一種1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，首先采用微生物轉(zhuǎn)化的方法對底物1-氰基環(huán)己基乙腈進行催化，然后采用分步分離的方法對轉(zhuǎn)化液進行分離純化，最終獲得了蛋白殘留100PPM以下，收率在85％以上，純度達到98％的產(chǎn)物，很好的解決了后續(xù)加氫反應(yīng)生成加巴噴丁時由于蛋白濃度過高對催化劑產(chǎn)生毒害作用的問題，也提高了加巴噴丁的產(chǎn)量。
【專利說明】一種1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，特別涉及利用含重組腈水解酶 的工程菌生物轉(zhuǎn)化制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 1-氰基環(huán)己基乙酸（1-cyanocyclohexaneaceticacid)是制備抗癲癇藥物加巴 噴丁的重要中間體。
[0003]加巴噴?。╣abapentin)，化學(xué)名稱為1-氨甲基-1-環(huán)己基乙酸，別名為卡巴番定、 迭力。其結(jié)構(gòu)與氨基丁酸（GABA)類似，主要用于治療癲癇及多種神經(jīng)性疼痛，是一種新 型的抗癲癇藥物。常溫下，加巴噴丁為白色或類白色結(jié)晶性粉末，無味。分子式為：C9H17N02。 相對分子質(zhì)量為171. 24,易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。
[0004]加巴噴丁的分子結(jié)構(gòu)比較簡單，既有氨基又有羧基，易脫水形成五元環(huán)的螺環(huán)內(nèi) 酯，也是六元環(huán)的同一碳原子上帶有兩個取代基。所以，大部分研究者都以六元環(huán)化合物為 起始原料。當前工業(yè)合成加巴噴丁主要通過化學(xué)方法以環(huán)己酮、環(huán)己基甲醛、亞甲基環(huán)己烷 等為原料經(jīng)過一系列的環(huán)化、脫羧、重排、水解等反應(yīng)最終制得。但是現(xiàn)有路線有很多的問 題：（1)反應(yīng)條件苛刻，需在強酸、強堿條件下反應(yīng)；（2)所用原料毒性較大，操作危險，運輸 困難，易污染環(huán)境；(3)反應(yīng)時間長，費時費力；(4)反應(yīng)收率低，影響經(jīng)濟效益。所以現(xiàn)使用 一條化學(xué)酶法合成加巴噴丁的路線。
[0005]加巴噴丁的化學(xué)酶法合成路線，是以環(huán)己酮為原料，首先制得1-氰基環(huán)己基乙 腈，然后再以腈水解酶催化生成1-氰基環(huán)己基乙酸，最后通過催化加氫得到加巴噴丁。整 個過程操作方便、對環(huán)境友好而且收率高。而1-氰基環(huán)己基乙酸是腈水解酶法制取加巴噴 丁過程中最關(guān)鍵的中間體。
[0006]化學(xué)酶法具有收率高，純度高，副產(chǎn)物少，易操作和環(huán)境友好等優(yōu)點，是一種較為 有效的廉價生產(chǎn)的方法。加巴噴丁化學(xué)酶法合成路線的關(guān)鍵，是腈水解酶催化1-氰基環(huán)己 基乙腈生成1-氰基環(huán)己基乙酸，催化完成的生物轉(zhuǎn)化液中含有大量菌體，以及一些細胞破 裂后流出的細胞液，蛋白質(zhì)，糖類等雜質(zhì)。如需進行下一步反應(yīng)，需先將生物轉(zhuǎn)化液中的大 量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)除去。
[0007]現(xiàn)有對1-氰基環(huán)己基乙酸的分離提取的技術(shù)，還未見其文獻報道。一般對有機羧 酸的提取是通過有機溶劑的萃取，或者膜過濾裝置，或者離子交換層析。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的是提供一種1-氰基環(huán)己基乙酸的分離提取方法，可以快速、有效地將 生物轉(zhuǎn)化液中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除，并且擁有較高的收率，便于其進行下一步加氫反應(yīng)。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明提供一種1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，所述方法為：（1)生物轉(zhuǎn)化：以腈 水解酶為催化劑，以1-氰基環(huán)己基乙腈為底物，以pH值為7. 0的緩沖液（優(yōu)選PBS緩沖液） 或去離子水為反應(yīng)介質(zhì)，在35°C進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后,獲得轉(zhuǎn)化液；（2)分離純化：① 將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)化液調(diào)pH值至7. 3?8. 0,離心，獲得上清液和沉淀；②取上清液加入 聚合硫酸鐵，攪拌絮凝，抽濾，獲得濾液a和濾餅a;③向濾液a中加入活性炭，攪拌除色（優(yōu) 選60°C攪拌30min)，抽濾，獲得濾液c和濾餅c;所述活性炭的質(zhì)量加入量以濾液a體積計 為0. 001?0. 01g/ml;④將濾液c調(diào)節(jié)pH值為2. 0?2. 5,靜置沉淀，抽濾，獲得濾餅e和 濾液e，將濾餅e干燥，獲得1-氰基環(huán)己基乙酸。

【權(quán)利要求】
1. 一種1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述方法為：（1)生物轉(zhuǎn)化：以腈 水解酶為催化劑，以1-氰基環(huán)己基乙腈為底物，以pH值為7. 0的緩沖液或去離子水為反應(yīng) 介質(zhì)，在35°C進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得轉(zhuǎn)化液；(2)分離純化：①將步驟（1)獲得的 轉(zhuǎn)化液調(diào)pH值至7. 3?8. 0,離心，獲得上清液和沉淀；②取上清液加入聚合硫酸鐵，攪拌 絮凝，抽濾，獲得濾液a和濾餅a ;③向濾液a中加入活性炭，攪拌除色，抽濾，獲得濾液c和 濾餅c ;④將濾液c調(diào)節(jié)pH值為2. 0?2. 5,靜置沉淀，抽濾，獲得濾餅e和濾液e，將濾餅e 干燥，獲得1-氰基環(huán)己基乙酸。
