用于檢測除草劑耐受性大豆植物dbn9004的核酸序列及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及其檢測方法，所述大豆植物的核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互補(bǔ)序列、或者SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004對草甘膦除草劑和草銨膦除草劑具有較好的耐受性，對產(chǎn)量無影響，且檢測方法可以準(zhǔn)確快速的鑒定生物樣品中是否包含轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA分子。CGMCC No.1117120151127
【專利說明】
用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及其檢 測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及其檢測方 法，特別是涉及一種耐受草甘膦和草銨膦的大豆植物DBN9004和檢測生物樣品中是否包含 特定轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA分子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] N-膦酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦，是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型慢性廣譜滅生性除草劑。草 甘膦是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的合成底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的競 爭性抑制劑，可抑制PEP和3-磷酸莽草酸這兩種底物在EPSPS催化下向5-烯醇丙酮酰莽草 酸-3-磷酸莽草酸的轉(zhuǎn)化，從而阻斷芳香族氨基酸合成前體-莽草酸的合成途徑，使蛋白質(zhì) 的合成受到干擾導(dǎo)致植物和細(xì)菌死亡。
[0003] 草甘膦耐受性可以通過表達(dá)修飾的EPSPS來實(shí)現(xiàn)。修飾的EPSPS對草甘膦具有更低 的親和性，因而在草甘膦存在的情況下，EPSPS保持了它們的催化活性，即獲得了草甘膦耐 受性。
[0004] 大豆(Glycine max)是世界五大主栽作物之一。在大豆生產(chǎn)中除草劑耐受性是一 項(xiàng)重要的農(nóng)藝性狀，特別是對草甘膦除草劑的耐受性。大豆對草甘膦除草劑的耐受性可以 通過轉(zhuǎn)基因的方法使草甘膦除草劑耐受型基因（EPSPS，CP4)在大豆植物中表達(dá)而獲得，例 如大豆事件GTS40-3-2、大豆事件M0N89788等。
[0005] 草甘膦耐受性耕種系統(tǒng)的普遍采用和草甘膦使用的日益增加已經(jīng)導(dǎo)致近年來草 甘膦抗性雜草的流行。在種植者面對草甘膦抗性雜草或向更難以控制的雜草物種轉(zhuǎn)變的地 區(qū)，種植者可以通過與能夠控制遺漏雜草的其他除草劑混合或交替使用來補(bǔ)償草甘膦的弱 點(diǎn)。
[0006] 草銨膦是膦絲菌素類除草劑中的一種非系統(tǒng)性、非選擇性除草劑。主要用于一年 生或多年生闊葉雜草的出土后控制，是通過L-膦絲菌素(草銨膦中的活性成分)對谷氨酰胺 合酶（一種對于植物中的氨解毒必需的酶）的不可逆抑制來控制雜草的。與草甘膦殺根不 同，草銨膦先殺葉，通過植物蒸騰作用可以在植物木質(zhì)部進(jìn)行傳導(dǎo)，其速效性間于百草枯和 草甘膦之間。
[0007] 從鏈霉菌分離的膦絲菌素 N-乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)通過乙?；呋疞-膦絲菌素轉(zhuǎn)化 為其無活性形式。表達(dá)PAT的植物優(yōu)化形式的基因已經(jīng)在大豆中使用以賦予大豆對草銨膦 除草劑的耐受性，例如大豆事件A5547-127。因此與草銨膦耐受性性狀組合使用草銨膦除草 劑可以作為一種有效管理草甘膦抗性雜草的非選擇性手段。
[0008] 在未來，隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲大豆的推廣以及大面積種植，少量存活下來的昆蟲/害蟲 經(jīng)過幾代繁殖后，可能產(chǎn)生抗性。轉(zhuǎn)基因除草劑耐受性大豆作為非抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆，與轉(zhuǎn)基 因抗蟲大豆以一定比例一并種植，可以延緩昆蟲/害蟲產(chǎn)生抗性。
[0009] 已知外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)受到它們的染色體位置的影響，可能是由于染色 質(zhì)結(jié)構(gòu)（如異染色質(zhì)）或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(如增強(qiáng)子)接近整合位點(diǎn)。為此，通常需要篩選大量 的事件才有可能鑒定出可以商業(yè)化的事件（即導(dǎo)入的目標(biāo)基因得到最優(yōu)表達(dá)的事件）。例 如，在植物和其他生物體中已經(jīng)觀察到導(dǎo)入基因的表達(dá)量在事件間可能有很大差異;在表 達(dá)的空間或時間模式上可能也存在差異，如在不同植物組織之間轉(zhuǎn)基因的相對表達(dá)存在差 異，這種差異表現(xiàn)在實(shí)際的表達(dá)模式可能與根據(jù)導(dǎo)入的基因構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件所預(yù) 期的表達(dá)模式不一致。因此，通常需要產(chǎn)生成百上千個不同的事件并從這些事件中篩選出 具有以商業(yè)化為目的所預(yù)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)量和表達(dá)模式的單一事件。具有預(yù)期的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)量和表達(dá)模式的事件可用于采用常規(guī)育種方法通過有性異型雜交將轉(zhuǎn)基因滲入到其他 遺傳背景中。通過這種雜交方式產(chǎn)生的后代保持了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。應(yīng)用這 種策略模式可以確保在許多品種中具有可靠的基因表達(dá)，而這些品種能很好的適應(yīng)當(dāng)?shù)氐?生長條件。
[0010]能夠檢測特定事件的存在以確定有性雜交的后代是否包含目的基因?qū)⑹怯幸娴摹?此外，檢測特定事件的方法還將有助于遵守相關(guān)法規(guī)，例如來源于重組農(nóng)作物的食物在投 入市場前需要獲得正式批準(zhǔn)和進(jìn)行標(biāo)記。通過任何熟知的多核苷酸檢測方法來檢測轉(zhuǎn)基因 的存在都是可能的，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或利用多核苷酸探針的DNA雜交。這些檢測 方法通常集中于常用的遺傳元件，例如啟動子、終止子、標(biāo)記基因等。因此，除非與插入的轉(zhuǎn) 基因 DNA相鄰的染色體DNA( "側(cè)翼DNA"）的序列是己知的，上述這種方法就不能夠用于區(qū)別 不同的事件，特別是那些用相同的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的 轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼DNA的接合部位的一對引物通過PCR來鑒定轉(zhuǎn)基因特定事件，具體地說是包含 側(cè)翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及 其檢測方法，轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004對草甘膦除草劑和草銨膦除草劑具有較好的耐受性， 且檢測方法可以準(zhǔn)確快速的鑒定生物樣品中是否包含特定轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA 分子。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種具有以下核酸序列的核酸分子，所述核酸序 列包括SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ) 序列中至少11個連續(xù)的核苷酸。
[0013] 優(yōu)選地，所述核酸序列包括SEQ ID N0:1或其互補(bǔ)序列、和/或SEQ ID N0:2或其互 補(bǔ)序列。
[0014] 進(jìn)一步地，所述核酸序列包括SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列、和/或SEQ ID N0:4或其 互補(bǔ)序列。
[0015] 更進(jìn)一步地，所述核酸序列包括SEQ ID N0:5或其互補(bǔ)序列。
[0016] 所述SEQ ID N0:1或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序列的5'末 端位于插入接合部位附近的一個長度為22個核苷酸的序列，所述SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序 列跨越了大豆插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組DNA序列和插入序列的5'末端的DNA序列，包含所述 SEQ ID N0:1或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的存在。所述SEQ ID N0:2 或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序列的3'末端位于插入接合部位附近的 一個長度為22個核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列跨越了插入序列的3'末端 的DNA序列和大豆插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組DNA序列，包含所述SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列即 可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的存在。
[0017]本發(fā)明中，所述核酸序列可以為所述SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列中轉(zhuǎn)基因插入序 列的任何部分的至少11個或更多個連續(xù)多核苷酸(第一核酸序列），或者為所述SEQ ID N0: 3或其互補(bǔ)序列中5'側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域的任何部分的至少11個或更多個連續(xù)多核苷 酸(第二核酸序列）。所述核酸序列進(jìn)一步可以為同源于或互補(bǔ)于包含完整的所述SEQ ID NO: 1的所述SEQ ID N0:3的一部分。當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄泻偷诙怂嵝蛄幸黄鹗褂脮r，這些核酸 序列可作為DNA引物對用于產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA擴(kuò)增方法中。使用DNA引物對在DNA擴(kuò)增方法 中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物是包括SEQ ID NO: 1的擴(kuò)增產(chǎn)物時，可以診斷轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004或 其后代的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，第一和第二核酸序列不必僅僅由DNA組成，也可包 括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其他不作為一種或多種聚合酶模板的核苷酸或 其類似物的組合。此外，本發(fā)明中所述探針或引物應(yīng)該是至少大約11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21或22個連續(xù)核苷酸的長度，其可以選自SEQIDN0 :1、SEQIDN0:2、SEQID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 中所述的核苷酸。當(dāng)選自 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5所示的核苷酸時，所述探針和引物可以為長度是至少大約21個到大約50個或 更多的連續(xù)核苷酸。所述SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序 列的5'末端位于插入接合部位附近的一個長度為1207個核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:3 或其互補(bǔ)序列由740個核苷酸的大豆側(cè)翼基因組DNA序列（SEQ ID NO: 3的核苷酸1-740)、74 個pDBN4003構(gòu)建體DNA序列中的核苷酸（SEQIDN0:3的核苷酸741-814)、195個核苷酸的 t35S終止子序列（SEQ ID N0:3的核苷酸815-1009)、21個核苷酸的載體間隔序列（SEQ ID N0:3的核苷酸1010-1030)和177個核苷酸的膦絲菌素 N-乙?；D(zhuǎn)移酶cPAT(SEQIDN0:3的 核苷酸1031-1207)的5'末端DNA序列（SEQ ID NO: 3的核苷酸815-1207)組成，包含所述SEQ ID NO: 3或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的存在。
[0018]所述核酸序列可以為所述SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中轉(zhuǎn)基因插入序列的任何部 分的至少11個或更多個連續(xù)多核苷酸(第三核酸序列），或者為所述SEQ ID N0:4或其互補(bǔ) 序列中3'側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域的任何部分的至少11個或更多個連續(xù)多核苷酸(第四核 酸序列）。所述核酸序列進(jìn)一步可以為同源于或互補(bǔ)于包含完整的所述SEQ ID N0:2的所述 SEQ ID N0:4的一部分。當(dāng)?shù)谌怂嵝蛄泻偷谒暮怂嵝蛄幸黄鹗褂脮r，這些核酸序列可作為 DNA引物對用于產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA擴(kuò)增方法中。使用DNA引物對在DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生的擴(kuò) 增產(chǎn)物是包括SEQ ID N0:2的擴(kuò)增產(chǎn)物時，可以診斷轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004或其后代的存 在。所述SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序列的3'末端位于 插入接合部位附近的一個長度為631個核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列由 226個核苷酸的prGml7gTsfl啟動子序列（SEQ ID N0:4的核苷酸1-226)、61個口08財(cái)003構(gòu)建 體DNA序列中的核苷酸（SEQIDN0:4的核苷酸227-287)、6個核苷酸的接合序列（SEQID N0:4的288-293)和338個核苷酸的大豆側(cè)翼基因組DNA序列（SEQ ID N0:4的294-631)組成， 包含所述SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的存在。
[0019] 所述SEQ ID N0: 5或其互補(bǔ)序列為表征轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的長度為7059個 核苷酸的序列，其具體包含的基因組和遺傳元件如表1所示。包含所述SEQ ID N0:5或其互 補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的存在。
[0020] 表1、SEQ ID N0:5包含的基因組及遺傳元件
[0021]
[0022]所述核酸序列或其互補(bǔ)序列可用于DNA擴(kuò)增法中以產(chǎn)生擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子的檢 測診斷生物樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004或其后代的存在;所述核酸序列或其互補(bǔ)序列 可用于核苷酸檢測法中，以檢測生物樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004或其后代的存在。 [0023]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA 存在的方法，包括：
[0024] 使待檢測樣品與用于擴(kuò)增目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的至少兩種引物在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中接觸；
[0025] 進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng);和
[0026] 檢測所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在；
