(zhì)粒是pSYMX-IL-10，其中一個(gè)編碼IL-10的融合基因融合到的N-末端淀粉酶一個(gè)序列上。除分泌信號(hào)和啟動(dòng)子用于本發(fā)明革蘭氏陽(yáng)性構(gòu)建外，本發(fā)明人同樣使用擁有短乳桿菌slpA-表層蛋白的分泌信號(hào)和啟動(dòng)子的載體建造，ATCC 8287(美國(guó)馬納薩斯洲梵地岡模式菌種收集)和/或編碼一個(gè)分泌蛋白質(zhì)usp45的分泌信號(hào)，該蛋白來(lái)自乳球菌亞種lactis mg1363)。
實(shí)施例9酵母MSH表達(dá)載體的制備0099構(gòu)建三種不同MSH衍生質(zhì)粒。pGPDL-MSH包含20個(gè)氨基酸，該氨基酸來(lái)自于分泌酵母α-偶連因子的前導(dǎo)序列融合到MSH編碼序列。在質(zhì)粒pLong MSH和pLongα-sp-MSH中，α-偶連因子的序列延伸到85氨基酸，包含Kex2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，從MSH α-前導(dǎo)序列中除去。與此相比，pGPDL-MSH促進(jìn)MSH的表達(dá)該MSH以α-偶連因子前20個(gè)氨基酸的融合形式分泌。MSH序列與pGPDL-MSH和pLong α-sp-MSH的α-前導(dǎo)序列以兩個(gè)氨基酸間隔分離開；但在pLongα-MSH中，α-前導(dǎo)肽直接融合到MSH。
0100構(gòu)建GPDL-MSH如下通過(guò)重疊PCR方法構(gòu)建α-leader-α-MSH的融合(圖5)。兩個(gè)長(zhǎng)寡核苷酸，ALPHALEADER(SEQ ID NO19)和MSHPEPTIDE(SEQ ID NO20)通過(guò)3’-端互補(bǔ)結(jié)合。ALPHALEADER(SEQ ID NO19)(ATGAGATTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTAGCT GCTGGT GCTTCT TAC TCT ATG)編碼α-前導(dǎo)肽，跟隨著兩個(gè)氨基酸間隔基和α-MSH的前四個(gè)氨基酸。MSHPEPTIDE(SEQ ID NO20)(TTA AAC TGG CTT ACC CCA TCT GAA GTGTTC CAT AGA GTA AGAAGCACCAGC AGC TAA TGC)包含MSH基因的非編碼鏈，跟隨ALPHALEADER寡核苷酸的3’-端的互補(bǔ)序列。在PCR反應(yīng)中，上述提到的長(zhǎng)核苷酸雜交并形成一個(gè)模板，利用pfu聚合酶構(gòu)建一個(gè)編碼α-leader-α-MSH融合蛋白雙鏈分子。在同一個(gè)PCR管中，包含兩個(gè)附加PCR擴(kuò)增寡核苷酸，擴(kuò)增融合結(jié)構(gòu)，同時(shí)提供了用于克隆的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。PCR用的寡核苷酸是PCR fwd(SEQ ID NO21)(GGGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC)，和PCR rev(SEQ ID NO22)(GGAAGCTTTTAAACTGGCTTACCCC)。最終的PCR產(chǎn)品，用EcoRI和HindIII酶消化，并克隆到p426GPD中，得到pGPDL-MSH。
0101pLong sp-MSH和pLong MSH質(zhì)粒構(gòu)建如下)，利用核苷酸LALPHAfwd(SEQ ID NO23)(5’-ATGAGATTTCCTTCAATTTT TACTGC-3’)和其它LALPHArev(SEQ ID NO24)(5’-ATAGAGTAAGAAGCACCTCTTTTATCCAAAGATACCC-3’)或LALPHAw/osprev(SEQ ID NO25)(TGTTCCATAGAGTAAGATCTTTTATCCAAAGATACCC)，從酵母染色體中PCR擴(kuò)增-偶連因子的前85個(gè)氨基酸，分別生成PCR產(chǎn)物A和B。在核苷酸反向的序列中，有下劃線的序列對(duì)應(yīng)于MSH的3’-端反向鏈，黑體表示的核苷酸是指間隔-氨基酸密碼子的反向鏈。PCR產(chǎn)物A和B作模板，分別用于以后的PCR反應(yīng)來(lái)構(gòu)建Longp-MSH和Long MSH的融合。后面的PCR反應(yīng)用核苷酸EcoLALPHAfwd(SEQ ID NO26)(5’-GCGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC-3’)預(yù)先準(zhǔn)備，并結(jié)合另一個(gè)引物L(fēng)ALPHAMSHrev(SEQ ID NO27)(5’-GGAAGCTTAAACTGGCTTACCCCATCTGAAGTGTTCCATAGAGTAAGAAGCACCTC-3’)或LALPHAMSHw/oSPrev(SEQ ID NO28)(5’-GGAAGCTTAAACTGGCTTACCCCATCTGAAGTG TTCCATAGAGT)來(lái)分別構(gòu)建Long -sp-MSH或Long MSH。將最終的PCR產(chǎn)物克隆到p426GPD的EcoRI/HindIII酶切位點(diǎn)，構(gòu)建MSH表達(dá)質(zhì)粒pLong -MSH和pLong -sp-MSH.
實(shí)施例10GFP-細(xì)胞壁顯示載體的構(gòu)建0102作為蛋白表達(dá)的目標(biāo)載體，pGPD-DSPLY的功能顯示在細(xì)胞壁上。PCR引物的名稱和序列用于構(gòu)建pGPD-DSPLY，它的衍生物列于表3。pGPD-DSPLY包含編碼酵母-偶連因子前導(dǎo)序列的序列和釀酒酵母α-凝集素的細(xì)胞壁固定區(qū)((C-末端350氨基酸)。首先，編碼α-前導(dǎo)肽序列跟隨兩個(gè)氨基酸間隔基(Gly andAla)的序列，從酵母染色體中利用引物BamLALPHAfwd和EcoLALPHArev進(jìn)行PCR擴(kuò)增)(S288C株)，將其克隆到p426GPD的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pSecY。然后，利用寡核苷酸Agglfwd和AgglrevNext，在酵母染色體DNA(strainS288C)進(jìn)行PCR擴(kuò)增編碼α-凝集素的細(xì)胞壁固定區(qū)的序列，并將其克隆到p426GPD的ClaI/XhoI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pGPDAnch。通過(guò)亞克隆包含α-凝集素序列的EcoRI/XhoI酶切片段進(jìn)入pSecY相同位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行構(gòu)建pGPD-DSPLY。
0103GFP表面顯示載體構(gòu)建如下GFP編碼序列使用引物sgGFPfwd和sgGFPrev從質(zhì)粒pQB125-fPA(Qbiogene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且克隆α-凝集素序列的上游序列進(jìn)入pGPDAnch的EcoRI/HindIII酶切位點(diǎn)，獲得pGFPAnch。然后，pGFPAnch的一個(gè)EcoRI/XhoI酶切片段被亞克隆到pSecY的相同位點(diǎn)，得到pGFPDSPLY.