2. 如權(quán)利要求1所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述催化劑的質(zhì)量濃 度為2. 5?50g/L反應(yīng)介質(zhì)，底物的初始濃度為lmol/L反應(yīng)介質(zhì)。
3. 如權(quán)利要求1所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述步驟②具體為： 取上清液加入終濃度3?5g/L聚合硫酸鐵，在20?30°C、200rpm條件下攪拌l-10min，然 后再在30°C、50rpm條件下攪拌5-30min，4°C下靜置沉降20-60min，抽濾，獲得濾液a和濾 餅a。
4. 如權(quán)利要求1所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述腈水解酶為含 腈水解酶突變體的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體，所述含腈水解酶突變體的工程菌按如 下方法獲得：（1)以敏捷食酸菌（Acidovorax facilis)ZJB09122基因組DNA為模板，以序 列1和序列2為引物，通過PCR方法獲得含重組腈水解酶基因的克隆載體；然后再以含重 組腈水解酶基因的克隆載體為模板，以序列3和序列4為引物，使用高保真的DNA聚合酶擴 增目標腈水解酶基因，運用酶切連接的方法，構(gòu)建了含重組腈水解酶基因的表達載體；序列 1 :5, -ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3，，序列 2 :5, -CTACTTTGCTGGGACCGG-3，， 序列 3 :5'-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3' 序列 4 :5' -AGGGTCGACCTACTTTGCTG GGACCGG-3,； (2)以步驟（1)構(gòu)建的含重組腈水解酶基因的表達載體為模版，以序列5和序列6為引 物，根據(jù)Quikchange定點突變方法，擴增得到含重組腈水解酶突變體的表達載體，并將突 變表達載體轉(zhuǎn)化至宿主菌，得到含腈水解酶突變體的工程菌； 序列 5 :5' -GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3，； 序列 6 :5' -CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3'。
5. 如權(quán)利要求1所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述聚合硫酸鐵的加 入量為3?5g/L。
6. 如權(quán)利要求1所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述③中將濾餅a用 蒸餾水洗滌，抽濾，獲得濾餅b和濾液b，將濾液b和濾液a合并后加入活性炭；所述活性炭 的質(zhì)量加入量以濾液a和濾液b總體積計為0. 001?0. 01g/ml。
7. 如權(quán)利要求1所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述④中將濾餅c用 蒸餾水洗滌，抽濾，獲得濾餅d和濾液d，合并濾液c和濾液d并調(diào)節(jié)pH值為2. 0?2. 5。
8. 如權(quán)利要求4所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于所述濕菌體按如下步 驟制備： (1)斜面培養(yǎng) 將含腈水解酶的工程菌或含腈水解酶突變體的工程菌接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng) 24h，獲得菌體斜面；斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L， 瓊脂30g/L，溶劑為去離子水，pH值自然； (2) 種子培養(yǎng) 從菌體斜面挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10h，獲得種子液；種子培 養(yǎng)基終濃度組成為：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，卡納霉素50mg/L，溶劑為去 離子水，pH值自然； (3) 發(fā)酵培養(yǎng) 將步驟（2)獲得的種子液以體積濃度2%的接種量接種至發(fā)酵罐，37°C發(fā)酵培養(yǎng)4h后， 降溫至30°C，添加終濃度10g/L乳糖進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)至0D值達到25-40,停止發(fā)酵，發(fā) 酵過程中pH維持在6. 5,取發(fā)酵液離心，得到濕菌體；發(fā)酵培養(yǎng)基每3L組成為：蛋白胨45g、 酵母粉36g、NaC130g、甘油36g、磷酸二氫鉀4. 08g、磷酸氫二鉀6. 84g、硫酸鎂1. 125g、硫酸 銨15g，溶劑為去離子水，pH值為6. 5。
9. 如權(quán)利要求1所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于步驟（2)分離純化方 法為：①將步驟（1)獲得的轉(zhuǎn)化液調(diào)pH值至7. 3?8. 0,離心，獲得上清液和沉淀；②取上 清液加入無水乙醇，在20?30°C、200rpm條件下攪拌lh，抽濾，獲得濾液A和濾餅A ;將濾 液A在35°C減壓濃縮至無液體流出，獲得濃縮液；③使用去離子水將濃縮液定容至濃縮前 體積，再加入活性炭，60°C攪拌30min，抽濾，獲得濾液B和濾餅B，將濾餅B用蒸餾水洗滌， 抽濾，獲得濾餅C和濾液C ;所述活性炭的質(zhì)量加入量以定容后濃縮液體積計為0. 001? 0. 01g/ml ;④合并濾液B和濾液C并調(diào)節(jié)pH值為2. 0?2. 5, 20?30°C靜置沉淀，抽濾，獲 得濾餅D和濾液D，將濾餅D干燥，獲得1-氰基環(huán)己基乙酸。
10. 如權(quán)利要求9所述1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，其特征在于無水乙醇體積加入 量是上清液體積的1. 5-4倍。
【文檔編號】C12P13/00GK104342463SQ201410395025
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】鄭裕國, 薛亞平, 柳志強, 蘇新瑞, 黃有明, 翁建峰, 王應(yīng)鵬, 賈東旭 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)