抗als抑制劑類除草劑播娘蒿的pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的特異性PCR引物對，包括用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-1基因的引物對（Seq?ID?No.1-2）以及用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-2基因的引物對（Seq?ID?No.3-4）。采用該引物的PCR檢測方法具有極好的特異性和靈敏性，經(jīng)特異性試驗證明（圖1、2）能夠?qū)⒉ツ镙锏膬蓚€ALS基因擴增出來。由于PCR方法操作簡便快捷，基于對核苷酸的檢測，當季就可以取樣檢測，從取樣到出結(jié)果僅需2～4天。其靈敏度和特異性能夠?qū)崿F(xiàn)對田間疑似抗ALS抑制劑播娘蒿的快速鑒定和突變位點的確認，從而指導生產(chǎn)實踐中抗性雜草的科學治理。
【專利說明】抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的PCR檢測方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗除草劑雜草檢測技術(shù)，具體地說，涉及一種抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的PCR檢測方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,簡稱ALS),也稱乙酰輕酸合酶(acetohydroxyacid synthase,簡稱AHAS),是誘導植物和微生物體內(nèi)纟顏氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成過程中關(guān)鍵性酶，也是一種重要的除草劑靶標。ALS抑制劑類除草劑的開發(fā)及使用始于上世紀80年代初，由于此類除草劑有超高活性、對人及動物低毒、環(huán)境友好等明顯的優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注，目前已有50多個品種被開發(fā)和使用。上世紀80年代開始，我國陸續(xù)在冬小麥田推廣使用苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、噻吩磺隆、二甲碘磺隆、氟唑磺隆、啶磺草胺等，2009年僅苯磺隆在我國的產(chǎn)量就達230多噸(有效成分)，相當于麥田化除面積2億多畝。苯磺隆作為小麥田最經(jīng)濟、有效的優(yōu)秀除草劑，對控制播娘蒿、薺菜等闊葉雜草起到了非常重要的作用。但由于該類除草劑分子靶標單一，長期使用易引起雜草抗藥性，近些年來，以常規(guī)劑量噴施苯磺隆無法有效防除播娘蒿的問題在我國河北、陜西、山東、河南、山西等地的一些麥田非常突出，并且發(fā)現(xiàn)，有些麥田抗苯磺隆的播娘蒿對雙氟磺草胺、氯磺隆等ALS抑制劑也產(chǎn)生了交互抗性。麥田雜草對上述幾種ALS抑制劑產(chǎn)生交互抗性，使這些農(nóng)田不能繼續(xù)使用該類除草劑，而在生產(chǎn)中由于農(nóng)民對雜草抗藥性的認識上的不足，盲目增大用藥劑量，不僅增加了成本，使藥害風險加大，嚴重影響農(nóng)民收入和國家糧食安全。因此，目前迫切需要一個簡便，快速的抗藥性雜草檢測鑒定方法。
[0003]我國抗藥性雜草的研究起步較晚，傳統(tǒng)的抗藥性雜草檢測通常采用室內(nèi)生物測定法，既對田間采集的疑似抗性的雜草的種子在室內(nèi)進行培養(yǎng)，在一定葉齡噴施除草劑后，調(diào)查株防效和地上部分生物量來計算抗性指數(shù)。這種方法能夠客觀地評價某種雜草對相應除草劑的抗性情況，但也有其局限性，主要表現(xiàn)在以下兩方面:一是不能當季、當時進行檢測，二是占地多、時間長、工作量大。隨著分子生物學技術(shù)在雜草抗藥性機理研究方面的應用，越來越多的雜草的抗藥性機理得到明確。其中，播娘蒿對苯磺隆等ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的原因已明確為編碼苯磺隆靶標的ALS保守區(qū)某一位點發(fā)生點突變引起的。研究中發(fā)現(xiàn)，播娘蒿具有兩個ALS基因，分別命名為B-ALS-1和B-ALS-2，這兩個基因都具有功能，任意一個基因在保守區(qū)發(fā)生突變，都能夠引起抗藥性產(chǎn)生。因此，可以通過分子生物學手段檢測其靶標酶ALS的保守區(qū)突變位點來檢測播娘蒿是否發(fā)生抗藥性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的PCR檢測方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的試劑盒。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的特異性PCR引物對，包括用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-1基因的引物對以及用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-2基因的引物對，引物序列如下:
[0007]I)用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-1基因的引物對:
[0008]正向引物B-ALS-1F:5’ -TCTATCTCTCGCTCCTCTCC-3’
[0009]反向引物B-ALS-1R: 5 ’ -CAAACAAACAGCAGTAGCG-3 ’
[0010]2)用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-2基因的引物對:
[0011]正向引物B-ALS-2F: 5，-CTTCTTCTCCTCCAACGA-3 ’
[0012]反向引物B-ALS-2R: 5，-GCCATCTCCTTCCGTTATGA-3，
[0013]本發(fā)明還提供含有上述引物對的用于檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的試劑盒。
[0014]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液等中的至少一種。
[0015]更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0016]本發(fā)明還提供一種抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的PCR檢測方法，其利用上述引物對或試劑盒檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿。
[0017]前述方法，包括以下步驟:
[0018]I)提取樣品中的DNA ；
[0019]2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行PCR擴增反應；
[0020]3)分析PCR產(chǎn)物。
[0021 ] PCR反應體系以20 μ I計為:
[0022]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的特異性PCR引物對，其特征在于，包括用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-1基因的引物對以及用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-2基因的引物對，引物序列如下: 1)用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-1基因的引物對: 正向引物 B-ALS-1F:5’ -TCTATCTCTCGCTCCTCTCC-3’ 反向引物 B-ALS-1R:5’ -CAAACAAACAGCAGTAGCG-3’ 2)用于特異性擴增播娘蒿B-ALS-2基因的引物對: 正向引物 B-ALS-2F:5’ -CTTCTTCTCCTCCAACGA-3’ 反向引物 B-ALS-2R:5’ -GCCATCTCCTTCCGTTATGA-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述引物對的用于檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿的PCR檢測方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述引物對或權(quán)利要求2-4任一項所述試劑盒檢測抗ALS抑制劑類除草劑播娘蒿。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品中的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行PCR擴增反應； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反應體系以20μ I計為:
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為:94°C3分鐘；94°C 1分鐘，56°C 1分鐘，72°C 1分鐘，共30個循環(huán)；72°C 10分鐘。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923996SQ201410158000
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】崔海蘭, 李香菊, 王藏月 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所