表3 表達(dá)載體表面顯示構(gòu)建所用的SEQ ID NO

實(shí)施例11質(zhì)粒pGPD-IL-10的制備0104編碼成熟小鼠IL-10蛋白的序列從小鼠cDNA庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將其克隆到pSecY的SmaI/HindIII位點(diǎn)。下列的核苷酸被用于PCR反應(yīng)IL-10fwdSEQ ID NO35(5’-GGGAGCAGGGGCCAGTACAG-3’)和IL-10rev SEQ ID NO 42(5’-GGGAAGCTTTTAGCTTTTCATTTTGATCATC)。
實(shí)施例12質(zhì)粒pInt-MSH和其他pInt載體的制備0105通過(guò)亞克隆一個(gè)SacI/KpnI片段上的表達(dá)盒(從GPD啟動(dòng)子的起始端到CYC1轉(zhuǎn)錄終止序列的末端)進(jìn)入pFL34的相同位點(diǎn)構(gòu)建pInt-MSH。所有其他pInt載體的構(gòu)建是通過(guò)對(duì)相應(yīng)的表達(dá)盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將其克隆到pFL34的HindIII/KpnI位點(diǎn)。用于PCR擴(kuò)增寡核苷酸的是GPDFWD SEQ ID NO 36(5’-CCCAAGCTTTTACCATCACCGTCACC-3’)和CYC1REV SEQ ID NO 37(5’-CCCGGTACCGTCATGTAATT AGTTATGTC-3’).pInt-MSH和其他URA3基因內(nèi)的pInt載體的消化將在線性DNA的兩端提供序列，其DNA與染色體ura-3基因(突變ura-3株，見(jiàn)圖7A)具有同源性。線性DNA末端的同源性調(diào)節(jié)同源重組進(jìn)入ura-3位置并可提高Ura+原養(yǎng)型微生物的表型性狀。
實(shí)施例13PCR產(chǎn)物的整合0106為了促進(jìn)染色體整合(示意圖見(jiàn)圖7B)，對(duì)每個(gè)表達(dá)盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增(從GPD啟動(dòng)子開端到URA3基因開端)，使用下列的寡核苷酸UPINT(SEQ ID NO38)(5’-CGTGCTTCTGGTACATACTTGCAATTTATACAGTGATGACCGCTGGACCATGATTACGCCAAG-3’)和DWNINT(SEQ ID NO 39)(5’-TTTAGCATGGCCATTGAATGTAACAATTATATATATCGCAAGCACGATTCGGTAATCTCCGAG-3’)。UPINT由一個(gè)45bp序列組成，該序列與HO基因的+1587到+1542序列互補(bǔ)，跟隨GPD啟動(dòng)子最初的18個(gè)堿基對(duì)。DWNINT包含對(duì)應(yīng)HO基因(+1是ATG密碼子)-2635到-2680序列的一個(gè)45bp序列，跟隨的是與URA3基因起始端互補(bǔ)的18個(gè)堿基對(duì)。所得的PCR產(chǎn)物將與HO基因側(cè)面序列同源，在雙交聯(lián)劑的作用下，它將會(huì)促進(jìn)在HO位點(diǎn)表達(dá)盒的染色體整合。此HO基因編碼核酸內(nèi)切酶特殊位點(diǎn)，此核酸內(nèi)切酶需用偶連型轉(zhuǎn)化，而它的缺少對(duì)酵母生理學(xué)上的影響并未得知。染色體整合劑會(huì)給予酵母細(xì)胞一個(gè)Ura+原養(yǎng)型的表型性狀，允許在不存在尿嘧啶的情況下進(jìn)行重組選擇。
實(shí)施例14擁有ThyA選擇系統(tǒng)的載體——pSYMB6的構(gòu)建0107為構(gòu)建臨床應(yīng)用級(jí)別載體pSYMB6，首先，利用引物thyANsiIFor SEQ IDNO40(5’-CCAATGCATGGCACAGCTTGATGCGATC-3’)和thyANsiIRev SEQ IDNO41(5’-CCAATGCATGTG TCATTGGTAAACCTGAC-3’)，從干酪乳桿菌染色體DNA中PCR擴(kuò)增ThyA基因。所得的PCR產(chǎn)物用NsiI酶消化，將其克隆到相同酶消化的pSYMB3，得到質(zhì)粒pSYMB5。pSYMB5的建造是在去除thyA基因的大腸桿菌(MM21)中選擇完成。為了得到pSYMB6，Erymthromycin-抗性基因(Em)通過(guò)長(zhǎng)距離PCR方法從質(zhì)粒中刪除，其中氨芐基因被排除在最終的PCR產(chǎn)物之外。這個(gè)過(guò)程的完成是通過(guò)設(shè)計(jì)PCR引物與Em基因末端雜交，且指引聚合反應(yīng)從氨芐基因上移開。通過(guò)DpnI酶消化(除去模板DNA)，PCR產(chǎn)物通過(guò)鏈接反應(yīng)環(huán)化，并轉(zhuǎn)化到缺失ThyA的大腸桿菌MM21中。在缺乏胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化株。
實(shí)施例15乳桿菌和乳球菌的ThyA突變株的分離0108乳桿菌和乳球菌的菌株可通過(guò)兩種方法構(gòu)建從thyA染色體突變株選擇或刪除thyA基因。ThyA染色體突變株可以通過(guò)在固體修飾的MRS或M17的培養(yǎng)基上接種細(xì)胞而進(jìn)行分離，該培養(yǎng)基包含甲氧芐氨嘧啶(20-400ug/ml)和胸苷或胸腺激素(50-100ug/ml)的。雖然野型細(xì)胞對(duì)抗生素甲氧芐氨嘧啶很敏感，但是thyA突變株具有抵抗性且可在上述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
0109ThyA基因的染色體刪除可通過(guò)用編碼報(bào)告基因的序列替換ThyA ORF完成。報(bào)告基因的例子是GFP，熒光素酶和-半乳糖苷酶。因此，包含ThyA調(diào)控序列(啟動(dòng)子和3’未轉(zhuǎn)化區(qū)域)且與報(bào)告基因兩側(cè)連接的融合結(jié)構(gòu)將被克隆入一個(gè)整合載體中，例如(但不局限于)pHY304(該結(jié)構(gòu)的描述見(jiàn)下)。此載體具有溫度敏感的復(fù)制源，以Em基因作為選擇標(biāo)記；一旦載體在合適溫度下轉(zhuǎn)化到細(xì)胞內(nèi)，它通過(guò)在不許可溫度下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以染色體作為靶目標(biāo)，選擇紅霉素抗性。靶染色體可通過(guò)同源重組來(lái)控制，此同源重組是在質(zhì)粒上ThyA側(cè)位序列和染色體上ThyA基因之間進(jìn)行的(見(jiàn)圖9)。氨芐抗性細(xì)胞通過(guò)熒光顯微鏡方法來(lái)檢測(cè)，用于GFP表達(dá)(GFP作為報(bào)告基因的例子)，質(zhì)粒的正確整合可通過(guò)對(duì)染色體DNA的診斷PCR擴(kuò)增來(lái)證實(shí)。染色體整合的結(jié)果是，ThyA側(cè)位序列在染色體上復(fù)制，它給染色體外重組提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，導(dǎo)致質(zhì)粒序列的刪除，和50％的機(jī)會(huì)可用GFP-融合基因(GFP被ThyA調(diào)節(jié)序列驅(qū)動(dòng)，見(jiàn)圖9)替換染色體胸苷酸合成酶基因。由于thyA基因的刪除，這種染色體外重組將對(duì)甲氧芐氨嘧啶的殺傷效果有抵抗作用。因此，為了獲得染色體外重組和對(duì)thyA刪除菌株的選擇，Em-抗性GFP陽(yáng)性細(xì)胞將在甲氧芐氨嘧啶和胸苷存在條件下，且對(duì)整合載體復(fù)制的合適溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，甲氧芐氨嘧啶抵抗細(xì)胞將會(huì)為GFP表達(dá)和氨芐靈敏性進(jìn)行檢測(cè)，其應(yīng)該代表缺失質(zhì)粒的細(xì)胞。最后，GFP-融合基因替換染色體胸苷酸合成酶基因的正確性可通過(guò)染色體DNA的診斷PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)。
實(shí)施例16乳酸乳球菌(pSYMB7)的ThyA整合載體的構(gòu)建0110從乳酸乳球菌基因組DNA中PCR擴(kuò)增ThyA基因plus 200bp側(cè)位序列并將其克隆到pUC19。然后，使用側(cè)位相接且遠(yuǎn)離ThyA ORF的引物，通過(guò)長(zhǎng)范圍的PCR，將ThyAORF從pUC19結(jié)構(gòu)中刪除。上游和下游的引物將會(huì)把它們的5’-端序列分別補(bǔ)充到GFP ORF的起始端和末端。然后，所得的PCR產(chǎn)物將會(huì)同相應(yīng)的GFP ORF的第二個(gè)PCR片段一同轉(zhuǎn)化到一個(gè)RecA+細(xì)菌宿主，例如(但不局限于)DH5。在GFP序列和產(chǎn)生的環(huán)形質(zhì)粒中，兩個(gè)PCR產(chǎn)物之間的相繼同源重組基礎(chǔ)上可形成轉(zhuǎn)化群落。此同源重組的結(jié)果是，GFP將在ThyA調(diào)控序列控制下表達(dá)。最終，為了建構(gòu)ThyA整合載體，GFP ORF同200bp ThyA側(cè)位序列一起將被亞克隆到綜合載體pHY304。
實(shí)施例17乳酸菌(pSYMB8)的ThyA整合載體的構(gòu)建0111從乳酸菌染色體序列中PCR擴(kuò)增ThyA ORF同70bp側(cè)位序列，并將其亞克隆到pUC19。然后，通過(guò)限制性消化除去ThyA ORF的內(nèi)部片段，用GFP PCR片段合適的末端替換。所得的結(jié)構(gòu)中，GFP ORF讀碼框5’端具有ThyA ORF且在3’-端有終止密碼，在讀碼框外保留ThyA ORF序列下游。所得的ThyA-GFP同ThyA側(cè)位序列融合，被亞克隆到pHY304，得到一個(gè)LAB ThyA整合結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例18乳酸菌和乳球菌表達(dá)結(jié)構(gòu)整合入染色體0112ThyA突變株構(gòu)建的方法可用于LAB和L.lactis表達(dá)盒的整合進(jìn)入染色體中。簡(jiǎn)單的說(shuō)，從各自的表達(dá)結(jié)構(gòu)中PCR擴(kuò)增表達(dá)盒，(如pSYMB3，pSYMB4等等)，并將克隆在ThyA側(cè)位序列的中部。所得的整合結(jié)構(gòu)可被用于替換上述染色體的ThyA基因。