[0027]所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物包括SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/ 或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸。
[0028]進(jìn)一步地，所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。 [0029]更進(jìn)一步地，所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物包括選自以下的至少一種:SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ) 序列、SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:6或其互補(bǔ)序列、和SEQ ID N0:7或其互補(bǔ)序 列。
[0030] 在上述技術(shù)方案中，至少一種所述引物包括所述核酸序列或其片段或者與之互補(bǔ) 的序列。
[0031] 具體地，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物選自SEQ ID N0:8和 SEQ ID NO: 10;所述第二引物選自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 11。
[0032] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA 存在的方法，包括：
[0033]使待檢測樣品與探針接觸，所述探針包括SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)序列中至少11個 連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸；
[0034]使所述待檢測樣品和所述探針在嚴(yán)格雜交條件下雜交;和 [0035]檢測所述待檢測樣品和所述探針的雜交情況。
[0036]所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC(檸檬酸鈉）、0.5%SDS(十二烷基硫酸鈉）溶液中，在 65°C下雜交，然后用2 X SSC、0.1 %SDS和1 X SSC、0.1 %SDS各洗膜1次。
[0037] 進(jìn)一步地，所述探針包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù) 核苷酸、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。
[0038] 更進(jìn)一步地，所述探針包含選自以下的至少一種:SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:6或其互補(bǔ)序列、和SEQ ID N0:7或其互補(bǔ)序列。
[0039] 可選擇地，至少一個所述探針用至少一種熒光基團(tuán)標(biāo)記。
[0040]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA 存在的方法，包括：
[0041] 使待檢測樣品與標(biāo)記物核酸分子接觸，所述標(biāo)記物核酸分子包括SEQ ID N0:3或 其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的 核苷酸；
[0042] 使所述待檢測樣品和所述標(biāo)記物核酸分子在嚴(yán)格雜交條件下雜交;和
[0043] 檢測所述待檢測樣品和所述標(biāo)記物核酸分子的雜交情況，進(jìn)而通過標(biāo)記物輔助育 種分析以確定草甘膦耐受性和/或草銨膦耐受性與標(biāo)記物核酸分子在遺傳學(xué)上是連鎖的。 [0044]進(jìn)一步地，所述標(biāo)記物核酸分子包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第 12-22位連續(xù)核苷酸、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷 酸。
[0045] 更進(jìn)一步地，所述標(biāo)記物核酸分子包括選自以下的至少一種:SEQ ID NO: 1或其互 補(bǔ)序列、SEQ ID NO :2或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO :6或其互補(bǔ)序列、和SEQ ID NO :7或其互補(bǔ) 序列。
[0046] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種DNA檢測試劑盒，包括至少一個DNA分子，所 述DNA分子包括SEQ ID N0:3的同源序列或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4的同源序列或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸，其可以作為對于轉(zhuǎn)基因大豆 事件DBN9004或其后代具有特異性的DNA引物或探針。
[0047] 進(jìn)一步地，所述DNA分子包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位 連續(xù)核苷酸、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。
[0048] 更進(jìn)一步地，所述DNA分子包括選自以下的至少一種：SEQ ID NO: 1的同源序列或 其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:2的同源序列或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:6的同源序列或其互補(bǔ)序 列、和SEQ ID N0:7的同源序列或其互補(bǔ)序列。
[0049] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種植物細(xì)胞或部分，包含編碼草甘膦耐受性 EPSPS蛋白的核酸序列、編碼草銨膦耐受性PAT蛋白的核酸序列和特定區(qū)域的核酸序列，所 述特定區(qū)域的核酸序列包括選自以下的至少一種：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0: 6和SEQ ID NO:7所示的序列。
[0050] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑 具有耐受性的大豆植株的方法，包括向所述大豆植株的基因組中引入編碼草甘膦耐受性 EPSPS蛋白的核酸序列和/或編碼草銨膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、以及特定區(qū)域的核酸 序列，所述特定區(qū)域的核酸序列選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列。
[0051]具體地，所述產(chǎn)生對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑具有耐受性的大豆植株的 方法包括：
[0052]將對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑具有耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004第 一親本大豆植株與缺少草甘膦和/或草銨膦耐受性的第二親本大豆植株有性雜交，從而產(chǎn) 生大量子代植株；
[0053]用草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑處理所述子代植株;和
[0054] 選擇耐受草甘膦和/或草銨膦的所述子代植株。
[0055] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑 具有耐受性的大豆植物的方法，包括：
[0056]種植至少一粒大豆種子，所述大豆種子的基因組中包括編碼草甘膦耐受性EPSPS 蛋白的核酸序列和/或編碼草銨膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、以及特定區(qū)域的核酸序列； [0057]使所述大豆種子長成大豆植株;和
[0058]用有效劑量草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑噴灑所述大豆植株，收獲與其他不 具有特定區(qū)域的核酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷的植株；
[0059] 所述特定區(qū)域的核酸序列選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列。
[0060] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方 法，包括將含有有效劑量草甘膦和/或草銨膦的除草劑施加到種植至少一種轉(zhuǎn)基因大豆植 物的大田中，所述轉(zhuǎn)基因大豆植物在其基因組中包含選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ IDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6和SEQIDN0:7所示序列中至少一種核 酸序列，所述轉(zhuǎn)基因大豆植物具有對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑的耐受性。
[0061] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制田間雜草的方法，包括將含有有效劑 量草甘膦和/或草銨膦的除草劑施加到種植至少一種轉(zhuǎn)基因大豆植物的大田中，所述轉(zhuǎn)基 因大豆植物在其基因組中包含選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0: 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列，所述轉(zhuǎn)基因大 豆植物具有對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑的耐受性。
[0062]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦抗 性雜草的方法，包括將含有有效劑量草銨膦的除草劑施加到種植至少一種草甘膦耐受性的 轉(zhuǎn)基因大豆植物的大田中，所述草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物在其基因組中包含選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列，所述草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物同時具有對 草銨膦除草劑的耐受性。
[0063]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種延緩昆蟲抗性的方法，包括在種植抗蟲大 豆植物的大田中種植至少一種具有草甘膦和/或草銨膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物，所述具 有草甘膦和/或草銨膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物在其基因組中包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列 中至少一種核酸序列。
[0064] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的多核苷 酸的農(nóng)產(chǎn)品或商品，所述農(nóng)產(chǎn)品或商品為卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、大豆片、大豆粉、大豆 蛋白或其濃縮物、大豆油、大豆蛋白纖維、豆?jié){凝塊或豆腐。
[0065]在本發(fā)明用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及其檢測方法中， 以下定義和方法可以更好地定義本發(fā)明和指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，除非另 作說明，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)的用法來理解術(shù)語。
[0066]所述"大豆"是指黃豆(Glycine max)，并且包括可以與大豆交配的所有植物品種， 包括野生大豆種。
[0067]術(shù)語"包含"、"包括"是指"包括但不限于"。
[0068] 術(shù)語"植物"包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再 生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢(plant clumps)和植物或植物部分中完 整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖桿、根、根尖、花 藥等。應(yīng)理解為本發(fā)明范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物的部分包括但不限于植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組 織、愈傷組織、胚以及花、莖、果實(shí)、葉和根，以上植物部分源自事先用本發(fā)明的DNA分子轉(zhuǎn)化 的并因此至少部分地由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)基因植物或其子代。
[0069] 術(shù)語"基因"是指表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括編碼序列前的調(diào)節(jié)序列（5'非編 碼序列）和編碼序列后的調(diào)節(jié)序列（3'非編碼序列）。"天然基因"是指天然發(fā)現(xiàn)具有其自身 調(diào)節(jié)序列的基因。"嵌合基因"是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和 編碼序列。"內(nèi)源基因"是指天然基因，所述天然基因位于生物體基因組中它的天然位置。 "外源基因"是現(xiàn)存在于生物的基因組中且原來不存在的外來基因，也指經(jīng)轉(zhuǎn)基因步驟導(dǎo)入 受體細(xì)胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物體的天然基因或嵌合基因。"轉(zhuǎn)基因" 是通過轉(zhuǎn)化程序已經(jīng)被引入基因組的基因。植物基因組中重組DNA已被插入的位點(diǎn)可以稱 為"插入位點(diǎn)"或"祀位點(diǎn)"。
[0070] "側(cè)翼DNA"可以包含天然存在于例如植物的生物體中的基因組或通過轉(zhuǎn)化過程引 入的外源（異源)DNA，例如與轉(zhuǎn)化事件相關(guān)的片段。因此，側(cè)翼DNA可以包括天然和外源DNA 的組合。在本發(fā)明中，"側(cè)翼區(qū)"或"側(cè)翼序列"或"基因組邊界區(qū)"或"基因組邊界序列"是指 至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000堿基對或更長 的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且與最初外源插入DNA分子相 鄰。當(dāng)該側(cè)翼區(qū)位于下游時，其也可以稱為"左邊界側(cè)翼"或"3'側(cè)翼"或"3'基因組邊界區(qū)" 或"基因組3'邊界序列"等。當(dāng)該側(cè)翼區(qū)位于上游時，其也可以稱為"右邊界側(cè)翼"或"5'側(cè) 翼"或"5 '基因組邊界區(qū)"或"基因組5 '邊界序列"等。
[0071] 引起外源DNA的隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化程序會導(dǎo)致含有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化體，所述不同 側(cè)翼區(qū)是每個轉(zhuǎn)化體所特異性含有的。當(dāng)重組DNA通過傳統(tǒng)雜交被引入植物時，其側(cè)翼區(qū)通 常不會改變。轉(zhuǎn)化體也會含有異源插入物DNA和基因組DNA的段之間或兩段基因組DNA之間 或兩段異源DNA之間的獨(dú)特的接合。"接合"是兩個具體的DNA片段連接的點(diǎn)。例如，接合存在 于插入物DNA連接側(cè)翼DNA的位置。接合點(diǎn)還存在于轉(zhuǎn)化的生物體中，其中兩個DNA片段以修 飾自天然生物體中發(fā)現(xiàn)的方式的連接在一起。"接合DNA"、"接合區(qū)域"是指包含接合點(diǎn)的 DNA〇
