耐除草劑大豆dp-356043及其衍生品種的lamp檢測(cè)引物組、lamp檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組、
LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，屬于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的檢測(cè)方法，具體是耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組、LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前世界上大豆種植已遍及五十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，主產(chǎn)地主要是美國(guó)、巴西、阿根廷和中國(guó)，中國(guó)是栽培大豆的起源地。隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，城市化進(jìn)程加快，居民對(duì)大豆以及其副產(chǎn)品的消費(fèi)日益增加，而且大豆廣泛用于食品、醫(yī)藥和化學(xué)工業(yè)，但是國(guó)產(chǎn)大豆產(chǎn)量增長(zhǎng)達(dá)不到市場(chǎng)需求，進(jìn)口大豆的數(shù)量逐漸增加。
[0003]杜邦先鋒國(guó)際良種公司研制轉(zhuǎn)基因抗兩種除草劑的大豆DP-356043，對(duì)草甘膦與磺酰脲類(lèi)(SU)除草劑表現(xiàn)為雙重抗性。轉(zhuǎn)入GAT基因，編碼對(duì)除草劑草甘膦的抗性，乙酰乳酸合成酶(ALS)基因GM-HRA，編碼對(duì)磺酰脲類(lèi)(SU)除草劑的抗性。DP-356043通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化得到，插入序列為單拷貝。
[0004]我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)抗除草劑大豆DP-356043作為可進(jìn)口用作加工原料，為了對(duì)抗除草劑大豆DP-356043的流通進(jìn)行規(guī)范管理，建立有效的抗除草劑大豆DP-356043的檢測(cè)方法與體系，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施和安全性評(píng)價(jià)具有十分重要的意義。
[0005]目前，轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法主要有以下2類(lèi):
1)基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)，現(xiàn)在應(yīng)用最廣的是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以及Westernblot的檢測(cè)方法，這類(lèi)方法要求高質(zhì)量、高特異性的抗體，否則會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，檢測(cè)的靈敏度較低；
2)基于DNA的檢測(cè)，主要是針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物中的外源插入基因進(jìn)行檢測(cè)，主要有分子雜交技術(shù)、PCR檢測(cè)技術(shù)和芯片檢測(cè)技術(shù)，其中PCR檢測(cè)方法是最主要、最準(zhǔn)確的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的方法，但這類(lèi)方法的反應(yīng)體系和操作過(guò)程比較復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)人員；需要特定的PCR儀，擴(kuò)增時(shí)間2?3小時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果需要進(jìn)行終產(chǎn)物檢測(cè)如電泳；電泳常用染料如EB等有較強(qiáng)毒性，且難以實(shí)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。定量PCR檢測(cè)靈敏度高，所使用的熒光種類(lèi)主要Taqman探針、SYBR Green I和分子信標(biāo)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，體系中產(chǎn)生的焚光信號(hào)值隨之增大。其他兩種方法較SYBR GreenI染料法靈敏度相對(duì)較高，但是熒光定量PCR儀器成本較大。
[0006]綜上所述，在生產(chǎn)實(shí)踐中均需要一種快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法。
[0007]環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermal Amplificat1n，以下簡(jiǎn)稱LAMP法)是Notomi和0kayama2000年前后開(kāi)發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未有將恒溫?cái)U(kuò)增目視檢測(cè)技術(shù)、恒溫實(shí)時(shí)熒光技術(shù)應(yīng)用于快速檢測(cè)耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組、LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問(wèn)題。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組，包括外引物1和外引物2、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物1:CATAACCTCATCTCGCCTT(SEQ ID No:l)；
外引物2:CAATGGAATCCGAGGAGG(SEQ ID No:2)；
內(nèi)引物1:AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAA C(SEQ ID No:3)；
內(nèi)引物2:TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGT ATCCSEQ ID No:4)。
[0010]耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分:
(1)引物液:含有上述的耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組，所述引物液中各引物的濃度分別為48?52μΜ外引物1、48?52μΜ外引物2，48?52μΜ內(nèi)引物1、48?52μΜ內(nèi)引物2;
(2)反應(yīng)液:含有12mM dNTPs、10 X Isothermal Amplificat1n反應(yīng)緩沖液、150mMMgS04水溶液，所述dNTPs、反應(yīng)緩沖液和MgS04水溶液的體積比是7?9:4?6:2;
(3)DNA聚合酶:DNA聚合酶的濃度為7?9UAU;
(4)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照為耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
[0011]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述弓丨物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ內(nèi)引物1、50μΜ內(nèi)引物2。
[0012]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶的濃度為8υ/μ1。
[0013]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述反應(yīng)液中，1 2mM dNTP: 10 X IsothermalAmp 1 if i cat 1n反應(yīng)緩沖液:150mM MgS(k水溶液的體積比為8:5:2。
[0014]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:還含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料Calcein。
[0015]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:還含有熒光指示劑，所述熒光指示劑為SYT0-9。
[0016]利用所述的耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種純化樣品 DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在PCR管中配制反應(yīng)體系:弓I物液1.8μ1，反應(yīng)液15.2μ1，DNA聚合酶1μ1，待檢DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water補(bǔ)齊到25μ1;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA;將配制好的PCR管混勾后離心，并于60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min;
3)結(jié)果判斷:通過(guò)觀察PCR管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0017]利用所述的耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種純化樣品 DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在200μ1PCR管中配制反應(yīng)體系:引物液1.8μ1，反應(yīng)液15.2yl，DNA聚合酶Ιμ?，待檢DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water補(bǔ)齊到25μ1;設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA;將配制好的PCR管混勾后離心，并于60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min;
3)結(jié)果判斷:在上述PCR管中加入1?2μ1顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0018]利用所述的耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)待檢樣品DNA的提取:采用CTAB法提取耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種純化樣品 DNA;
2)恒溫檢測(cè)反應(yīng):在200μ1PCR管中配制反應(yīng)體系:引物液1.8μ1，反應(yīng)液15.2 μΙ,?ΝΑ聚合酶Ιμ?，熒光指示劑SYT0-9 Ιμ?，待檢DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free DistilledWater補(bǔ)齊到25μ1 ；設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA;將配制好的PCR管混勻后離心，并于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀在60?65°C反應(yīng)45?90min，并在80°C條件下持續(xù)2min ；
3)結(jié)果判斷:根據(jù)是否出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0019]其中，CTAB法提取耐除草劑大豆DP-356043及其衍生品種的DNA的方法為:
(1)取轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788約lOOmg，放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反復(fù)研磨3次；
(2)加入1.5ml 預(yù)熱至65°C的CTAB提取緩沖液(100 mM Tris-HCI ( pH 8.0),1.4 ΜNaCI,20mM EDTA pH 8.0)，加入巰基乙醇20μ1，上下震蕩，充分混合，65°C保溫30min，每隔lOmin顛倒混勾一次；
(3)約12000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，