實(shí)施例19-23臨床載體的蛋白表達(dá)實(shí)施例19在新月莖菌中的表達(dá)0113質(zhì)粒pCX-MSH或pCX-VP7通過(guò)電轉(zhuǎn)化至新月莖菌中。將轉(zhuǎn)化株的單菌落接種到含有2μg/ml氯霉素的5mlPYE培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，第二天，將過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋25倍至含2μg/ml氯霉素的M11表達(dá)培養(yǎng)基中。稀釋培養(yǎng)物在輕微的震蕩中(80-100rpm)30℃培養(yǎng)2天，為了檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，樣品按規(guī)則的間隔收取。
實(shí)施例20在埃希氏菌屬大腸桿菌中的表達(dá)0114將大腸桿菌菌株接種到含100μg/ml氨芐的IMC培養(yǎng)基中，25℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。加入1×1010過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞至50ml含100μg/ml氨芐青霉素和100μg/ml色氨酸的IMC培養(yǎng)基中。25℃培養(yǎng)，每隔1小時(shí)取樣，O.D.600nm下檢查細(xì)胞濃度。離心收集細(xì)胞后，通過(guò)SDS-PAGE，ELISA，和Western Blot檢查細(xì)胞的表達(dá)。
實(shí)施例21在乳酸菌中的表達(dá)0115將表達(dá)的乳酸菌菌株接種至MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶50將過(guò)夜培養(yǎng)物的稀釋到50ml改良的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每小時(shí)取樣，離心后分離細(xì)胞和上清，通過(guò)ELISA檢測(cè)其表達(dá)情況。另外，檢測(cè)每部分的生物學(xué)活性。另外，測(cè)定并記錄在OD600n.m.下的光密度，以及不同生長(zhǎng)期的相關(guān)表達(dá)水平。
實(shí)施例22蛋白在酵母細(xì)胞表面的表達(dá)0116經(jīng)pYD或基于pYD1的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的EBY100酵母接種到含2％葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集細(xì)胞，在含2％半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基中重懸至OD600為0.5～1。細(xì)胞在20～25℃條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)法分析表達(dá)情況。
實(shí)施例23蛋白在酵母中的表達(dá)0117細(xì)胞表面表達(dá)GFP蛋白的酵母生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期，在不同的細(xì)胞密度收集細(xì)胞(細(xì)胞密度是通過(guò)600nm吸收測(cè)定的)?？蛰d體(pGPDDSPLY，見(jiàn)下)轉(zhuǎn)化的酵母同對(duì)照組一起收獲。把等量的2×107細(xì)胞沉淀，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)的上樣緩沖液溶解，煮沸。蛋白在4-12％ Novex梯度凝膠分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用單克隆的GFP抗體印跡(mAb11E5，Qbiogene)。通過(guò)用二級(jí)辣根過(guò)氧物酶(Hrp)-標(biāo)記的抗鼠抗體處理膜以顯示抗原蛋白，接著加入發(fā)色Hrp底物。如圖10所示，只有以GFP表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的酵母才顯示出由抗-GFP抗體識(shí)別的蛋白帶。除主要的全長(zhǎng)產(chǎn)物外，多條抗-GFP反應(yīng)帶的存在反映了基因產(chǎn)物蛋白的降解。
實(shí)施例24-27表達(dá)產(chǎn)物的鑒定實(shí)施例24用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定0118通過(guò)離心收集細(xì)胞(用于表面表達(dá))或在培養(yǎng)基中聚集蛋白(for PCX)，用SDS-PAGE樣品上樣緩沖液重懸，95℃加熱10min，通過(guò)SDS-聚酰銨電泳將樣品分離，用考馬斯亮蘭染色檢測(cè)蛋白。
實(shí)施例25用WESTERNBLOT進(jìn)行鑒定0119蛋白樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離，然后用電印跡法轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。含有蛋白的纖維素膜用抗原特異性抗體進(jìn)行處理?？乖?抗體復(fù)合體的存在，可以通過(guò)將其置于二級(jí)抗體中進(jìn)行鑒別，二級(jí)抗體可以識(shí)別特殊抗原抗體并且與酶連接。接下來(lái)，纖維素膜使用抗體連接酶的底物進(jìn)行孵育，通過(guò)產(chǎn)生的顏色或輕微的能量就可以達(dá)到對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。
實(shí)施例26用ELSIA進(jìn)行鑒定0120通過(guò)離心收集細(xì)胞(表面表達(dá))或在培養(yǎng)基中聚集的蛋白(分泌表達(dá))，在包被液中重懸，在ELISA板上包被細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)一級(jí)的抗原特異性抗體處理，沖洗之后，用二級(jí)酶連抗體處理。為了檢測(cè)蛋白的表達(dá)，加入連接酶的底物，通過(guò)ELISA板讀取器監(jiān)測(cè)顏色的變化。
實(shí)施例27表面表達(dá)蛋白的檢測(cè)0121收集經(jīng)過(guò)表面表達(dá)結(jié)構(gòu)或空白表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，用PBS進(jìn)行沖洗，在4℃用相應(yīng)的抗體孵育30分鐘。離心，用PBS沖洗，在暗處用硫氰酸熒光素連接的二級(jí)抗體在4℃下孵育30分鐘。用PBS沖洗細(xì)胞2次，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
0122當(dāng)前的基因治療技術(shù)主要依賴于載體，這些載體可以是病毒、裸質(zhì)粒DNA等免疫活性物質(zhì)，或者是象脂質(zhì)體這樣人工合成的載體。每一種基因載體都具有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。病毒載體可以引發(fā)免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)有可能是對(duì)受體的一種直接傷害，也可能會(huì)導(dǎo)致限制或阻止該種載體在受體中的進(jìn)一步應(yīng)用。裸的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的效率很低，易受體內(nèi)核酸酶的攻擊。脂質(zhì)體因?yàn)槠渖a(chǎn)的復(fù)雜性從而應(yīng)用十分有限，并且穩(wěn)定整合率和轉(zhuǎn)染率都非常低。下面的表4列出了包括本發(fā)明中微生物載體在內(nèi)的不同基因治療載體系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)。
0123本發(fā)明中所使用的微生物載體的幾個(gè)最重要的優(yōu)點(diǎn)如下對(duì)受體具有極低的免疫活性，可以轉(zhuǎn)運(yùn)被插入的大的質(zhì)粒，很容易規(guī)范FDA認(rèn)可的生產(chǎn)制造環(huán)境，因?yàn)槠錄](méi)有致病性，所以對(duì)生產(chǎn)人員沒(méi)有健康危害，特別的機(jī)體組織和細(xì)胞類型都可以應(yīng)用于靶向定位。
0124本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，臨床應(yīng)用級(jí)載體可以將治療蛋白直接轉(zhuǎn)導(dǎo)到治療所需要的靶點(diǎn)。因?yàn)楸据d體不具備對(duì)健康的危險(xiǎn)，所以整個(gè)載體系統(tǒng)和重組的治療蛋白可以同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)到機(jī)體。因?yàn)椴恍枰嘿F的產(chǎn)品處理凈化以除去重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)和同時(shí)提供治療蛋白產(chǎn)品，所以使操作非常簡(jiǎn)單。