[0072] 本發(fā)明提供了稱為DBN9004的轉(zhuǎn)基因大豆事件及其后代，所述轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004即為大豆植物DBN9004,其包括轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的植物和種子及其植物細(xì) 胞或其可再生部分，所述轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的植物部分，包括但不限于細(xì)胞、花粉、胚 珠、花、芽、根、莖、葉、莢和來自大豆植物DBN9004的產(chǎn)物，例如大豆餅、粉和油，具體可以為 卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、食用油、脫脂大豆片、包括脫脂的和烘烤的大豆粉、豆?jié){凝塊、 豆腐、大豆蛋白濃縮物、分離的大豆蛋白、水解植物蛋白、組織化大豆蛋白和大豆蛋白纖維。 [0073] 本發(fā)明轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004包含了一個DNA構(gòu)建體，當(dāng)其在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 時，所述轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004獲得對草甘膦除草劑和草銨膦除草劑的耐受性。所述DNA 構(gòu)建體包含兩個串聯(lián)的表達(dá)盒，第一個表達(dá)盒包含用于在植物中表達(dá)的適合的啟動子和適 合的多聚腺苷酸化信號序列，所述啟動子可操作地連接編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸 合酶(EPSPS)的基因，所述EPSPS對草甘膦除草劑具有耐受性。第二個表達(dá)盒包含用于在植 物中表達(dá)的適合的啟動子和適合的多聚腺苷酸化信號序列，所述啟動子可操作地連接編碼 膦絲菌素 N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(PAT)的基因，所述PAT蛋白的核酸序列對草銨膦除草劑具有耐受 性。進(jìn)一步地，所述啟動子可以為從植物分離的適合啟動子，包括組成型、誘導(dǎo)型和/或組織 特異性啟動子，所述適合啟動子包括但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、玄參花 葉病毒(FMV)35S啟動子、Tsfl啟動子、泛素蛋白（Ubiquitin)啟動子、肌動蛋白（Actin)啟動 子、土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(N0S)啟動子、章魚堿合成酶 (0CS)啟動子、夜香樹屬(Cestrum)黃葉卷曲病毒啟動子、馬鈴薯塊莖儲藏蛋白（Patatin)啟 動子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBi sCO)啟動子、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)啟動 子、E9啟動子、G0S啟動子、alcA/alcR啟動子、毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes) RolD啟動子和擬南芥屬(Arabidopsis)Suc2啟動子。所述多聚腺苷酸化信號序列可以為在 植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，所述適合多聚腺苷酸化信號序列包括但不限 于，來源于土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(N0S)基因的多聚腺苷 酸化信號序列、來源于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S終止子、來源于豌豆核酮糖-1，5-二磷酸 羧化酶/加氧酶E9終止子、來源于蛋白酶抑制劑Π (ΡΙΝΠ )基因的多聚腺苷酸化信號序列和 來源于α-微管蛋白（α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
[0074] 此外，所述表達(dá)盒還可以包括其他的遺傳元件，所述遺傳元件包括但不限于，增強(qiáng) 子和信號肽/轉(zhuǎn)運(yùn)肽。所述增強(qiáng)子可以增強(qiáng)基因的表達(dá)水平，所述增強(qiáng)子包括但不限于，煙 草蝕刻病毒(TEV)翻譯激活因子、CaMV35S增強(qiáng)子和FMV35S增強(qiáng)子。所述信號肽/轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以 引導(dǎo)EPSPS蛋白和/或PAT蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外或者細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞器或區(qū)室，例如，利用編 碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用'KDEL'保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
[0075] 所述5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS)基因可以是從土壤農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens sp.)CP4菌株中分離得到的，且可以通過優(yōu)化密碼子或者以 其他方式改變編碼EPSPS的多核苷酸，以達(dá)到增加轉(zhuǎn)化細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性和可利用性 的目的。所述5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因也可以作為選擇性標(biāo)記基因。
[0076] 所述"草甘膦"是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的鹽，用"草甘膦除草劑"處理是指使用 任何一種含有草甘膦的除草劑制劑進(jìn)行處理。為了達(dá)到有效生物學(xué)劑量而對某種草甘膦制 劑使用率的選擇不超過普通農(nóng)藝技術(shù)人員的技能。使用任何一種含有草甘膦的除草劑制劑 處理包含了來源于除草劑耐受性大豆植物DBN9004的植物材料的田地，將控制所述田地中 的雜草生長，并且不影響來源于除草劑耐受性大豆植物DBN9004的植物材料的生長或產(chǎn)量。
[0077] 從鏈霉菌（51：代。1：01115^6 8￥；[1^(10(3111'01]1〇86116 8)分離的勝絲菌素1^-乙?；D(zhuǎn)移酶 (phosphinothricin N-acetyltransferase，PAT)基因通過乙?；呋疞-膦絲菌素轉(zhuǎn)化為 其無活性形式，以賦予植物對草銨膦除草劑的耐受性。Phosphinothricin(PTC，2-氨基-4-甲膦酰丁酸)是谷氨酰胺合成酶的抑制劑。PTC是抗生素2-氨基-4-甲膦酰-丙氨酰-丙氨酸 的結(jié)構(gòu)單位，此三肽（PTT)具有抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌以及抗真菌灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)的活性。膦絲菌素 N-乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)基因也可以作為選擇性標(biāo)記 基因。
[0078] 所述"草銨膦"又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羥基（甲基)膦?；鵠丁酸銨，用"草銨 膦除草劑"處理是指使用任何一種含有草銨膦的除草劑制劑進(jìn)行處理。為了達(dá)到有效生物 學(xué)劑量而對某種草銨膦制劑使用率的選擇不超過普通農(nóng)藝技術(shù)人員的技能。使用任何一種 含有草銨膦的除草劑制劑處理包含了來源于除草劑耐受性大豆植物DBN9004的植物材料的 田地，將控制所述田地中的雜草生長，并且不影響來源于除草劑耐受性大豆植物DBN9004的 植物材料的生長或產(chǎn)量。
[0079] 所述DNA構(gòu)建體采用轉(zhuǎn)化方法被引入到植物中，所述轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿 菌(Agr obac t er i um)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法和花粉管通道轉(zhuǎn)化法。
[0080] 所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是植物轉(zhuǎn)化的常用方法。將要引入到植物中的外源DNA克 隆到載體的左和右邊界共有序列之間，即T-DNA區(qū)。所述載體被轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌細(xì)胞中，隨后， 所述農(nóng)桿菌細(xì)胞用于感染植物組織，包含外源DNA的載體的所述T-DNA區(qū)被插入到植物基因 組中。
[0081] 所述基因槍轉(zhuǎn)化法即為用包含外源DNA的載體轟擊植物細(xì)胞(粒子介導(dǎo)的生物彈 擊轉(zhuǎn)化）。
[0082] 所述花粉管通道轉(zhuǎn)化法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道(又名花粉 管引導(dǎo)組織），經(jīng)珠心通道，將外源DNA攜帶入胚囊。
[0083]轉(zhuǎn)化后，必須從轉(zhuǎn)化的植物組織再生轉(zhuǎn)基因植物，并且利用適合的標(biāo)記選擇具有 外源DNA的后代。
[0084] DNA構(gòu)建體是DNA分子互相連接起來的組合，該組合提供了一個或多個表達(dá)盒。DNA 構(gòu)建體優(yōu)選地是能夠在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，而且含有不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的質(zhì)粒， 所含的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用于導(dǎo)入提供功能性基因元件，即啟動子、內(nèi)含子、前導(dǎo)序列、編 碼序列、3'終止子區(qū)域和其他序列的DNA分子。DNA構(gòu)建體中所含有的表達(dá)盒包括提供信使 RNA的轉(zhuǎn)錄所必需的基因元件，所述表達(dá)盒可以設(shè)計(jì)為在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā) 明的表達(dá)盒被設(shè)計(jì)為最優(yōu)選地在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0085]轉(zhuǎn)基因"事件"是通過用異源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而得到的，即包括一個含有 目標(biāo)基因的核酸表達(dá)盒，通過轉(zhuǎn)基因的方法插入到植物基因組中以產(chǎn)生的植物群體，再生 所述植物群體，和選擇具有插入特定基因組位點(diǎn)特征的特定植株。術(shù)語"事件"包括異源DNA 的原始轉(zhuǎn)化體和該轉(zhuǎn)化體的后代。術(shù)語"事件"還包括轉(zhuǎn)化體和含有異源DNA的其他品種個 體之間進(jìn)行有性雜交而得到的后代，即使在與回交親本進(jìn)行反復(fù)回交后，來自于轉(zhuǎn)化體親 本的插入DNA和側(cè)翼基因組DNA也存在于雜交后代中的同一染色體位置。術(shù)語"事件"還指來 自原始轉(zhuǎn)化體的DNA序列，該DNA序列包含插入DNA和與插入DNA緊密相鄰的側(cè)翼基因組序 列，該DNA序列被預(yù)期轉(zhuǎn)移到子代中，該子代由含有插入DNA的親本系(例如原始轉(zhuǎn)化體和其 自交產(chǎn)生的子代)與不含有插入DNA的親本系進(jìn)行有性雜交而產(chǎn)生，且該子代接受了包含目 標(biāo)基因的插入DNA。
[0086]本發(fā)明中"重組"是指通常不能在自然界中發(fā)現(xiàn)并且因此通過人工干預(yù)產(chǎn)生的DNA 和/或蛋白和/或生物體的形式。這種人工干預(yù)可產(chǎn)生重組DNA分子和/或重組植物。所述"重 組DNA分子"是通過人工組合兩種在其他情況下是分離的序列區(qū)段而獲得的，例如通過化學(xué) 合成或通過遺傳工程技術(shù)操作分離的核酸區(qū)段。進(jìn)行核酸操作的技術(shù)是眾所周知的。
[0087] 術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，以上的基 因型由于異源核酸的存在而改變，所述"轉(zhuǎn)基因"包括最初被這樣改變的轉(zhuǎn)基因體以及由最 初的轉(zhuǎn)基因體通過有性雜交或無性繁殖生成的子代個體。在本發(fā)明中，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"不包 括通過常規(guī)植物育種方法或天然發(fā)生事件的基因組的（染色體的或染色體外的）改變，所述 天然發(fā)生事件例如隨機(jī)異體受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突 變。
[0088] 本發(fā)明中"異源的"是指自然界中第一分子通常不被發(fā)現(xiàn)與第二分子組合。例如， 分子可以源自第一物種并插入到第二物種的基因組中。因此這種分子對于宿主是異源的并 被人工引入宿主細(xì)胞的基因組中。
[0089]培養(yǎng)對草甘膦除草劑和草銨膦除草劑具有耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004,通 過以下步驟:首先使第一親本大豆植物與第二親本大豆植物有性雜交，從而產(chǎn)生了多樣的 第一代子代植株，所述第一親本大豆植物由培育自轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004及其后代的大 豆植物組成，該轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004及其后代是通過利用本發(fā)明的對草甘膦除草劑和 草銨膦除草劑具有耐受性的表達(dá)盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的，第二親本大豆植物缺乏對草甘膦除 草劑和/或草銨膦除草劑的耐受性;然后選擇對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑的施用具 有耐受性的子代植株，可以培育出對草甘膦除草劑和草銨膦除草劑具有耐受性的大豆植 物。這些步驟可以進(jìn)一步包括使對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑的施用具有耐受性的 子代植株與第二親本大豆植物或第三親本大豆植物進(jìn)行回交，然后通過施用草甘膦除草 劑、草銨膦除草劑或通過與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記物(如包含轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中插入 序列的5'端和3'端鑒定出的接合位點(diǎn)的DNA分子)的鑒定來選擇子代，從而產(chǎn)生對草甘膦除 草劑和草銨膦除草劑具有耐受性的大豆植物。
[0090] 還應(yīng)理解的是，兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以雜交以產(chǎn)生含有兩個獨(dú)立的、分離 式添加的外源基因的后代。適當(dāng)后代的自交可以得到對兩個添加的外源基因來說都是純合 子的后代植株。如前所述的對親本植株的回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異型雜交也是可以預(yù)期 的，無性繁殖也是同樣的。
[0091] 轉(zhuǎn)Bt基因的大豆能殺死例如鱗翅目的昆蟲/害蟲，但也存在少量存活下來的昆蟲/ 害蟲，經(jīng)過幾代繁殖后，可能產(chǎn)生抗Bt蛋白的抗性昆蟲/害蟲。為了解決昆蟲/害蟲產(chǎn)生抗性 這個問題，美國環(huán)境保護(hù)局針對轉(zhuǎn)基因作物的使用給出了如下指導(dǎo)，需提供一定比例的庇 護(hù)所大豆(可以是非抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆(如除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因大豆，或抗非目標(biāo)害蟲的轉(zhuǎn)基 因大豆，或非轉(zhuǎn)基因大豆）。當(dāng)絕大部分的昆蟲/害蟲在相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因抗蟲大豆上被殺死后， 還有一部分昆蟲/害蟲在庇護(hù)所大豆上沒有死，保證了沒有抗性的昆蟲/害蟲群體占統(tǒng)治數(shù) 量。這樣即使有少量存活的抗性昆蟲/害蟲，與占統(tǒng)治數(shù)量的非抗性昆蟲/害蟲交配后抗性 基因也被顯著的稀釋了。
[0092]術(shù)語"探針"是一段分離的核酸分子，其上面結(jié)合有常規(guī)的可檢測標(biāo)記或報(bào)告分 子，例如，放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶類。這種探針與目標(biāo)核酸的一條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ) 的，在本發(fā)明中，探針與來自轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004基因組的一條DNA鏈互補(bǔ)，不論該基因 組DNA是來自轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004或種子還是來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的植物或 種子或提取物。本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括特異性地與目標(biāo) DNA序列結(jié)合并可用于檢測該目標(biāo)DNA序列的存在的聚酰胺及其他探針材料。