0125此外，當(dāng)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫原性成分給動(dòng)物時(shí)，口服給藥系統(tǒng)通過(guò)將腸內(nèi)的M細(xì)胞直接暴露到抗原表達(dá)/分泌載體而將免疫細(xì)胞作為靶細(xì)胞。另外，因?yàn)榕c許多在本發(fā)明中描述的微生物有關(guān)的益生作用，口服轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)還對(duì)受體的健康具有許多間接的益處。(Fuller，R.1993.Probiotic foods-current use and futuredevelopments.IFI NR 323-26；Mitsuoka，T.1984.Taxonomy and ecology ofBifidobacteria.Bifidobacteria Microflora 311；Gibson，G.R.et al.，1997.Probiotics andintestinal infections，p.10-39.In R.Fuller(ed.)，Probiotics 2Applications and practicalaspects.Chapman and Hall，London，U.K.)。
表4.基因治療載體系統(tǒng)比較


0126本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例是使用臨床應(yīng)用級(jí)載體用于治療或減輕外傷眼睛炎癥或色素膜炎。色素膜炎是位于鞏膜和視網(wǎng)膜之間的血管膜上的炎性反應(yīng)。血管膜上含有眾多的血管給眼球供氧。當(dāng)其發(fā)炎時(shí)，會(huì)影響到角膜、視網(wǎng)膜、鞏膜和眼睛的其它重要部分。色素膜炎分為急性和慢性兩種，對(duì)男女患者的發(fā)病率相等。在任何年齡段的人群中均可發(fā)病，主要集中在20-50歲的人群中間，在20多歲的人群中最為常見(jiàn)。雖然并不知道其準(zhǔn)確的致病原因，但是可以由象化學(xué)損傷那樣的外傷引起，也可以通過(guò)病毒感染(如AIDS患者的巨細(xì)胞病毒)、真菌感染(網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞真菌)或寄生蟲感染(如果孕期婦女患有弓形蟲病，則嬰兒會(huì)患有色素膜炎)引發(fā)。色素膜炎也與相關(guān)免疫失調(diào)有潛在的關(guān)系，包括Reiter′s綜合癥，多發(fā)性硬化，少年風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Crohn′s病和肉狀瘤病。某些疾病象白血病，淋巴瘤和惡性黑色素瘤也會(huì)具有色素膜炎的類似癥狀。對(duì)一些藥物的應(yīng)用，象利福布丁，cidofovir，pamidronic acid和磺胺類藥物也可以導(dǎo)致色素膜炎。在許多病例中，這種潛在的因素并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)(AlexanderKLdeng，1997.Optometric臨床實(shí)踐方針眼色素膜炎患者的治療，2nd ed.American Optometric Association.)。
0127當(dāng)前對(duì)色素膜炎的治療包括皮質(zhì)甾類，主要是針對(duì)減少水腫和減輕疼痛。睫狀肌麻痹劑(如環(huán)戊通和后馬托品)用于減輕疼痛，抗菌劑用于治療感染，抗炎劑用于減輕水腫或者抑制免疫系統(tǒng)(Berkow R，F(xiàn)letcher AJ，Beers MH，eds.TheMerck Manual.Rahway，NJMerck & Co.；19922380-2382)。本發(fā)明的例子證明內(nèi)毒素在哺乳動(dòng)物中導(dǎo)致色素膜炎可以使用αMSH表達(dá)載體進(jìn)行抑制或治療。
0128本發(fā)明證明，動(dòng)物的色素膜炎可以使用本發(fā)明中的αMSH表達(dá)載體進(jìn)行抑制或治療。外傷性色素膜炎和內(nèi)毒素所致色素膜炎均可以通過(guò)包括乳酸菌和酵母進(jìn)行重組αMSH進(jìn)行表達(dá)的臨床應(yīng)用級(jí)載體進(jìn)行抑制和治療。
實(shí)施例28使用臨床應(yīng)用級(jí)載體表達(dá)αMSH治療外傷性色素膜炎試驗(yàn)設(shè)計(jì)0129對(duì)老鼠角膜進(jìn)行外科非打孔型穿孔，對(duì)αMSH進(jìn)行表達(dá)的重組微生物對(duì)老鼠進(jìn)行局部給藥和口服，通過(guò)觀察充血，水腫，水溶性蛋白水平和房水中的炎性細(xì)胞數(shù)以及受損角膜的其他形態(tài)學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)色素膜炎的嚴(yán)重程度。受傷處理后24小時(shí)對(duì)以上參數(shù)進(jìn)行分析，大鼠分為8組第一組正常對(duì)照，正常未處理組(10只)；治療第二組治療對(duì)照組(色素膜炎老鼠用0.45％生理鹽水治療。10只)；第三組酵母口服治療組色素膜炎老鼠經(jīng)酵母表達(dá)rαMSH口服治療(1010yeast/ml qd。5只)；第四組酵母局部治療組，色素膜炎老鼠經(jīng)酵母表達(dá)rαMSH局部治療(1010yeast/ml qd。5只)；第五組乳酸菌口服治療組，色素膜炎老鼠經(jīng)乳酸菌表達(dá)rαMSH口服治療；第六組酵母局部治療組，色素膜炎老鼠經(jīng)乳酸菌表達(dá)rαMSH局部治療(1010yeast/ml qd。5只)；乳酸菌對(duì)照組正常大鼠經(jīng)過(guò)乳酸菌表達(dá)rαMSH局部治療(1010yeast/ml qd。4只)；酵母對(duì)照組正常大鼠經(jīng)過(guò)酵母表達(dá)rαMSH局部治療(1010yeast/ml qd。4只)。
B.材料和方法1.動(dòng)物L(fēng)ewis大鼠性別隨機(jī)，體重125-250g范圍內(nèi)。
2.臨床級(jí)載體a.酵母釀酒酵母菌株W303-1A經(jīng)p426GPD或pLong-sp-MSH轉(zhuǎn)化。
b.乳酸菌干酷乳桿菌經(jīng)pSYMB4或pSYMB.轉(zhuǎn)化3.載體的制備轉(zhuǎn)化的和非轉(zhuǎn)化的酵母和乳酸菌在增富固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期采集(在細(xì)菌達(dá)到最大數(shù)量的前一天)，用PBS洗滌并以1010cells/ml的濃度重懸，最終的懸浮液體用于給動(dòng)物給藥。
4.用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果的參數(shù)a.蛋白濃度和炎性細(xì)胞數(shù)蛋白及炎性細(xì)胞數(shù)使用Lowry法測(cè)定蛋白，使用coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定炎性細(xì)胞數(shù)。通過(guò)觀察αMSH治療組和對(duì)照組的不同驗(yàn)證αMSH在治療和控制LPS內(nèi)毒素致炎癥中的作用。
b.組織病理學(xué)引發(fā)色素膜炎24小時(shí)后，抽出房水，取出眼球。實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)部分包括角膜，虹膜睫狀體，色素層血管和視網(wǎng)膜。將其在2％戊二醛溶液中固定。烘干之后，將組織切開并用H&E和PAS褪色處理。通過(guò)對(duì)αMSH治療組和對(duì)照組的比較，可以評(píng)價(jià)αMSH的治療作用。
c.臨床評(píng)價(jià)使用外科顯微鏡觀察色素膜炎發(fā)生后的結(jié)膜充血，水腫，出血和滲出以及角膜的變化。使用1-4分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，1為輕微，4為嚴(yán)重。使用數(shù)碼相機(jī)紀(jì)錄充血狀況。
實(shí)施例29臨床應(yīng)用級(jí)載體表達(dá)αMSH治療內(nèi)毒素所致色素膜炎0130A.試驗(yàn)設(shè)計(jì)大鼠色素膜炎可以通過(guò)注射Salmonella typhimurium LPS內(nèi)毒素導(dǎo)致。αMSH的治療可以通過(guò)局部給藥或肌內(nèi)注射。色素膜炎的嚴(yán)重性可以通過(guò)不同的指標(biāo)檢測(cè)，主要指標(biāo)包括充血，水腫，水溶性蛋白的水平和水液中炎性細(xì)胞的水平，以及受影響組織中組織形態(tài)學(xué)的其他指標(biāo)。每一項(xiàng)指標(biāo)均在治療后1h，3h，6h，12h，及24h測(cè)得。本實(shí)驗(yàn)用老鼠至少分為8組。第一組正常對(duì)照組(正常、未治療大鼠10只)；治療第二組治療對(duì)照組(外傷色素膜炎大鼠通過(guò)0.45％生理鹽水局部給藥，10rats)；第三組酵母口服治療組(外傷色素膜炎大鼠經(jīng)酵母表達(dá)rαMSH口服給藥(1010yeast/ml qd)治療，5只)；第四組酵母局部治療組(外傷色素膜炎大鼠經(jīng)酵母表達(dá)rαMSH局部給藥治療(1010yeast/ml qd)，5只)；第五組乳酸菌口服治療組(外傷色素膜炎大鼠經(jīng)乳酸菌表達(dá)rαMSH口服給藥治療(1010bacterial/ml qd)，5只)；第六組乳酸菌局部給藥治療組(外傷色素膜炎大鼠經(jīng)乳酸菌表達(dá)rαMSH局部給藥治療(1010bacterial/ml qd)，5只)；乳酸菌對(duì)照組(正常大鼠經(jīng)乳酸菌表達(dá)rαMSH局部給藥治療(1010bacterial/ml qd)，4只)。酵母對(duì)照組(正常大鼠經(jīng)酵母表達(dá)rαMSH局部給藥治療(1010yseast/ml qd)，4只)。由于采用急性炎性反映模式，所組織損壞發(fā)生的太早或太嚴(yán)重，可能需要αMSH預(yù)處理。
B.材料和方法1.動(dòng)物L(fēng)ewis大鼠性別隨機(jī)，稱重125-250g范圍內(nèi)。
2.臨床級(jí)載體a.酵母釀酒酵母菌株W303-1A經(jīng)p426GPD或pLong-sp-MSH轉(zhuǎn)化。
b.乳酸菌干酪乳桿菌經(jīng)pSYMB4或pSYMB.轉(zhuǎn)化3.載體制備轉(zhuǎn)化的和非轉(zhuǎn)化的酵母和乳酸菌在增富培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期采集(在細(xì)菌達(dá)到最大數(shù)量的前一天)，用PBS洗滌并以1010cells/ml的濃度重懸，最終的懸浮液用于給動(dòng)物給藥。
4.用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果的參數(shù)a.蛋白濃度和炎性細(xì)胞數(shù)通過(guò)Lowry法測(cè)定蛋白，使用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定炎性細(xì)胞數(shù)。通過(guò)觀察αMSH治療組和對(duì)照組的不同驗(yàn)證αMSH在治療和控制LPS內(nèi)毒素致炎癥中的作用。
b.組織病理學(xué)引發(fā)色素膜炎24小時(shí)后，抽出房水，取出眼球。實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)部分包括角膜，虹膜睫狀體，色素層管和視網(wǎng)膜。將其在2％戊二醛溶液中固定。烘干之后，將組織切開并用H&E和PAS褪色處理。通過(guò)對(duì)αMSH治療組和對(duì)照組的比較，可以評(píng)價(jià)αMSH的治療作用。
c.臨床評(píng)價(jià)使用外科顯微鏡觀察色素膜炎發(fā)生后的結(jié)膜充血，水腫，出血和滲出以及角膜的變化。使用1-4分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，1為輕微，4為嚴(yán)重。使用數(shù)碼相機(jī)紀(jì)錄充血狀況。
d.房水中的細(xì)胞因子和分葉核白細(xì)胞(PMNs)通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)TNF-α的水平。IL-1，IL-2，IL-6和IFN-γ水平用放射性同位素進(jìn)行測(cè)定。在顯微鏡下觀察PMNs數(shù)目。使用改進(jìn)了的Williams RN(curr EyeRes 2465，1983)方法測(cè)定PMNs的活性。使用ELISA方法測(cè)定房水中αMSH水平。
實(shí)施例30-3細(xì)胞靶向性臨床應(yīng)用級(jí)載體0131M細(xì)胞是特異性的內(nèi)臟上表皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)從內(nèi)臟到下面叫做peyer’s片的淋巴組織的大分子、病毒和類似物質(zhì)的運(yùn)輸。除此之外，它還是防御外來(lái)生物和大分子的侵襲的第一道屏障，M細(xì)胞小泡的運(yùn)輸也為rapeutic化合物進(jìn)入血液提供了方便。因此，通過(guò)設(shè)計(jì)細(xì)菌和酵母載體在其表面上攜帶M細(xì)胞靶分子。
0132在具體實(shí)施例中，乳酸菌中含有編碼M細(xì)胞靶因子的結(jié)構(gòu)。該因子可以包容在含有異源基因的質(zhì)粒上或在單獨(dú)的質(zhì)粒上。在表達(dá)上，M細(xì)胞靶因子允許乳酸菌優(yōu)先與上表皮細(xì)胞其他形式的M細(xì)胞結(jié)合。一般有三種類型的要素來(lái)說(shuō)明提高藥物與靶M細(xì)胞的結(jié)合能力。(Chen等美國(guó)專利號(hào)6,060,082)(Ginkel等CDC.6(2)，2000).第一種是外原凝集素，它能結(jié)合細(xì)胞的表面(例子見(jiàn)美國(guó)專利6,060,082).第二種是來(lái)源于呼腸孤病毒的sigma蛋白，它能使M細(xì)胞因子作用于靶點(diǎn)并可以以融合蛋白的形式表達(dá)。(Wu，Y.，等″M細(xì)胞靶點(diǎn)DNA接種疫苗″Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(16)9318-23(2001)).第三種包括單克隆抗體片段的發(fā)展和利用，它能對(duì)M細(xì)胞產(chǎn)生特殊靶向，或至少能支配M細(xì)胞。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，呼腸孤病毒的sigma蛋白是通過(guò)LAB細(xì)胞和治療蛋白在細(xì)胞表面一同表達(dá)的。
0133本發(fā)明更多對(duì)M細(xì)胞靶向的具體實(shí)施例包括對(duì)LAB的掃描，從而在體內(nèi)優(yōu)先與上表皮細(xì)胞結(jié)合，同時(shí)利用這些菌株來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的臨床應(yīng)用級(jí)載體。在本發(fā)明其他的實(shí)施例中乳酸菌和/或酵母菌提供了粘著素蛋白，這種蛋白來(lái)源于能使M細(xì)胞產(chǎn)生靶向的細(xì)菌和病毒，例如耶爾森氏菌和傷寒沙門氏菌。(Clark，M.A.等，″耶而森氏菌屬假結(jié)核病M-細(xì)胞表面P1整聯(lián)蛋白表達(dá)和侵襲素調(diào)節(jié)目標(biāo)到大鼠Peyer的零碎M細(xì)胞″Infect Immun.661237-43(1998)；Baumler，A.等″TheIpf fimbrial operon mediates adhesion of Samonella typhirium to murine Peyer′spatches″Proc.Natl.Acad.Sci.USA93279-83(1996).這種細(xì)菌和病毒的粘附素是蛋白類，能調(diào)節(jié)M細(xì)胞的結(jié)合。
0134上面描述M細(xì)胞靶向化合物能結(jié)合修飾的乳酸菌細(xì)胞壁，這可以通過(guò)加入M細(xì)胞靶向化合物到有再生細(xì)胞壁能力的修飾的乳酸菌原生質(zhì)體中來(lái)實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，M細(xì)胞靶向化合物將會(huì)被包在已設(shè)計(jì)好充當(dāng)衍生的脂質(zhì)體中。這種專職的脂質(zhì)體能夠從Avanti Polar Lipids，Inc.買到。(Alabaster，AL).在修飾的乳酸菌的質(zhì)粒中能夠選擇地編碼M細(xì)胞靶向多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，含有抗原序列的質(zhì)粒也含有M細(xì)胞靶向多肽序列。在這個(gè)實(shí)施例中，M細(xì)胞靶向多肽能被附加到抗原序列上。M細(xì)胞靶向多肽序列能被選擇地附加到結(jié)合的促進(jìn)者區(qū)域的表面上，并可行地能和促進(jìn)區(qū)域連接起來(lái)，以致質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)生兩種不同的蛋白。在可選的實(shí)施例中，第二個(gè)質(zhì)粒將會(huì)含有M細(xì)胞靶向多肽序列，它是附加到結(jié)合的促進(jìn)者區(qū)域表面上并可行地和促進(jìn)者連接起來(lái)，以致載體能懷有兩個(gè)不同的重組質(zhì)粒。
0135在另外的實(shí)施例中，含有異源遺傳物質(zhì)的質(zhì)粒也可以含有編碼合成肽的多聚核苷酸序列，而合成肽含有oc整合素結(jié)合表位(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD)，該oc結(jié)合表位(RGD)是被融合到外源遺傳物質(zhì)編碼序列上，目的是為了提高傳輸效率。目前已報(bào)道整合素可以結(jié)合位于已極化的人類支氣管上皮細(xì)胞的表面上的RGD表位，(Scott，E.S.等″使用一個(gè)整合素-靶Lipoplex提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到上表皮細(xì)胞″The Journal Of Gene Medicine 3125-134(2001).配基受體交互作用是在含有RGD表位(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)多聚核苷酸和幾種已定性的細(xì)胞表面受體的整合素家族中進(jìn)行。所以，常用這種受體調(diào)節(jié)內(nèi)吞方法來(lái)進(jìn)入靶向表皮細(xì)胞。Scott，E.S.等，″使用一個(gè)整聯(lián)蛋白-靶Lipoplex提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到空中上皮細(xì)胞elial Cells″，The Journal Of Gene Medicine 3125-134(2001)和Hart，S.等″通過(guò)一個(gè)整合素結(jié)合肽調(diào)節(jié)基因傳導(dǎo)和表達(dá)″Gene Ther.2552-554(1995)0136對(duì)細(xì)菌和酵母載體定位到粘膜表面的另一種手段是使他們靶向于存在于粘膜表面細(xì)胞的單唾液酸糖苷GM1上，并與之結(jié)合。GM1通常被集中在稱為筏(脂類和高膽固醇部位，起膜交換和表面區(qū)域發(fā)信號(hào)作用)的質(zhì)膜區(qū)域里，(SimonsK.和Ikonen E.，1997，“細(xì)胞膜的功能筏”，Nature 387569-572).實(shí)際上，GM1是霍亂毒素的首要靶點(diǎn)。(Ctx)of Vibrio Cholera，和大腸桿菌腸毒素(Etx)(Lencer WI，Hirst TR，and Holmes RK，1999，“霍亂毒素的膜傳輸和細(xì)胞吸收”，Biochim BiophysActa 1450177-190).Ctx和Etx是由五個(gè)同樣的B亞單位和單個(gè)A亞單位，還有同GM1受體起相同作用的B亞單位(CtxB and EtxB)低聚體共同組成。CtxB或EtxB結(jié)合引起交叉結(jié)合，這導(dǎo)致毒素-GM1聯(lián)合體內(nèi)吞，并最終導(dǎo)致A亞單位酶釋放到胞液中。(Lencer WI，Hirst TR，和Holmes RK，1999，“霍亂毒素的膜傳輸和細(xì)胞吸收”，Biochim Biophys Acta 1450177-190).