[0093]術(shù)語"引物"是一段分離的核酸分子，其通過核酸雜交，退火結(jié)合到互補(bǔ)的目標(biāo)DNA 鏈上，在引物和目標(biāo)DNA鏈之間形成雜合體，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶）的作用下，沿目 標(biāo)DNA鏈延伸。本發(fā)明的引物對涉及其在目標(biāo)核酸序列擴(kuò)增中的應(yīng)用，例如，通過聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)或其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法。
[0094]探針和引物的長度一般是11個多核苷酸或更多，優(yōu)選的是18個多核苷酸或更多， 更優(yōu)選的是24個多核苷酸或更多，最優(yōu)選的是30個多核苷酸或更多。這種探針和引物在高 度嚴(yán)格雜交條件下與目標(biāo)序列特異性地雜交。盡管不同于目標(biāo)DNA序列且對目標(biāo)DNA序列保 持雜交能力的探針是可以通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)出來的，但是，優(yōu)選的，本發(fā)明中的探針和引物 與目標(biāo)序列的連續(xù)核酸具有完全的DNA序列同一性。
[0095]基于本發(fā)明的側(cè)翼基因組DNA和插入序列的引物和探針可以通過常規(guī)方法確定， 例如，通過從來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的植物材料中分離相應(yīng)的DNA分子，并確定該 DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含轉(zhuǎn)基因插入序列和大豆基因組側(cè)翼序列，所述DNA分 子的片段可以用作引物或探針。
[0096] 本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)DNA序列雜交。任何常規(guī)的核酸雜 交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定樣品中來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA的存在。核酸分 子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。如本發(fā)明使用的，如果兩 個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異 性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分 子的"互補(bǔ)物"。如本發(fā)明使用的，當(dāng)一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的 對應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時，則稱這兩個核酸分子顯示出"完全互補(bǔ)性"。如果兩個核酸分子能夠以 足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的"低度嚴(yán)格"條件下退火且彼此結(jié)合，則稱 這兩個核酸分子為"最低程度互補(bǔ)"。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互 雜交從而使它們在常規(guī)的"高度嚴(yán)格"條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有 "互補(bǔ)性"。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙 鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ) 性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0097] 如本發(fā)明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件 下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格 條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)處理，然后在50°C條件下用 2.0 X SSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選 自低度嚴(yán)格條件的約2.0 X SSC、50°C到高度嚴(yán)格條件的約0.2 X SSC、50°C。此外，洗滌步驟 中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65°C。溫度條 件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本 發(fā)明的一個核酸分子可以在中度嚴(yán)格條件下，例如在約2.0 XSSC和約65°C下與SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7中 一個或多個核酸分子或其互補(bǔ)序列，或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。更優(yōu)選地， 本發(fā)明的一個核酸分子在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7中一個或多個核酸分子或其互補(bǔ)序列， 或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。本發(fā)明中，優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互補(bǔ)序列，或者上述序列的任一片段。 本發(fā)明另一優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:6或SEQ ID NO :7或其互補(bǔ)序列，或者上述序列的任一片段具有80%到100%或90%到100%的序列同一 性。SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7可以用作植物育種方法中的標(biāo) 記物以鑒定遺傳雜交的后代。探針與目標(biāo)DNA分子的雜交可以通過任何一種為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的方法進(jìn)行檢測，這些方法包括但不限于，熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗體類標(biāo)記 和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
[0098] 關(guān)于使用特定的擴(kuò)增引物對目標(biāo)核酸序列進(jìn)行的擴(kuò)增（例如，通過PCR)，"嚴(yán)格條 件"指的是在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中僅允許引物對目標(biāo)核酸序列發(fā)生雜交的條件，具有與目標(biāo)核 酸序列相應(yīng)的野生型序列（或其互補(bǔ)序列）的引物，能夠與所述目標(biāo)核酸序列結(jié)合，并且優(yōu) 選產(chǎn)生唯一的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物即擴(kuò)增子。
[0099] 術(shù)語"特異性結(jié)合（目標(biāo)序列)"是指在嚴(yán)格雜交條件下探針或引物僅與包含目標(biāo) 序列的樣品中的目標(biāo)序列發(fā)生雜交。
[0100] 如本發(fā)明使用的，"經(jīng)過擴(kuò)增的DNA"或"擴(kuò)增子"是指作為核酸模板一部分的目標(biāo) 核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為了確定大豆植物是否由含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004通過有性雜交方式產(chǎn)生，或采集自田地的大豆樣品是否包含轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004,或大豆提取物，例如粗粉、粉或油是否包含轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004,從大豆植物 組織樣品或提取物提取的DNA可以通過使用引物對的核酸擴(kuò)增方法以產(chǎn)生對于轉(zhuǎn)基因大豆 事件DBN9004的DNA的存在是診斷性的擴(kuò)增子。所述引物對包括一個來源于植物基因組中與 插入的外源DNA插入位點(diǎn)相鄰的側(cè)翼序列的第一引物，和來源于插入的外源DNA的第二引 物。擴(kuò)增子具有一定長度和序列，所述序列對所述轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004也是診斷性的。 擴(kuò)增子的長度范圍可以是引物對的結(jié)合長度加上一個核苷酸堿基對，優(yōu)選加上約五十個核 苷酸堿基對，更優(yōu)選加上約兩百五十個核苷酸堿基對，最優(yōu)選加上約四百五十個核苷酸堿 基對或更多。
[0101 ]可選的，引物對可以來源于插入DNA兩側(cè)的側(cè)翼基因組序列，以產(chǎn)生包括整個插入 核苷酸序列的擴(kuò)增子。來源于植物基因組序列的引物對中的一個可以位于距插入DNA序列 一定距離處，該距離的范圍可以為一個核苷酸堿基對到約兩萬個核苷酸堿基對。術(shù)語"擴(kuò)增 子"的使用特別排除了在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚體。
[0102]核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以通過本領(lǐng)域已知的任何一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法實(shí)現(xiàn)，包括聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。各種核酸擴(kuò)增方法已是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。PCR擴(kuò)增方法已經(jīng)發(fā) 展到可擴(kuò)增多達(dá)22kb的基因組DNA和多達(dá)42kb的噬菌體DNA。這些方法以及本領(lǐng)域的其他 DNA擴(kuò)增方法可以用于本發(fā)明。插入的外源DNA序列和來自轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的側(cè)翼 DNA序列可以通過利用所提供的引物序列對轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò) 增后對PCR擴(kuò)增子或克隆的DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNA測序。
[0103] 基于DNA擴(kuò)增方法的DNA檢測試劑盒含有DNA引物分子，它們在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下 特異性雜交到目標(biāo)DNA上并擴(kuò)增診斷性擴(kuò)增子。試劑盒可提供基于瓊脂糖凝膠的檢測方法 或者現(xiàn)有技術(shù)已知的檢測診斷性擴(kuò)增子的許多方法。含有與SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的 大豆基因組區(qū)的任何部分同源或互補(bǔ)的、以及與SEQ ID N0:5的轉(zhuǎn)基因插入?yún)^(qū)的任何部分 同源或互補(bǔ)的DNA引物的試劑盒是本發(fā)明所提供的。特別地鑒別在DNA擴(kuò)增方法中有用的引 物對是SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9,其擴(kuò)增與轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的5'轉(zhuǎn)基因/基因組 區(qū)的一部分同源的診斷性擴(kuò)增子，其中擴(kuò)增子包括SEQ ID N0:1。用作DNA引物的其他DNA分 子可選自SEQ ID N0:5。
[0104] 這些方法所產(chǎn)生的擴(kuò)增子可以通過多種技術(shù)進(jìn)行檢測。其中一個方法是遺傳位分 析(Genetic Bit Analysis)，該方法設(shè)計(jì)了一個跨越插入DNA序列和相鄰的側(cè)翼基因組DNA 序列的DNA寡核苷酸鏈。將該寡核苷酸鏈固定在一個微孔板的微孔內(nèi)，在對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后(在插入序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列中各使用一個引物），單鏈PCR產(chǎn)物可與 固定的寡核苷酸鏈進(jìn)行雜交，并且作為單堿基延伸反應(yīng)的模板，該延伸反應(yīng)使用了 DNA聚合 酶和為下一個預(yù)期的堿基特定標(biāo)記的ddNTPs。可以通過熒光或ELISA類方法得到結(jié)果。信號 代表了插入/側(cè)翼序列的存在，其說明擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸反應(yīng)是成功的。
[0105]另一種方法是焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)。該方法設(shè)計(jì)了 一個跨越插入 DNA序列和相鄰的基因組DNA結(jié)合部位的寡核苷酸鏈。將該寡核苷酸鏈和目標(biāo)區(qū)域的單鏈 PCR產(chǎn)物(在插入序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列中各使用一個引物)進(jìn)行雜交，然后和DNA 聚合酶、ATP、硫?；浮晒馑孛?、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷-5'-磷硫酸鹽和螢光素一起 進(jìn)行溫育。分別加入dNTPs，測量產(chǎn)生的光信號。光信號代表了插入/側(cè)翼序列的存在，其說 明擴(kuò)增、雜交、和單堿基或多堿基延伸反應(yīng)是成功的。
[0106] Chen等(基因組研究(Genome Res ·)9:492-498，1999)描述的熒光偏振現(xiàn)象也是可 以用于檢測本發(fā)明擴(kuò)增子的一種方法。使用這種方法需要設(shè)計(jì)一個跨越插入DNA序列和相 鄰的基因組DNA結(jié)合部位的寡核苷酸鏈。將該寡核苷酸鏈和目標(biāo)區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(在插 入序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列中各使用一個引物)進(jìn)行雜交，然后和DNA聚合酶以及一 種熒光標(biāo)記的ddNTP-起進(jìn)行溫育。單堿基延伸會導(dǎo)致插入ddNTP。這種插入可以利用熒光 儀測量其偏振的改變。偏振的改變代表了插入/側(cè)翼序列的存在，其說明擴(kuò)增、雜交和單堿 基延伸反應(yīng)是成功的。
[0107] Taqman被描述為一種檢測和定量分析DNA序列存在的方法，該方法在制造商所提 供的使用說明中有詳細(xì)介紹?，F(xiàn)簡要舉例說明如下，設(shè)計(jì)一個跨越插入DNA序列和相鄰的基 因組側(cè)翼結(jié)合部位的FRET寡核苷酸探針。該FRET探針和PCR引物(在插入序列內(nèi)和相鄰的側(cè) 翼基因組序列中各使用一個引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTPs存在下進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。FRET探針 的雜交導(dǎo)致FRET探針上熒光部分和淬滅部分的分裂以及熒光部分的釋放。熒光信號的產(chǎn)生 代表了插入/側(cè)翼序列的存在，其說明擴(kuò)增和雜交是成功的。
[0108] 基于雜交原理，用于檢測來源于除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的植物材 料的適合技術(shù)還可以包括Southern印跡雜交、Northern印跡雜交和原位雜交。特別地，所述 適合技術(shù)包括溫育探針和樣品，洗滌以移除未結(jié)合的探針和檢測探針是否已經(jīng)雜交。所述 的檢測方法取決于探針?biāo)綐?biāo)記的類型，例如，通過X光片曝光和顯影可以檢測放射性標(biāo)記 的探針，或通過底物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)顏色變化可以檢測酶標(biāo)記的探針。
[0109] Tyangi等（自然生物技術(shù)(Nat.Biotech· )14:303-308，1996)介紹了分子標(biāo)記在序 列檢測中的應(yīng)用。簡要說明如下，設(shè)計(jì)一個跨越插入DNA序列和相鄰的基因組側(cè)翼結(jié)合部位 的FRET寡核苷酸探針。該FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其含有二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)能夠在近 距離內(nèi)保持熒光部分和淬滅部分。該FRET探針和PCR引物(在插入序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因 組序列中各使用一個引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTPs存在下進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。經(jīng)過成功的PCR 擴(kuò)增，F(xiàn)RET探針和目標(biāo)序列的雜交導(dǎo)致探針二級結(jié)構(gòu)的喪失，從而使熒光部分和淬滅部分 在空間上發(fā)生分離，產(chǎn)生熒光信號。熒光信號的產(chǎn)生代表了插入/側(cè)翼序列的存在，其說明 擴(kuò)增和雜交是成功的。