0137如A亞單位缺失，CtxB就是非毒性的，并且它能夠形成一個(gè)可以結(jié)合GM1的獨(dú)立的五聚體復(fù)合物。因此，純化的CtxB已用作為將聯(lián)結(jié)在CtxB上的抗原到粘膜表面的一種手段。(George-Chandy等，2001，“霍亂毒素B子組作為運(yùn)輸分子促進(jìn)抗原表達(dá)且增強(qiáng)抗原呈現(xiàn)細(xì)胞的CD40和CD86表達(dá)”Infect.Immun.695716-25；Sadeghi等，2002，“人體胰島素B-鏈的基因融合到霍亂毒素B亞單位提高體外抗原表達(dá)和體內(nèi)旁觀抑制的表達(dá)”Immunology 106237-45)。CtxB在非病原大腸桿菌和葡萄球菌表面上的表達(dá)，通過(guò)粘膜給藥，可發(fā)展活細(xì)菌疫苗釋放系統(tǒng)(Liljeqvist等1997，“在葡萄狀球菌xylosus和葡萄狀球菌carnosus上的霍亂毒素B亞單位的表面顯示”，Appl.Env.Microbiol.632481-2488；Klauser等，1990，“使用奈瑟菌屬IgA蛋白酶-區(qū)對(duì)霍亂毒素B亞單位細(xì)胞外的傳輸依賴構(gòu)造的外部膜易位”EMBO J.91991-1999；Klauser等，1992，“通過(guò)大腸桿菌的霍亂毒素B亞單位的選擇性細(xì)胞外釋放奈瑟菌屬Iga-調(diào)節(jié)的外部膜傳輸?shù)姆纸狻盓MBO J.112327-2335)。關(guān)于在葡萄球菌表面上表達(dá)，可以看出靶向于外膜的EtxB形成功能性的化合物，該化合物能在體內(nèi)結(jié)合CM1。(Liljeqvist等，1997，“在葡萄狀球菌xylosus和葡萄狀球菌carnosus上的霍亂毒素B亞單位的表面顯示”，Appl.Env.Microbiol.632481-2488).所以，為了利用這種高特異性和高效率的粘膜釋放系統(tǒng)，我們的酵母和細(xì)菌釋放載體將會(huì)被設(shè)計(jì)為表面展示EtxB。
0138一種為了靶向傳遞載體的可供選擇的辦法是在他們的表面上表達(dá)蛋白，該蛋白表現(xiàn)出介導(dǎo)上表皮細(xì)胞結(jié)合作用。這種蛋白已在致病酵母白色假絲酵母菌(Fu等，在釀酒酵母中的白色假絲酵母菌基因ALS1表達(dá)導(dǎo)致對(duì)內(nèi)皮的和上皮的細(xì)胞的粘著。Infection and Immunity，661783-1786)和光滑假絲酵母菌中得到鑒定(致病酵母光滑假絲酵母菌的粘著素介導(dǎo)人上皮細(xì)胞的粘附Science，285578-582).這些在釀酒酵母表面的上皮靶向蛋白的表達(dá)使上皮細(xì)胞結(jié)合到這種天然的非粘附性微生物。
0139除了這些方法之外，可用Van Der Vaart等描述的包括-凝集素基因(AG-1)，細(xì)胞壁蛋白2(CWp2p)，Sed1p和其他錨定域的載體細(xì)胞壁或酵母細(xì)胞壁蛋白的方法。(釀酒酵母的細(xì)胞壁蛋白比較作為異源蛋白細(xì)胞表面表達(dá)的錨，Appl.Env.Microbiol.63615-620，1997)含有本發(fā)明的正常微生物載體的藥物組合物0140本發(fā)明的臨床應(yīng)用級(jí)別載體可根據(jù)選擇的給藥方式(口服或全身)在很大的濃度范圍內(nèi)使用。然而，本發(fā)明的藥物性成分加上可接受的賦形劑，通常每單位劑量含有大約103到1011活的微生物載體?？诜煞值馁x型劑可以含有合適的載體和輔料，例如玉米淀粉、凝膠、乳糖、阿拉伯膠、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、磷酸二鈣、碳酸鈣、氯化鈉或褐草酸。粉碎劑包括但不限于微晶纖維素、玉米淀粉、羥醋酸鹽或褐草酸?？捎玫钠瑒┱澈蟿┌ò⒗z、甲基纖維素、縮甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮鈉(PovidoneTM)、蔗糖、淀粉、和乙基纖維素。可用的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、硅樹脂、滑石、蠟、油和硅膠。
0141口服成分的液體劑型可用水或其他溶液制備，可以含有多種的懸濁試劑如甲基纖維素、藻酸鹽、黃蓍膠、膠質(zhì)、角叉膠、阿拉伯膠、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。液體劑型包括含有活性成分、濕劑、甜味劑、著色劑和矯味劑的溶液、乳濁液、糖漿和西爾劑。各種液體和粉末劑型可以根據(jù)被治療的哺乳動(dòng)物吸收入肺的這一特點(diǎn)的常規(guī)方法來(lái)制備。
0142局部應(yīng)用的液體劑型和半固體膏劑通常含有濃度大約在103到1011活的微生物載體。各種局部藥用劑型包括含有活性成分和各種支持物和載體的滴劑、酊劑、洗劑、油劑、溶液和油膏。本發(fā)明的最佳臨床應(yīng)用級(jí)別的載體的百分比在每種治療制劑中都不同，這要根據(jù)劑型本身的特點(diǎn)和對(duì)特殊的病理和相關(guān)的治療法則要求的治療效果來(lái)確定。
0143眾所周知的用于制備藥物常規(guī)的技術(shù)方法可以用于做成給病人服用的劑型。顯然，病人可以以液體、片劑和膠囊的形式口服藥物制劑。對(duì)于局部給藥，藥物成分可以制成液體制劑、膏劑或透皮吸收制劑。透皮吸收制劑是貼在病人皮膚上(通常每片貼1到5小時(shí))。通過(guò)常規(guī)的技術(shù)可用于其他透皮吸收給藥途徑(如通過(guò)油劑、膏劑或其他劑型達(dá)到全身給藥)。藥物制劑也可通過(guò)其他的常用給藥途徑服用(如口服、皮下給藥、肺部給藥、粘膜滲透、腹腔給藥、子宮給藥、舌下給藥、膜給藥和肌肉給藥)。除此之外，病人服用藥物制劑還可以通過(guò)長(zhǎng)效注射給藥，例如通過(guò)1-，3-或6-月長(zhǎng)效給藥或用生物降解材料和方法給藥。
0144本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供的動(dòng)物的單劑量，每克治療或預(yù)防成分大約含有103到1011個(gè)活的微生物。總量是根據(jù)動(dòng)物的個(gè)體需要和動(dòng)物的體重大小來(lái)確定。任一給藥的合適劑量可以簡(jiǎn)單地通過(guò)滴定來(lái)確定。滴定可通過(guò)一系列標(biāo)準(zhǔn)劑量來(lái)測(cè)定，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劑量的每單位劑量含有大約103到1011載體。開始以103個(gè)載體服用，逐漸增加服用量，根據(jù)動(dòng)物的大小和劑型的不同來(lái)計(jì)算系列的劑量。達(dá)到給藥效果所需的最小的載體量，即為適宜的劑量。對(duì)有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員來(lái)講，適宜的劑量也可稱為本發(fā)明的臨床應(yīng)用級(jí)別載體成分的有效劑量。
0145治療方法的有效性可以通過(guò)監(jiān)測(cè)病人的疾病癥狀或體征來(lái)評(píng)估。例如，缺乏鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和氨基甲酰磷酸鹽合成酶I可以直接檢測(cè)血漿中銨或oroticacid的水平來(lái)判斷。血清瓜氨酸水平能同樣地提供氨基甲酰磷酸鹽合成酶的不足的指標(biāo)，氨基甲酰裂合酶的不足可以根據(jù)血清氨基甲酰的水平來(lái)判斷。治療方法的評(píng)價(jià)參數(shù)對(duì)具有醫(yī)療經(jīng)驗(yàn)的人來(lái)說(shuō)是非常熟悉的(see，e.g.，Maestri et al.，1991，J.Pediatrics，119923-928)。在用rαMSH治療如眼色素膜炎炎癥疾病的這個(gè)例子中，治療時(shí)間和治療劑量由治療醫(yī)生通過(guò)用上面所說(shuō)的參數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)疾病的康復(fù)。一般來(lái)講，rαMSH治療的有效數(shù)量在大約1μg/kg到100μg/kg之間，最好在5μg/kg和50μg/kg之間，尤其是在10μg/kg到25μg/kg之間(μg/kg＝活性成分μg/每kg宿主體重)。
0146除非是特別的指明，在本說(shuō)明和權(quán)利要求中所有表示成分或特性的數(shù)據(jù)如分子量、反應(yīng)條件等都要理解已經(jīng)用術(shù)語(yǔ)“關(guān)于”一詞在所有情況下都作了修飾。因此，除非是指向反面，在下列規(guī)范中提出的或權(quán)利要求書中附加的數(shù)字參量都是近似值，這些數(shù)值可以根據(jù)本發(fā)明所尋求的預(yù)期特性而變化。在極少情況下，且并非試圖限制本權(quán)利要求及其相應(yīng)條款的應(yīng)用，對(duì)每一數(shù)字參量都應(yīng)該至少依據(jù)所報(bào)道的有意義數(shù)字的數(shù)值，并且運(yùn)用普通的舍入技巧進(jìn)行解析分析。盡管用以闡明本發(fā)明主要范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)是近似值，但是在明確的實(shí)例中提出的數(shù)值，我們報(bào)道的盡可能精確。然而，任何數(shù)值都不可避免地含有某些錯(cuò)誤，可能是由在它們各自的實(shí)驗(yàn)測(cè)定中造成的標(biāo)準(zhǔn)差所引起。
0147在說(shuō)明本發(fā)明的上下文中(特別是在下列權(quán)利要求書中的上下文中)所使用的術(shù)語(yǔ)“a”、“an”、“the”以及相似的代詞，必須理解為同時(shí)含蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非在文中指明或明顯與上下文相矛盾。這里所述的數(shù)值范圍，僅僅是為在一定范圍內(nèi)的每一獨(dú)立數(shù)值提供一個(gè)簡(jiǎn)略的方法。除非有明確標(biāo)明，每一單獨(dú)的數(shù)值都與說(shuō)明書呈為一體，就象是在單獨(dú)地復(fù)述它一樣。本申請(qǐng)所有的方法都可以用任何合適的順序進(jìn)行，除非是有不同地指明或者是明顯地與上下文相矛盾。使用本文所提供的任何與所有的例子，或者使用可示例性語(yǔ)言(例如，“such as”)僅僅是為了更好地闡明本發(fā)明，而不是對(duì)發(fā)明的適用范圍加以限制，否則就予以聲明。本說(shuō)明中的任何語(yǔ)言都不應(yīng)構(gòu)成對(duì)實(shí)踐本發(fā)明極為重要的成分沒(méi)有提出要求。