[0110]其他描述的方法，例如微流體(microfluidics)提供了分離和擴(kuò)增DNA樣品的方法 和設(shè)備。光染料用于檢測和測定特定的DNA分子。包含用于檢測DNA分子的電子傳感器或結(jié) 合特定DNA分子的納珠并因而可被檢測的納試管(nanotube)設(shè)備對于檢測本發(fā)明的DNA分 子是有用的。
[0111] 可以使用本發(fā)明所述的組合物和DNA檢測領(lǐng)域描述的或已知的方法來開發(fā)DNA檢 測試劑盒。所述試劑盒有利于鑒定樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA，還可以 用于培育含有轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA的大豆植物。所述試劑盒可以含有DNA引物或 探針，其同源于或互補(bǔ)于SEQ ID N0:l、2、3、4或5的至少一部分，或含有其他DNA引物或探 針，其同源于或互補(bǔ)于DNA的轉(zhuǎn)基因遺傳元件中所含的DNA，這些DNA序列可以用于DNA擴(kuò)增 反應(yīng)，或作為DNA雜交方法中的探針。在大豆基因組中含有的以及在圖1和表1中說明的轉(zhuǎn)基 因插入序列與大豆基因組結(jié)合部位的DNA結(jié)構(gòu)包含:位于轉(zhuǎn)基因插入序列5'末端的大豆植 物DBN9004側(cè)翼基因組區(qū)域，來自農(nóng)桿菌的左側(cè)邊界區(qū)域(LB)的一部分插入序列，第一個表 達(dá)盒由含有增強(qiáng)子區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)的花椰菜花葉病毒35S啟動子(pr35S)，可操作地連接到 鏈霉菌的草銨膦耐受性的膦絲菌素 N-乙?；D(zhuǎn)移酶(cPAT)上，并可操作地連接到花椰菜花 葉病毒35S終止子(t35S)上而組成，第二個表達(dá)盒由大豆Tsfl基因（編碼延伸因子EF-la)啟 動子(prGml7gTsfl)，可操作連接到擬南芥EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列（spAtCTP2)上， 可操作連接到土壤桿菌屬CP4菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (cEPSPS)上，可操作連接到來自豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的3 '非翻譯序列（tPse9)上 而組成，來自農(nóng)桿菌的右側(cè)邊界區(qū)域(RB)的一部分插入序列，以及位于轉(zhuǎn)基因插入序列3' 末端的大豆植物DBN9004側(cè)翼基因組區(qū)域（SEQ ID N0: 5)。在DNA擴(kuò)增方法中，作為引物的 DNA分子可以是來源于大豆植物DBN9004中轉(zhuǎn)基因插入序列的任何部分，也可以是來源于轉(zhuǎn) 基因大豆事件DBN9004中側(cè)翼大豆基因組的DNA區(qū)域的任何部分。
[0112] 轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004可以與其他轉(zhuǎn)基因大豆品種組合，例如除草劑耐受性(如 2,4-D、麥草畏等）的大豆，或攜帶其他抗蟲基因（如CrylAc、Cry2Ab等）的轉(zhuǎn)基因大豆品種。 所有這些不同轉(zhuǎn)基因事件的各種組合，與本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004-起育種，可以 提供抗多種蟲害并耐受多種除草劑的改良雜種轉(zhuǎn)基因大豆品種。這些品種相比于非轉(zhuǎn)基因 品種和單性狀的轉(zhuǎn)基因品種可以表現(xiàn)出產(chǎn)量提升等更優(yōu)異的特征。
[0113]本發(fā)明提供了一種用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及其檢測 方法，轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004耐受含草甘膦和/或草銨膦的農(nóng)業(yè)除草劑的植物毒性作用。 該雙重性狀的大豆植株表達(dá)土壤桿菌屬菌株CP4的草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3- 磷酸合酶(EPSPS)蛋白，其賦予植物對草甘膦的耐受性，并表達(dá)鏈霉菌的草銨膦抗性的膦絲 菌素 N-乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)蛋白，其賦予植物對草銨膦的耐受性。雙重性狀大豆具有如下優(yōu) 點(diǎn)：1)施加含草甘膦的農(nóng)業(yè)除草劑給大豆作物用于廣譜雜草控制的能力；2)草銨膦耐受性 性狀組合使用草銨膦除草劑(與草甘膦除草劑混合或交替使用）可以作為一種有效管理草 甘膦抗性雜草的非選擇性手段;3)除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因大豆作為非抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆，與轉(zhuǎn) 基因抗蟲大豆以一定比例一并種植，可以延緩昆蟲/害蟲產(chǎn)生抗性;4)大豆產(chǎn)量沒有降低。 此外，編碼草甘膦耐受性和草銨膦耐受性性狀的基因連鎖在同一 DNA區(qū)段上，并且存在于轉(zhuǎn) 基因大豆事件DBN9004基因組的單一基因座上，這一點(diǎn)提供了增強(qiáng)的育種效率并使得能夠 用分子標(biāo)記來追蹤繁殖群體及其子代中的轉(zhuǎn)基因插入片段。同時本發(fā)明檢測方法中SEQ ID N0:1或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:6或其互補(bǔ)序列、或者SEQ ID N0:7或其互補(bǔ)序列可以作為DNA引物或探針以產(chǎn)生診斷為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004或其后 代的擴(kuò)增產(chǎn)物，且可以快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的鑒定出來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的植物材 料的存在。
[0114] 序列簡述
[0115] SEQ ID N0:1轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序列的5'末端位于插入接合部位 附近的一個長度為22個核苷酸的序列，其中第1-11位核苷酸和第12-22位核苷酸分別位于 玉米基因組上插入位點(diǎn)的兩側(cè)；
[0116] SEQ ID N0:2轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序列的3'末端位于插入接合部位 附近的一個長度為22個核苷酸的序列，其中第1-11位核苷酸和第12-22位核苷酸分別位于 玉米基因組上插入位點(diǎn)的兩側(cè)；
[0117] SEQ ID N0:3轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序列的5'末端位于插入接合部位 附近的一個長度為1207個核苷酸的序列；
[0118] SEQ ID N0:4轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中在插入序列的3'末端位于插入接合部位 附近的一個長度為631個核苷酸的序列；
[0119] SEQ ID N0:5整個T-DNA序列、5'和3'的側(cè)翼大豆基因組序列；
[0120] SEQ ID N0:6位于SEQ ID勵:3內(nèi)部的序列，跨越了？08財(cái)003構(gòu)建體0嫩序列中的 核苷酸序列和t35S轉(zhuǎn)錄終止序列；
[0121] SEQ ID N0:7位于SEQ ID N0:4內(nèi)部的序列，跨越了prGml7gTsfl啟動子序列和 PDBN4003構(gòu)建體DNA序列中的核苷酸序列；
[0122] SEQ ID N0:8 擴(kuò)增SEQ ID N0:3的第一引物；
[0123] SEQ ID NO:9 擴(kuò)增SEQ ID NO:3的第二引物；
[0124] SEQ ID NO:10 擴(kuò)增SEQ ID NO:4的第一引物；
[0125] SEQ ID NO: 11 擴(kuò)增SEQ ID NO:4的第二引物；
[0126] SEQ ID NO: 12 5'側(cè)翼基因組序列上的引物；
[0127] SEQ ID NO:13 與SEQ ID NO:12配對的位于T-DNA上的引物；
[0128] SEQ ID NO: 14 3'側(cè)翼基因組序列上的引物，其與SEQ ID NO: 12配對可以檢測轉(zhuǎn) 基因是純合子或是雜合子；
[0129] SEQ ID N0:15與SEQ ID恥：^配對的位于^^嫩上的引物；
[0130] SEQ ID N0:16 Taqman檢測EPSPS的引物1;
[0131] SEQ ID N0:17 Taqman檢測EPSPS的引物2;
[0132] SEQ ID NO:18 Taqman檢測EPSPS的探針1;
[0133] SEQ ID NO:19 Taqman檢測PAT的引物3;
[0134] SEQ ID NO :20 Taqman檢測PAT的引物4;
[0135] SEQ ID NO:21 Taqman檢測PAT的探針2;
[0136] SEQ ID N0:22大豆內(nèi)源基因泛素蛋白（Ubiquitin)的第一引物；
[0137] SEQ ID N0:23大豆內(nèi)源基因泛素蛋白（Ubiquitin)的第二引物；
[0138] SEQ ID N0:24 Southern印跡雜交檢測中EPSPS的探針；
[0139] SEQ ID N0:25 Southern印跡雜交檢測中PAT的探針；
[0140] SEQIDN0:26位于T-DNA上的引物，與SEQIDN0:13方向一致；
[0141] SEQ ID N0:27位于T-DNA上的引物，與SEQ ID N0:13方向相反，用作獲得側(cè)翼序列；
[0142] SEQ ID N0:28位于T-DNA上的引物，與SEQ ID N0:13方向相反，用作獲得側(cè)翼序列；
[0143] SEQIDN0:29位于T-DNA上的引物，與SEQIDN0:15方向一致；
[0144] SEQ ID N0:30位于T-DNA上的引物，與SEQ ID N0:15方向相反，用作獲得側(cè)翼序列；
[0145] SEQIDN0:31位于T-DNA上的引物，與SEQIDN0:15方向相反，用作獲得側(cè)翼序列。
[0146] 下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【附圖說明】
[0147] 圖1為本發(fā)明用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及其檢測方法 的轉(zhuǎn)基因插入序列與大豆基因組接合部位的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0148] 圖2為本發(fā)明用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004的核酸序列及其檢測方法 的重組表達(dá)載體PDBN4003的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0149] 下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明用于檢測除草劑耐受性大豆植物DBN9004 的核酸序列及其檢測方法的技術(shù)方案。
[0150] 第一實(shí)施例、克隆與轉(zhuǎn)化
[0151] 1.1、載體克隆
[0152] 使用標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組表達(dá)載體pDBN4003(如圖2所示）。所述載體 PDBN4003包含兩個串聯(lián)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，第一個表達(dá)盒由大豆Tsfl基因（編碼延伸因子EF-1α)啟動子（prGml7gTsfl)，可操作連接到擬南芥EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列 ( SpAtCTP2)上，可操作連接到土壤桿菌屬CP4菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草 酸-3-磷酸合酶(cEPSPS)上，可操作連接到來自豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的3'非翻譯 序列（tPse9)上而組成;第二個表達(dá)盒由含有增強(qiáng)子區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)的花椰菜花葉病毒35S 啟動子（pr35S)，可操作地連接到鏈霉菌的草銨膦耐受性的膦絲菌素 N-乙?；D(zhuǎn)移酶 (cPAT)上，并可操作地連接到花椰菜花葉病毒35S終止子(t35S)上而組成。
[0153] 將所述載體pDBN4003用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invi trgen，Chicago，USA; Cat. No: 18313-015)中，并且以5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)為選擇性標(biāo)記對 轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選。
[0154] 1.2、植物轉(zhuǎn)化
[0155] 采用常規(guī)的農(nóng)桿菌侵染法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將無菌培養(yǎng)的大豆子葉節(jié)組織與本實(shí)施例 1.1中所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將構(gòu)建的重組表達(dá)載體PDBN4003中的T-DNA轉(zhuǎn)入到大豆染色 體組中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004。
[0156] 對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化，簡要地，將成熟的大豆種子在大豆萌發(fā)培養(yǎng)基(B5鹽 3. lg/L，B5維他命，鹿糖20g/L，瓊脂8g/L，pH5.6)中進(jìn)行萌發(fā)，將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上， 按以下條件培養(yǎng):溫度25±1°C;光周期(光/暗)為16/8h。萌發(fā)4-6天后取鮮綠的子葉節(jié)處膨 大的大豆無菌苗，在子葉節(jié)下3-4毫米處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、側(cè)芽和種子 根。用解剖刀的刀背在子葉節(jié)處進(jìn)行創(chuàng)傷，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸創(chuàng)傷過的子葉節(jié)組織，其中 農(nóng)桿菌能夠?qū)PSPS基因的核苷酸序列和PAT基因的核苷酸序列傳遞至創(chuàng)傷過的子葉節(jié)組 織(步驟1:侵染步驟）。在此步驟中，子葉節(jié)組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(0D 66Q = 0.5-0.8， 侵染培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、B5維他命、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素(ZT)2mg/L，pH5.3)中以啟動侵染。子葉節(jié)組織與農(nóng)桿菌共培 養(yǎng)一段時期（3天）（步驟2:共培養(yǎng)步驟）。優(yōu)選地，子葉節(jié)組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基 (MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-嗎啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素2mg/L、 瓊脂8g/L，pH5.6)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，有一個選擇性的"恢復(fù)"步驟。在"恢復(fù)"步驟 中，恢復(fù)培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT) 2mg/L、瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，pH5 · 6)中至少存在 一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素（頭孢霉素150-250mg/L)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑 (步驟3:恢復(fù)步驟）。優(yōu)選地，子葉節(jié)再生的組織塊在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基 上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，子葉節(jié)再生的組織塊在含選擇劑 (草甘膦）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟）。優(yōu)選地，子葉 節(jié)再生的組織塊在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基（B5鹽3.1 g/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸 (MES)lg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤(6-BAP)lmg/L、瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L，谷氨酸 100mg/L，天冬氨酸100mg/L，草甘膦異丙胺鹽10mg/L，pH5.6)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以 繼續(xù)生長。然后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成植物(步驟5:再生步驟），優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基 上生長的子葉節(jié)再生的組織塊在固體培養(yǎng)基(B5分化培養(yǎng)基和B5生根培養(yǎng)基）上培養(yǎng)以再 生植物。
[0157] 篩選得到的抗性組織塊轉(zhuǎn)移到所述B5分化培養(yǎng)基(B5鹽3. lg/L、B5維他命、2-嗎啉 乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、玉米素（ZT)lmg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素 150mg/L、谷氨酸 50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素 lmg/L、生長素 lmg/L、草甘膦異丙胺鹽10mg/L，pH5.6)上， 25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述B5生根培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、2-嗎 啉乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素 150mg/L、吲哚-3-丁酸（IBA)lmg/L)， 在生根培養(yǎng)上，25°C下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于26 °C下培 養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。
[0158] 1.3、轉(zhuǎn)基因事件的鑒定和篩選
[0159] 一共產(chǎn)生了288個獨(dú)立轉(zhuǎn)基因 To植株。
[0160] 通過TaqMan?分析(參見第二實(shí)施例)檢測再生的轉(zhuǎn)基因大豆植株是否存在EPSPS 和PAT基因，并表征耐受草甘膦和草銨膦品系的拷貝數(shù)。通過篩選，選定了事件DBN9004是優(yōu) 異的，其具有單拷貝轉(zhuǎn)基因、良好的草甘膦除草劑耐受性、草銨膦除草劑耐受性和農(nóng)藝性狀 的表現(xiàn)(參見第六實(shí)施例）。
[0161 ] 第二實(shí)施例、用TaqMan進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004檢測
[0162] 取轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的葉片約100mg作為樣品，用植物DNA提取試劑盒 (DNeasy Plant Maxi Kit，Qiagen)提取其基因組DNA，通過Taqman探針焚光定量PCR方法檢 測EPSPS基因和PAT基因的拷貝數(shù)。同時以野生型大豆植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢 測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
[0163] 具體方法如下：
[0164] 步驟11、取轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的葉片lOOmg，在研缽中用液氮研成勻漿，每個 樣品取3個重復(fù)；
[0165] 步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體 方法參考其廣品說明書；
[0166] 步驟13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0167] 步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80-lOOng/μΙ；
[0168] 步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷 貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型大豆植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均 值;熒光定量PCR引物和探針序列分別是：
[0169] 以下引物和探針用來檢測EPSPS基因序列：
[0170] 引物1:TTGGTGCTAACCTTACCGTTGAG如序列表中SEQIDN0:16所示 ；
[0171] 引物2:GCTTACCACGACCTTCAAGACG如序列表中SEQIDN0:17所示 ；
[0172] 探針1:CTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATC如序列表中SEQIDN0:18所示 ；
[0173] 以下引物和探針用來檢測PAT基因序列：
[0174] 引物3:CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG如序列表中SEQIDN0:19所示 ；
[0175] 引物4:TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG如序列表中SEQIDN0:20所示 ；
[0176] 探針2:CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG如序列表中SEQIDN0:21所示 ；
[0177] PCR反應(yīng)體系為：
[0178]
[0179] 所述50X引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45μL，100μΜ濃度的探針50μ L和860ylLl ΧΤΕ緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀色試管中。
[0180] PCR反應(yīng)條件為：
[0181]
[0182]利用SDS2.3軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)，獲得單拷貝的轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004。
[0183] 第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004檢測
[0184] 3丄基因組DNA提取
[0185] DNA提取按照常規(guī)采用的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法:取2克幼嫩的轉(zhuǎn)基因大 豆事件DBN9004的葉片在液氮中研磨成粉后，加入0.5mL于溫度65°C預(yù)熱的DNA提取CTAB緩 沖液（20g/L CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，20mM EDTA(乙二胺四乙酸），用NaOH調(diào)pH至 8.0)，充分混勻后，于溫度65°C抽提90分鐘；加入0.5倍體積苯酚，0.5倍體積氯仿，顛倒混 勾；12000rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))轉(zhuǎn)速下離心10分鐘;吸取上清液，加入2倍體積無水乙醇，輕柔晃 動離心管，于溫度4°C靜置30分鐘；12000rpm轉(zhuǎn)速下再離心10分鐘；收集DNA到管底;棄上清 液，用lmL質(zhì)量濃度為70 %的乙醇，洗滌沉淀；12000rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘；真空抽干或在超 凈臺吹干;DNA沉淀溶解于適量的TE緩沖液（10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH 8.0)中，保存在 溫度-20°C條件下。
[0186] 3.2、側(cè)翼DNA序列的分析
[0187]對上述提取的DNA樣品進(jìn)行濃度測定，使待測樣品的濃度位于80-100ng/yL之間。 用選擇出的限制性內(nèi)切酶Ps i I、DraI和TaqI (5 '端分析)和Af III、TaqI和Ps i I (3 '端分析)分 別酶切基因組DNA。每個酶切體系中加入26.5yL基因組DNA、0.5yL上述選擇出的限制性內(nèi)切 酶、以及3yL酶切緩沖液，酶切1小時。待酶切結(jié)束后，向酶切體系中加入70yL無水乙醇，冰浴 30分鐘，轉(zhuǎn)速12000rpm離心7分鐘，棄上清，吹干，之后加入8.5yL雙蒸水(dd H20)、lyL 10X T4-DNA連接酶緩沖液(NEB T4DNA Ligase Reaction Buffer，其具體配方可訪問NEB網(wǎng)站或 參考https://www .neb.com/products/restriction-endonucleases、https:// www.neb·com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-bufTe;r)以及0·5yL TfDNA連接 酶在溫度4°C連接過夜。用一系列嵌套引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分離5'和3'轉(zhuǎn)基因/基因組DNA。具 體的，分離5'轉(zhuǎn)基因/基因組DNA引物組合包括SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:26作為第一引物， SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28作為第二引物，SEQ ID勵：13作為測序引物。分離3'轉(zhuǎn)基因/ 基因組DNA引物組合包括SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:29作為第一引物，SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31作為第二引物，SEQ ID NO: 15作為測序引物，PCR反應(yīng)條件如表3所示。
[0188] 所獲得的擴(kuò)增子在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳以分離PCR反應(yīng)物，隨后使用膠回收試 劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit，目錄#_28704，Qiagen Inc.，Valencia，CA)從瓊脂糖 基質(zhì)分離目的片段。然后對純化的PCR產(chǎn)物測序(例如，ABI PrismTM 377，PE Biosystems， Foster City，CA)并分析(例如，DNASTAR序列分析軟件，DNASTAR Inc.，Madison，WI)。
[0189] 使用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法確認(rèn)5 '和3 '側(cè)翼序列和接點(diǎn)序列。5 '側(cè)翼序列和接點(diǎn)序列可使 用SEQIDN0:8或SEQIDN0:12，組合SEQIDN0:9、SEQIDN0:13或SEQIDN0:26來確認(rèn)。 3'側(cè)翼序列和接點(diǎn)序列可使用SEQIDN0:11或SEQIDN0:14，組合SEQIDN0:10、SEQID NO: 15或SEQ ID NO: 29來確認(rèn)。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件如表2和表3所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員 將理解，其他引物序列也可用于確認(rèn)側(cè)翼序列和接點(diǎn)序列。
[0190] PCR產(chǎn)物的DNA測序提供了可以用于設(shè)計(jì)其他DNA分子的DNA，所述其他DNA分子作 為引物和探針用于來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的大豆植物或種子的鑒定。
[0191] 發(fā)現(xiàn)在SEQ ID N0:5的核苷酸1-1268位顯示的為大豆基因組序列在轉(zhuǎn)基因大豆事 件DBN9004插入序列的右邊界側(cè)翼（5'側(cè)翼序列），在SEQ ID N0:5的核苷酸6068-7059位顯 示的為大豆基因組序列在轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004插入序列的左邊界側(cè)翼（3'側(cè)翼序列）。 5'接合序列在SEQ ID NO: 1中列出，3'接合序列在SEQ ID N0:2中列出。
[0192] 3.3、PCR接合性測定
[0193] 接合序列是相對短的多核苷酸分子，其是新的DNA序列，當(dāng)在多核酸檢測分析中檢 測到時對于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA是診斷性的。SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2中的接 合序列為轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中轉(zhuǎn)基因片段的插入位點(diǎn)和大豆基因組DNA的每一側(cè)的 11個多核苷酸。更長或更短的多核苷酸接合序列可以從SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中選 擇。接合序列（5'連接區(qū)域SEQ ID NO: 1，和3'連接區(qū)域SEQ ID N0:2)作為DNA探針或作為 DNA引物分子在DNA檢測方法中是有用的。接合序列SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7也是轉(zhuǎn)基因 大豆事件DBN9004中新的DNA序列，其也可以作為DNA探針或作為DNA引物分子檢測轉(zhuǎn)基因大 豆事件DBN9004DNA的存在。所述SEQ ID N0:6(SEQ ID N0:3的核苷酸第741-872位)跨越了 PDBN4003構(gòu)建體DNA序列和t35S終止子序列，所述SEQ ID N0:7(SEQ ID N0:4的核苷酸第 170-287位)跨越了 prGml 7gTsf 1啟動子序列和pDBN4003構(gòu)建體DNA序列。
[0194] 此外，通過使用來自SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的至少一個引物來產(chǎn)生擴(kuò)增子， 所述引物用于PCR方法中時產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的診斷性擴(kuò)增子。
[0195] 具體地，從轉(zhuǎn)基因插入序列的5 '末端產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物為包含來源于轉(zhuǎn)基 因大豆事件DBN9004的植物材料的基因組中側(cè)翼于T-DNA插入序列的5 '末端的基因組DNA的 一部分。這個PCR產(chǎn)物包含SEQ ID N0: 3。為了進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)與側(cè)翼于轉(zhuǎn)基因插入序列 的5'末端的基因組DNA序列雜交的引物5(SEQ ID N0:8)，和與之配對的位于轉(zhuǎn)基因 t35S轉(zhuǎn) 錄終止序列的引物6(SEQ ID N0:9)。
[0196] 從轉(zhuǎn)基因插入序列的3'末端產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物包含來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004的植物材料的基因組中側(cè)翼于T-DNA插入序列的3 '末端的基因組DNA的一部分。這 個PCR產(chǎn)物包含SEQ ID N0:4。為了進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)與側(cè)翼于轉(zhuǎn)基因插入序列的3'末端的 基因組DNA序列雜交的引物8(SEQ ID N0: 11)，和與之配對的位于插入物的3'末端的 prGml7gTsfl啟動子序列的引物7(SEQ IDN0:10)。
[0197] 表2和表3中說明的DNA擴(kuò)增條件可以用于上述PCR接合性試驗(yàn)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆 事件DBN9004的診斷性擴(kuò)增子。擴(kuò)增子的檢測可以通過使用Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin_Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradien熱循環(huán)儀等進(jìn)行，或通過 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和設(shè)備進(jìn)行。
[0198] 表2、用于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的5'轉(zhuǎn)基因插入物/基因組接合區(qū)域鑒定的PCR 步驟和反應(yīng)混合物條件
[0199]
[0200] 表3、Perkin_Elmer9700 熱循環(huán)儀條件