0148本申請(qǐng)所公開的可替代的成分或者發(fā)明的具體實(shí)施例，都不應(yīng)被理解為限制。每一組命題可能被單獨(dú)地提出權(quán)利要求，或者同組內(nèi)其它命題或所發(fā)現(xiàn)的其它要素一起提及。可以預(yù)見(jiàn)可能包括一個(gè)組內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)命題，或者是因?yàn)楸憷?或許可問(wèn)題而被刪除。當(dāng)發(fā)生這樣的包含或刪除時(shí)，在說(shuō)明書中被視為會(huì)包含修正的組別，以滿足權(quán)利要求中使用的所有馬庫(kù)什(Markush)組別的描述。
0149本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例包括發(fā)明人所知道的完成本發(fā)明的最好模式。當(dāng)然，對(duì)那些只掌握該領(lǐng)域普通技術(shù)、僅靠閱讀前述說(shuō)明的人來(lái)說(shuō)，這些優(yōu)選實(shí)施例就會(huì)出現(xiàn)明顯的變化。發(fā)明人希望有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員正確利用這樣的變化，并且可以其它不同的方式實(shí)施，而不僅僅使用本發(fā)明說(shuō)明的方法。因此，本發(fā)明在符合法律要求的前提下權(quán)利要求中包括了對(duì)發(fā)明主題的所有改良和替代。而且，本發(fā)明涵蓋了對(duì)所有可能的變化中采用上述因素的任何組合，除非是特殊說(shuō)明或者明顯地與上下文相矛盾。
0150而且，專大量的專利文獻(xiàn)與公開發(fā)表的文獻(xiàn)已經(jīng)作為參考，并貫穿于本申請(qǐng)說(shuō)明書中。對(duì)上述所引用的每一篇參考文獻(xiàn)和公開發(fā)表的文獻(xiàn)，都可以通過(guò)單獨(dú)完整地參考其全文。
0151作為結(jié)束語(yǔ)，應(yīng)該理解這里所公開的發(fā)明實(shí)施例是例證本發(fā)明的原理。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可能會(huì)有其它的改良。因此，通過(guò)舉例的方式，而不是通過(guò)限制的方式，本發(fā)明可能根據(jù)這里的原則采用了替換性的描述。因此，本發(fā)明并不僅僅限制在上述所顯示與敘述的內(nèi)容。
序列表<110>圣必健公司<120>用于傳遞治療性化合物的以正常微生物群為基礎(chǔ)的臨床應(yīng)用級(jí)載體<130>21823.17<140>10/280769<141>2002-10-25<160>42<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>1agatctggtg gcggtggctc ttattctatg gaacattttc gttggggtaa acctgttggt 60ggcggtgcgg ccgcg 75<210>2<211>195<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>2agatctctag atggtggcgg tggctcttat tctatggaac attttcgttg gggtaaacct 60gttggtggcg gtgcggccgc gtcttattct atggaacatt ttcgttgggg taaacctgtt 120ggtggtggcg gtggctctta ttctatggaa cattttcgtt ggggtaaacc tgttggtgag 180ctcgagtaag gatcc 195<210>3<211>252<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3gaattctgaa aaagtctgtc aattttgttt cggcgaattg ataatgtgtt atactcacaa 60
tgaaatgcag tttgcatgca cataagaaag gatgatatca ccggaaaaa aaagaaaagt 120ttctggcttg tttctttttt agttatagta gctagtgttt tctttatatc ttttggattt 180agcaatcatt ctaaacaagt tgctcaagcg gctagcgata cgacatcaac tgatcactca 240agcaatggta cc 252<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4ggggtaccag atctctagat ggtggc 26<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>5cccaagcttg gatccttact cgagctcacc 30<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>6aactgcagtg caggcacagc ttgatgcg 28<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>7cccaagcttc cttttgtgtc attggtaaac c 31<210>8<211>67
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>8tgataattat tatttaggtg agctttgttg ataaaaaggt cttttcaacg tttatgttgg 60ggagacc67<210>9<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>9gtttttccta acaaaggcct aattttttca atataaaaag gtctccccaa cataaacgtt 60gaaaagacc 69<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>10cgggatcctg ataattatta tttaggtg 28<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>11aactgcaggt ttttcctaac aaaggcc 27<210>12<211>252<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>12
gaattctgaa aaagtctgtc aattttgttt cggcgaattg ataatgtgtt atactcacaa 60tgaaatgcag tttgcatgca cataagaaag gatgatatca ccgtgaaaaa aaagaaaagt 120ttctggcttg tttctttttt agttatagta gctagtgttt tctttatatc ttttggattt 180agcaatcatt ctaaacaagt tgctcaagcg gctagcgata cgacatcaac tgatcactca 240agcaatggta cc 252<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>13tccccgcggt gaaaaagtct gtcaattttg 30<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>14gctctagaat tgcttgagtg atcagttg 28<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>15ctagatctta ttctatggaa cattttcgtt ggggtaaacc tgtttaatga g 51<210>16<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>16gatcctcatt aaacaggttt accccaacga aaatgttcca gagaataaga t 51
<210>17<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>17tcatctagaa aagcaggggc cagtacagc29<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>18ccggatcct tagcttttca ttttgatc 28<210>19<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>19atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ggtgcttttctt actctatg 78<210>20<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>20ttaaactggc ttaccccatc tgaagtgttc catagagtaa gaagcaccag cagctaatgc 60<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸
<400>21gggaattcat gagatttcct tcaattttta c 31<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400> 22ggaagctttt aaactggctt acccc25<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>23atgagatttc cttcaatttt tactgc 26<210>24<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>24atagagtaag aagcacctct tttatccaaa gataccc 37<210>25<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>25tgttccatag agtaagatct tttatccaaa gataccc 37<210>26<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸
<400>26gcgaattcat gagatttcct tcaattttta c 31<210>27<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>27ggaagcttaa actggcttac cccatctgaa gtgttccata gagtaagaag cacctc 56<210>28<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>28ggaagcttaa actggcttac cccatctgaa gtgttccata gagt 44<210>29<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>29ccggatccat gagatttcct tcaattttta c 31<210>30<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>30gcgaattcag cacctctttt atccaaagat acc 33<210>31<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>31ccatcgatgg ttctgctagc gccaaaagct c 31<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>32cagctcgagt tagaatagca ggtacgac 28<210>33<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>33cggaattcat ggctagcaaa ggagaag 27<210>34<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>34ggaagctttt aatcgatgtt gtacagttc29<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>35gggagcaggg gccagtacag 20<210>36<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸<400>36cccaagcttt taccatcacc tgcacc 26<210>37<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>37cccggtaccg tcatgtaatt agttatgtc29<210>38<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>38cgtgcttctg gtacatactt gcaatttata cagtgatgac cgctggacca tgattacgcc 60aag63<210>39<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>39tttagcatgg ccattgaatg taacaattat atatatcgca agcacgattc ggtaatctcc 60gag63<210>40<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>40ccaatgcatg gcacagcttg atgcgatc 28
<210>41<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>41ccaatgcatg tgtcattggt aaacctgac29<210>42<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>42gggaagcttt tagcttttca ttttgatcat c 3權(quán)利要求
1.一種治療性化合物傳遞載體，包括已分離的轉(zhuǎn)化的正常微生物群載體，該載體具有至少一個(gè)被刪除或被突變的看家基因，從而導(dǎo)致所述的看家基因失去操作功能；以及至少一個(gè)轉(zhuǎn)化核酸序列，該核酸序列含有至少一個(gè)編碼所述的看家基因的可操作形式的核酸序列和目的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的看家基因是胸苷酸合成酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的轉(zhuǎn)化核酸是染色體外質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的轉(zhuǎn)化核酸是整合的表達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的目的基因編碼選自細(xì)胞因子、激素的蛋白或多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的細(xì)胞因子選自干擾素、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的激素選自α-促黑色素細(xì)胞激素、胰島素、成長(zhǎng)激素、副甲狀腺激素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的載體是細(xì)菌或酵母菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的細(xì)菌包括短乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌、德氏乳桿菌亞屬保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、戊糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、Lactobacillus amylovorus、乳球菌、Lactococcus cremoris、鏈球菌屬、戈登氏鏈球菌、大腸桿菌、新月柄細(xì)菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的酵母菌是釀酒酵母。
11.一種治療或減輕動(dòng)物體內(nèi)炎癥疾病的方法包括制備的轉(zhuǎn)化的正常微生物載體，該載體含有至少一個(gè)被刪除或被突變看家基因，從而導(dǎo)致看家基因不可操作，以及含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)化核酸序列，該序列包括至少一個(gè)編碼抗炎化合物的目的基因和一個(gè)編碼有操作的所述看家基因的核酸序列，其中通過(guò)所述的載體表達(dá)轉(zhuǎn)化的核酸序列。將所述轉(zhuǎn)化的正常微生物群載體給與所需的動(dòng)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的治療或減輕炎癥疾病的方法，其中所述的抗炎分化合物是α-促黑色素細(xì)胞激素。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的治療或減輕炎癥疾病的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化的微生物載體是乳酸菌或酵母菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的治療或減輕炎癥疾病的方法，其中所述的炎癥疾病是眼色素膜炎。
15.-根據(jù)權(quán)利要求11所述的治療或減輕炎癥疾病的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化的微生物生物載體為局部應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的治療或減輕炎癥疾病的方法，其中所述的抗炎化合物是分泌的。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的治療或減輕炎癥疾病的方法，其中所述的抗炎化合物是在所述的轉(zhuǎn)化的正常微生物群載體的表面表達(dá)。
18.一個(gè)治療性化合物傳遞載體包括含有至少一個(gè)報(bào)告基因的分離轉(zhuǎn)化的正常微生物群載體，該基因選自綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、淀粉酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶；以及包含至少一個(gè)目的基因的至少一個(gè)轉(zhuǎn)化核酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的載體是細(xì)菌或酵母菌。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的治療性化合物傳遞載體，其中所述的細(xì)菌選自短乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌、德氏乳桿菌亞屬保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、戊糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、Lactobacillus amylovorus、乳球菌、Lactococcus cremoris、鏈球菌屬、戈登氏鏈球菌、大腸桿菌、新月莖菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了由含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)化核酸序列(包含至少一個(gè)目的基因)的正常微生物群載體組成的臨床應(yīng)用級(jí)載體。編碼治療性多肽的轉(zhuǎn)化核酸可通過(guò)局部給藥、口服、經(jīng)鼻和/或皮膚給藥而被傳送到所需宿主。臨床應(yīng)用級(jí)載體從乳酸菌、酵母菌和其它非致病性微生物中獲得，并被賦予選擇和/或報(bào)告基因而不依賴抗生素抗性。另外，臨床應(yīng)用級(jí)載體具有表型的和/或遺傳型的特征，限制轉(zhuǎn)化的核酸序列在體內(nèi)外的傳播。本發(fā)明還提供了治療動(dòng)物疾病的有效的方法與藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1642967SQ03807300
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者陳巍, 傅曉麗, 雪莉·諾萊尼, 張智清 申請(qǐng)人:圣必健公司