[0201]
[0202] 輕輕地混合，如果熱循環(huán)儀上沒有保溫帽，可以在每個反應(yīng)液上方添加1-2滴礦物 油。使用以上循環(huán)參數(shù)（表3)在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、MJ Engine(MJ R-Biorad，Hercules，CA)、Perkin_Elmer 9700(Perkin Elmer，Boston，MA)或 Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR〇 MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀應(yīng)當(dāng)在計(jì)算的模式下運(yùn)行。 Perkin-Elmer 9700熱循環(huán)儀運(yùn)行時要將變溫速率(ramp speed)設(shè)定為最大值。
[0203] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：引物5和6(SEQ ID勵:8和9)，當(dāng)其用在轉(zhuǎn)基因大豆事件08冊004基 因組DNA的PCR反應(yīng)中時，產(chǎn)生1207bp片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)其用在未轉(zhuǎn)化大豆基因組DNA和非 DBN9004大豆基因組DNA的PCR反應(yīng)中時，沒有片段被擴(kuò)增；引物7和8(SEQIDN0:10和11)， 當(dāng)其用在轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004基因組DNA的PCR反應(yīng)中時，產(chǎn)生631bp片段的擴(kuò)增產(chǎn)物， 當(dāng)其用在未轉(zhuǎn)化大豆基因組DNA和非DBN9004大豆基因組DNA的PCR反應(yīng)中時，沒有片段被擴(kuò) 增。
[0204] PCR接合性測定還可用于鑒定來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的材料是純合子或 是雜合子。將引物9(SEQIDN0:12)、引物10(SEQIDN0:13)和引物11(SEQIDN0:14)用于 擴(kuò)增反應(yīng)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的診斷性擴(kuò)增子。表4和表5中說明的DNA擴(kuò)增條件 可以用于上述接合性試驗(yàn)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的診斷性擴(kuò)增子。
[0205] 表4、接合性測定反應(yīng)液
[0208] 表5、接合性測定Perkin_Elmer9700熱循環(huán)儀條件
[0206]
[0207]
[0209]
[0210] 使用以上循環(huán)參數(shù)（表5)在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、 MJ Engine(MJ R-Biorad，Hercules，CA)、Perkin-Elmer 9700(Perkin Elmer,Boston,MA) 或 Eppendorf Mas ter cycler Gradient (Eppendorf，Hamburg，Germany)熱循環(huán)儀上進(jìn)行 PdMJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀應(yīng)當(dāng)在計(jì)算的模式下運(yùn)行。 Perkin-Elmer 9700熱循環(huán)儀運(yùn)行時要將變溫速率(ramp speed)設(shè)定為最大值。
[0211] 在所述擴(kuò)增反應(yīng)中，含有模板DNA的生物樣品含有診斷該樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004的存在情況的DNA。或者反應(yīng)將由含有來源于大豆基因組的DNA的生物樣品產(chǎn)生兩 個不同的DNA擴(kuò)增子，所述來源于大豆基因組的DNA相對于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中存在 的插入DNA對應(yīng)的等位基因是雜合的。這兩個不同的擴(kuò)增子將對應(yīng)于來源于野生型大豆基 因組基因座的第一擴(kuò)增子和診斷轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004DNA的存在情況的第二擴(kuò)增子。僅 產(chǎn)生對應(yīng)于針對雜合基因組描述的第二擴(kuò)增子的單個擴(kuò)增子的大豆DNA樣品，可診斷確定 該樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的存在，且該樣品由相對于轉(zhuǎn)基因大豆植物DBN9004中存 在的插入DNA對應(yīng)的等位基因?yàn)榧兒系拇蠖狗N子所產(chǎn)生。
[0212] 需要說明的是，轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的引物對被用于產(chǎn)生對轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004基因組DNA為診斷性的擴(kuò)增子。這些引物對包括但不限于，引物5和6(SEQ ID N0:8 和9)，和引物7和8(SEQ ID NO: 10和11)，用于所述的DNA擴(kuò)增方法中。另外，用于擴(kuò)增大豆內(nèi) 源基因的一個對照引物12和13(SEQ ID N0:22和23)被包括在內(nèi)，作為反應(yīng)條件的一個內(nèi)在 標(biāo)準(zhǔn)。對轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA抽提樣品分析應(yīng)該包括一個轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004的陽性組織DNA抽提物對照，一個來源于非轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的陰性DNA抽提 物對照和一個不含有模板大豆DNA抽提物的陰性對照。除了這些引物對之外，還可以使用來 自SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4、或其互補(bǔ)序列的任何引物對，當(dāng)它們被用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)時 分別產(chǎn)生對于來源于轉(zhuǎn)基因事件大豆植物DBN9004的組織為診斷性的包含SEQ ID NO: 1或 SEQ ID N0:2的擴(kuò)增子。表2-表5中說明的DNA擴(kuò)增條件可以用于使用合適的引物對以產(chǎn)生 轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的診斷性擴(kuò)增子。當(dāng)在DNA擴(kuò)增方法中測試時產(chǎn)生對轉(zhuǎn)基因大豆事 件DBN9004為診斷性的擴(kuò)增子的、推定含有包含轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的大豆植物或種子 DNA的提取物，或來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的產(chǎn)物，可以被用作擴(kuò)增的模板，來確定是 否存在轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004。
[0213] 第四實(shí)施例、通過Southern印跡雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004檢測 [0214] 4.1、用于Southern印跡雜交的DNA提取
[0215]利用T4、T5和T6代純合的轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行Southern印跡分析。利用研缽和研杵，在液 氮中中將植物組織磨碎。在20mLCTAB裂解緩沖液（lOOmM Tris pH8.0,20mM EDTA ρΗ8·0， 1.4M NaCl，0.2 % v/vβ-疏基乙醇，2 % w/v聚乙烯-吡咯烷酮）中重懸浮4-5g研磨過的植物組 織，并且在溫度65°C下溫育60分鐘。溫育期間，每10分鐘將樣品顛倒混勻一次。溫育后，添加 等體積的氯仿/異戊醇（24:1)，通過倒置輕輕混合，以轉(zhuǎn)速4000rpm離心20分鐘。收集水相， 在添加等體積異丙醇后在溫度_20°C下放置1小時以沉淀DNA，再以轉(zhuǎn)速4000rpm離心5分鐘 得到DNA沉淀，然后在lmL TE緩沖液中重懸浮DNA沉淀。為了降解任何存在的RNA，在溫度37 。(:下，將DNA和濃度為30mg/mL的5yL RNAase A溫育30分鐘，以轉(zhuǎn)速4000rpm離心5分鐘，然后 在0.1體積3M醋酸鈉和2體積無水乙醇存在的情況下，以轉(zhuǎn)速14000rpm離心10分鐘沉淀DNA。 棄掉上清液后，用70 % (v/v)的lmL乙醇洗滌沉淀，使其干燥后在lmL TE緩沖液中重新溶解。 用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃 度。
[0216] 4.2、限制酶消化
[0217] 在1〇〇此反應(yīng)體系中，每次消化5yg DNA。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和EcoRV分別消化 基因組DNA，以T-DNA上EPSPS和PAT的部分序列作為探針。對于每種酶，在適當(dāng)?shù)臏囟认逻^夜 溫育消化物。利用真空離心蒸發(fā)濃縮器(speed vacuum，Thermo Scientific)旋轉(zhuǎn)樣品以減 少體積至20yL。
[0218] 4.3、凝膠電泳
[0219] 向來源于本實(shí)施例4.2中的每個樣品添加溴酚藍(lán)加樣染料，并且將每個樣品加樣 到含有溴化乙錠的〇 . 7 %瓊脂糖凝膠上，在TAE電泳緩沖液(40mM Tris-醋酸，2mM EDTA， pH8.0)中電泳分離，在20伏特下電泳凝膠過夜。
[0220] 分別用變性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH)和中和液（1.5M NaCl，0.5M Tris，pH7.2) 處理凝膠各30分鐘。在瓷盤中倒入5XSSC，搭上一塊玻璃板，然后依次放浸濕的濾紙橋，凝 膠，帶正電的尼龍膜(R〇che，Cat.No. 11417240001)，三層濾紙，紙塔，重物。在室溫下轉(zhuǎn)膜過 夜后，在2 X SSC中漂洗尼龍膜10秒，通過UV交聯(lián)將DNA固定在膜上。
[0221] 4.4、雜交
[0222] 用PCR擴(kuò)增適合的DNA序列用于探針制備。所述DNA探針為SEQIDN0:24和SEQID N0:25,或者與上述序列部分同源或互補(bǔ)。用DNA高效地高辛標(biāo)記及檢測試劑盒II(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 試齊丨J 盒，Roche， Cat .No. 11585614910)進(jìn)行探針的DIG標(biāo)記、Southern印跡雜交以及信號檢測等操作，具體 方法參考其廣品說明書。
[0223] 每個Southern上包括兩種對照樣品：（1)來自陰性(未轉(zhuǎn)化的）的分離子的DNA，其 用于鑒定任何可與元件-特異性探針雜交的內(nèi)源大豆序列；（2)基于探針長度等價于一個拷 貝數(shù)的Hind III-消化的pDBN4003質(zhì)粒，其作為雜交的陽性對照并用于說明實(shí)驗(yàn)的靈敏度。
[0224] 雜交數(shù)據(jù)提供了確證的證據(jù)支持TaqMan? PCR分析，即大豆植物DBN9004含有 EPSPS和PAT基因的單拷貝。利用該EPSPS探針，EcoR I和EcoR V酶解分別產(chǎn)生大小約llkb和 13kb的單一條帶;利用該P(yáng)AT探針，EcoR I和EcoR V酶解分別產(chǎn)生大小約8kb和3.2kb的單一 條帶。這表明EPSPS和PAT各一個拷貝存在于大豆轉(zhuǎn)化事件DBN9004中。
[0225] 第五實(shí)施例、通過ELISA檢測轉(zhuǎn)基因玉米事件名稱蛋白質(zhì)
[0226] EPSPS和PAT蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004中的表達(dá)范圍，可通過ELISA進(jìn)行檢 測。
[0227] 取2mg轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的新鮮葉片作為樣品，液氮研磨后加入lmL所述萃 取緩沖液（8g/L NaCl，0.27g/L KH2P〇4，1.42g/L Na2HP〇4,0.2g/L KCl，5.5ml/L Tween-20， pH7.4)，4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液用所述萃取緩沖液稀釋40倍，取80μ1稀釋 后的上清液用于ELISA檢測。
[0228] 用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)試劑盒(ENVIRL0GIX公司，EPSPS試劑盒和PAT試劑 盒)對樣品中蛋白質(zhì)(EPSPS蛋白和PAT蛋白）量占葉片鮮重的比例進(jìn)行檢測分析，具體方法 參考其產(chǎn)品說明書。同時以野生型大豆植株葉片(非轉(zhuǎn)基因，NGM)作為對照，按照上述方法 進(jìn)行檢測分析，每株重復(fù)6次。
[0229] 轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的蛋白質(zhì)(EPSPS蛋白和PAT蛋白）含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6 所示。分別測得轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004和野生型大豆植株的新鮮葉片中EPSPS蛋白平均表 達(dá)量占葉片鮮重的比例(yg/g)分別為230.9和0;轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004和野生型大豆植 株的新鮮葉片中PAT蛋白平均表達(dá)量占葉片鮮重的比例(yg/g)分別為200.1和0。
[0230] 表6、轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的蛋白表達(dá)量(yg/g)測定平均結(jié)果
[0231]
[0232] 第六實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的除草劑耐受性檢測
[0233] 本試驗(yàn)選用農(nóng)達(dá)除草劑(41%草甘膦異丙銨鹽水劑)和保試達(dá)(Basta)除草劑(有 效成分18%的草銨膦）進(jìn)行噴施。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。小區(qū)面積為18m 2(5mX 3.6m)，行距60cm，株距8cm，常規(guī)栽培管理，小區(qū)之間有l(wèi)m的寬隔離帶。將轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004分別進(jìn)行如下3種處理：1)不噴施，人工控草;2)按1680g a. e. /ha(a. e./ha是指"活 性成分當(dāng)量酸每公頃"）劑量在V3葉期噴灑農(nóng)達(dá)除草劑，然后在R2期(盛花期)按相同劑量再 次噴灑農(nóng)達(dá)除草劑;3)按800g a. i ./ha(a. i ./ha是指"活性成分每公頃"）劑量在V3葉期噴 灑保試達(dá)除草劑，然后在V6期按相同劑量再次噴灑保試達(dá)除草劑;4)按800g a. i . /ha劑量 在V3葉期噴灑保試達(dá)除草劑，然后在R2期按1680g a.e./ha劑量噴灑農(nóng)達(dá)除草劑。用野生型 玉米植株(非轉(zhuǎn)基因，NGM)做平行對照實(shí)驗(yàn)。需要說明的是，不同含量和劑型的草甘膦除草 劑換算成等量草甘膦酸的形式，以及不同濃度的草銨膦溶液換算成上述等量有效成分草銨 膦均適用于以下結(jié)論。
[0234] 分別在用藥后1周和2周調(diào)查藥害癥狀，并在收獲時測定小區(qū)的大豆產(chǎn)量。藥害癥 狀分級如表7所示。用除草劑受害率作為評價轉(zhuǎn)化事件的除草劑耐受性的指標(biāo)，具體地，除 草劑受害率（％) = Σ(同級受害株數(shù)X級別數(shù))/(總株數(shù)X最高級別）；其中除草劑受害率 包括草甘膦受害率和草銨膦受害率，除草劑受害率是根據(jù)草甘膦或草銨膦處理后2周的藥 害調(diào)查結(jié)果而確定的。每個小區(qū)的大豆產(chǎn)量是稱量各小區(qū)中間3行的大豆?？偖a(chǎn)量(重量）， 不同處理間的產(chǎn)量差異以產(chǎn)量百分率的形式進(jìn)行度量，產(chǎn)量百分率（％ )=噴施產(chǎn)量/不噴 施產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004對除草劑耐受性的結(jié)果和大豆產(chǎn)量結(jié)果如表8所示。
[0235] 表7、除草劑對大豆藥害程度的分級標(biāo)準(zhǔn)
[0236]
[0237] 表8、轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004對除草劑耐受性的結(jié)果和產(chǎn)量測試結(jié)果
[0238]
[0239]結(jié)果說明，在除草劑(草甘膦和草銨膦)受害率方面:1)轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004在 草甘膦除草劑（1680g a. e./ha)處理下受害率基本為0; 2)轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004在草銨 膦除草劑(800g a. i . /ha)處理下受害率也基本為0; 3)轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004在草銨膦除 草劑(800g a.i./ha)和草甘膦除草劑（1680g a.e./ha)處理下受害率也基本為0;由此，轉(zhuǎn) 基因大豆事件DBN9004具有良好的除草劑(草甘膦和草銨膦)耐受性。
[0240] 在產(chǎn)量方面:轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004在噴施草甘膦除草劑（1680g a.e./ha)、草 銨膦除草劑(800g a.i./ha)和草銨膦除草劑(800g a.i./ha)+草甘膦除草劑(1680g a.e./ ha)3種處理下的產(chǎn)量與不噴施處理相比有略有增加，由此，進(jìn)一步表明轉(zhuǎn)基因大豆事件 DBN9004具有良好的除草劑(草甘膦和草銨膦)耐受性。
[0241] 第七實(shí)施例
[0242] 可由轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004生產(chǎn)諸如農(nóng)產(chǎn)品或商品。如果在所述農(nóng)產(chǎn)品或商品 中檢測到足夠的表達(dá)量，所述農(nóng)產(chǎn)品或商品預(yù)期含有能夠診斷轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004材 料在所述農(nóng)產(chǎn)品或商品中存在的核苷酸序列。所述食品或商品包括但不限于來自大豆植物 DBN9004的產(chǎn)物，例如大豆餅、粉和油，具體可以為卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、食用油、脫脂 大豆片、包括脫脂的和烘烤的大豆粉、豆?jié){凝塊、豆腐、大豆蛋白濃縮物、分離的大豆蛋白、 水解植物蛋白、組織化大豆蛋白和大豆蛋白纖維等?；谔结樆蛞飳Φ暮怂釞z測方法和/ 或試劑盒可以被開發(fā)以檢測生物樣品中諸如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0: 2所示的轉(zhuǎn)基因大 豆事件DBN9004核苷酸序列，其中探針序列或引物序列選自如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5中所示的序列或其片段或者與之互補(bǔ)的序列，以 診斷轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的存在。
[0243]綜上所述，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004對草甘膦除草劑和草銨膦除草劑具有 較好的耐受性，對產(chǎn)量無影響，且檢測方法可以準(zhǔn)確快速的鑒定生物樣品中是否包含轉(zhuǎn)基 因大豆事件DBN9004的DNA分子。
[0244] 對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的種子已于2015年11月27日保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中 國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名：大豆(Glycine max)，保藏編號為CGMCC No. 11171。保藏物將在保藏處保藏30年。
[0245] 最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明 的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有以下核酸序列的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:3或 其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的 核苷酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 1或其互 補(bǔ)序列、和/或SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 3或其 互補(bǔ)序列、和/或SEQ ID NO:4或其互補(bǔ)序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 5或其 互補(bǔ)序列。5. -種檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待檢測樣品與用于擴(kuò)增目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的至少兩種引物在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中接觸； 進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng);和 檢測所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在； 所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物包括SEQ ID NO: 3或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/或 SEQ ID NO:4或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特征 在于，所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物包括SEQ ID N0:1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷 酸、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特 征在于，所述目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物包括選自以下的至少一種：SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO:6或其互補(bǔ)序列、和SEQ ID NO:7或其互補(bǔ)序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方 法，其特征在于，至少一種所述引物包括權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述核酸序列或其片段或者與 之互補(bǔ)的序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特征 在于，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物選自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO: 10;所述第二引物選自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 11。10. -種檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待檢測樣品與探針接觸，所述探針包括SEQ ID NO: 3或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù) 的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸； 使所述待檢測樣品和所述探針在嚴(yán)格雜交條件下雜交;和 檢測所述待檢測樣品和所述探針的雜交情況。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特 征在于，所述探針包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸、和/ 或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法， 其特征在于，所述探針包含選自以下的至少一種:SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:2 或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO :6或其互補(bǔ)序列、和SEQ ID NO :7或其互補(bǔ)序列。13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的 方法，其特征在于，至少一個所述探針用至少一種熒光基團(tuán)標(biāo)記。14. 一種檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待檢測樣品與標(biāo)記物核酸分子接觸，所述標(biāo)記物核酸分子包括SEQ ID N0:3或其互 補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷 酸； 使所述待檢測樣品和所述標(biāo)記物核酸分子在嚴(yán)格雜交條件下雜交;和 檢測所述待檢測樣品和所述標(biāo)記物核酸分子的雜交情況，進(jìn)而通過標(biāo)記物輔助育種分 析以確定草甘膦耐受性和/或草銨膦耐受性與標(biāo)記物核酸分子在遺傳學(xué)上是連鎖的。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法，其特 征在于，所述標(biāo)記物核酸分子包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù) 核苷酸、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述檢測樣品中轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004的DNA存在的方法， 其特征在于，所述標(biāo)記物核酸分子包括選自以下的至少一種：SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列、 SEQ ID NO:2或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO:6或其互補(bǔ)序列、和SEQ ID NO:7或其互補(bǔ)序列。17. -種DNA檢測試劑盒，其特征在于，包括至少一個DNA分子，所述DNA分子包括SEQ ID N0:3的同源序列或其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4的同源序列或 其互補(bǔ)序列中至少11個連續(xù)的核苷酸，其可以作為對于轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004或其后代 具有特異性的DNA引物或探針。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述DNA檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA分子包括SEQ ID NO: 1 或其互補(bǔ)序列中第1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸、和/或SEQ ID N0:2或其互補(bǔ)序列中第 1-11位或第12-22位連續(xù)核苷酸。19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18所述DNA檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA分子包括選自以下 的至少一種：SEQ ID NO: 1的同源序列或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO:2的同源序列或其互補(bǔ)序 列、SEQ ID NO:6的同源序列或其互補(bǔ)序列、和SEQ ID NO:7的同源序列或其互補(bǔ)序列。20. -種植物細(xì)胞或部分，其特征在于，包含編碼草甘膦耐受性EPSPS蛋白的核酸序列、 編碼草銨膦耐受性PAT蛋白的核酸序列和特定區(qū)域的核酸序列，所述特定區(qū)域的核酸序列 包括選自以下的至少一種：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示的 序列。21. -種產(chǎn)生對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑具有耐受性的大豆植株的方法，其特 征在于，包括向所述大豆植株的基因組中引入編碼草甘膦耐受性EPSPS蛋白的核酸序列和/ 或編碼草銨膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、以及特定區(qū)域的核酸序列，所述特定區(qū)域的核酸 序列選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示序列中至少一種核酸序列。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述產(chǎn)生對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑具有耐受性的大豆 植株的方法，其特征在于，包括： 將對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑具有耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆事件DBN9004第一親 本大豆植株與缺少草甘膦和/或草銨膦耐受性的第二親本大豆植株有性雜交，從而產(chǎn)生大 量子代植株； 用草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑處理所述子代植株;和 選擇耐受草甘膦和/或草銨膦的所述子代植株。23. -種培養(yǎng)對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑具有耐受性的大豆植物的方法，其特 征在于，包括： 種植至少一粒大豆種子，所述大豆種子的基因組中包括編碼草甘膦耐受性EPSPS蛋白 的核酸序列和/或編碼草銨膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、以及特定區(qū)域的核酸序列； 使所述大豆種子長成大豆植株;和 用有效劑量草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑噴灑所述大豆植株，收獲與其他不具有 特定區(qū)域的核酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷的植株； 所述特定區(qū)域的核酸序列選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列。24. -種保護(hù)植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特征在于，包括將含有有效劑量 草甘膦和/或草銨膦的除草劑施加到種植至少一種轉(zhuǎn)基因大豆植物的大田中，所述轉(zhuǎn)基因 大豆植物在其基因組中包含選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列，所述轉(zhuǎn)基因大豆 植物具有對草甘膦除草劑和/或草銨膦除草劑的耐受性。25. -種控制田間雜草的方法，其特征在于，包括將含有有效劑量草甘膦和/或草銨膦 的除草劑施加到種植至少一種轉(zhuǎn)基因大豆植物的大田中，所述轉(zhuǎn)基因大豆植物在其基因組 中包含選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列，所述轉(zhuǎn)基因大豆植物具有對草甘膦除 草劑和和/或草銨膦除草劑的耐受性。26. -種控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其特征在于，包括將 含有有效劑量草銨膦的除草劑施加到種植至少一種草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物的大 田中，所述草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物在其基因組中包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至 少一種核酸序列，所述草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物同時具有對草銨膦除草劑的耐受 性。27. -種延緩昆蟲抗性的方法，其特征在于，包括在種植抗蟲大豆植物的大田中種植至 少一種具有草甘膦和/或草銨膦耐受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物，所述具有草甘膦和/或草銨膦耐 受性的轉(zhuǎn)基因大豆植物在其基因組中包含選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示序列中至少一種核酸序列。28. -種包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的多核苷酸的農(nóng)產(chǎn)品或商品，其特征在于，所 述農(nóng)產(chǎn)品或商品為卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、大豆片、大豆粉、大豆蛋白或其濃縮物、大豆 油、大豆蛋白纖維、豆?jié){凝塊或豆腐。
【文檔編號】C12N15/11GK106086011SQ201610440310
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月18日
【發(fā)明人】王登元, 于彩虹, 張成偉, 韓超, 李曉嬌, 姜自芹, 張良君, 吳竹筠, 田康樂, 鮑曉明
【申請人】北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司