煙粉虱MED隱種TRP基因的CRISPR/cas9系統(tǒng)及其應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及煙粉虱MED隱種TRP基因的CRISPR/cas9系統(tǒng)及其應用。優(yōu)化煙粉虱MED隱種TRP基因序列的sgRNA的靶標位點的合成引物克服脫靶效應，能從核基因水平抑制目的基因表達，從而達到持久穩(wěn)定的效果，成持久穩(wěn)定的突變型。
【專利說明】
煙粉虱MED隱種TRP基因的CRI SPR/cas9系統(tǒng)及其應用
技術(shù)領域
[00011 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及煙粉虱MED隱種TRP基因的CRISPR/cas9系統(tǒng) 及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙粉虱 Bemisia tabaci(Gennadius)屬半翅目（Hemiptera)粉虱科 (Aleyrodidae)，小粉虱屬Bemisia，屬于世界性的入侵害蟲。其中煙粉虱MED隱種自2003年 首次在中國云南昆明發(fā)現(xiàn)，至今為止，已幾乎遍布全國各省，并逐漸取代煙粉虱MEAM1隱種， 成為危害我國農(nóng)作物的主要煙粉虱隱種。MED隱種對溫度具有較強的抵抗力是其能擴散為 全世界重要害蟲并在我國逐漸取代其它隱種的關(guān)鍵因素之一，是其入侵并成功擴張的重要 機制之一。MED隱種具有很強的溫度耐受能力，使其在炎熱的季節(jié)能猖獗危害;而在寒冷季 節(jié)，逐漸擴大的保護地為其提供了越冬場所，使得其累積大量蟲口數(shù)以致暴發(fā)。昆蟲能根據(jù) 環(huán)境溫度的變化而進行體內(nèi)生理性的適應性調(diào)整，其中怎樣感知外界溫度并將其傳遞至體 內(nèi)的溫度感知環(huán)節(jié)起關(guān)鍵作用。
[0003] CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated proteins)系統(tǒng)全名為常間回文重復序列叢集/常間回文重復序列叢 集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)，是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來 對抗入侵的病毒及外源DNA。其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與 tracrRNA(trans_activating RNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復合物，進而引導核酸酶Cas9 蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具 有引導作用的sgRNA(singleguid e RNA)，以引導Cas9對RNA、DNA和蛋白的定點切割，Cas9能 在任何dsDNA序列處帶來任何融合蛋白及RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。然 而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在脫靶效應的問題，限制其從核基因水平抑制目的基因表達的技術(shù) 效果，難以達到持久穩(wěn)定的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服上述技術(shù)問題，提供一種適合煙粉虱MED隱種TRP基因的 CRISPR/cas9系統(tǒng)，進而利用該系統(tǒng)誘導煙粉虱的基因突變，獲得穩(wěn)定的突變型。本發(fā)明使 用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，從核基因水平抑制目的基因表達，為進一步利用誘導基因突變來實現(xiàn) 害蟲的生物防治提供理論基礎。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的煙粉虱MED隱種BtTRP基因的CRISPR/cas9系統(tǒng)，其中，煙粉虱MED隱 種的TRP基因序列的sgRNA的靶標位點，sgRNA靶標位點的合成引物為：引物BtTRP-F : GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
[0006] 引物 sgRNA-R: AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAA CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】，本發(fā)明的煙粉虱MED隱種CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的方 法包括以下步驟：
[0008] 設計煙粉虱MED隱種BtTRP靶基因的sgRNA;
[0009] (1)使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)和HF緩沖液，在PCR儀中進行體外 合成sgRNA;
[0010] (2)以Cas9質(zhì)粒（plasmid 42251，Addgene)為模板，使用mMESSAGE mMACHINE 5卩61(;[1:(細13；[011，1]34)在體外合成0&89-1111?熟；
[0011] (3 )使用Femto j et Express (Eppendorf)，femtot ip 11針（Eppendorf)和 InjectMan NI 2顯微注射儀，進行靶基因的顯微注射；
[0012] (4)將實驗分為注射型組和野生型組，其中注射型組為向煙粉虱偽蛹注射靶基因 的實驗組，野生型組為不注射任何液體的對照組。
[0013] CRISPR/Cas9系統(tǒng)在BtTRP基因溫度耐受性功能驗證中的應用，包括高溫脅迫處理 統(tǒng)計擊倒時間和低溫脅迫處理統(tǒng)計恢復時間。試驗表明本發(fā)明的本發(fā)明的煙粉虱MED隱種 BtTRP基因的CRISPR/cas9系統(tǒng)克服了脫靶效應，能從核基因水平抑制目的基因表達，從而 達到持久穩(wěn)定的效果，成持久穩(wěn)定的突變型。
【附圖說明】
[0014] 圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在驗證煙粉虱MED隱種BtTRP基因耐熱性功能中的應用：比 較煙粉虱注射型和野生型耐熱性表型值差異，即觀察高溫脅迫后擊倒時間。所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，顯著性檢驗水平為P〈0.05。
[0015] 圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在驗證煙粉虱MED隱種BtTRP基因耐寒性功能中的應用：比 較煙粉虱注射型和野生型耐寒性表型值差異，即觀察低溫脅迫后恢復時間。所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，顯著性檢驗水平為P〈0.05。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1:煙粉虱MED隱種CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
[0017] 1、sgRNA引物的設計：
[0018]設計煙粉虱MED隱種的TRP基因序列的sgRNA的靶標位點，sgRNA靶標位點的設計需 要克服脫靶效應而反復優(yōu)化，本發(fā)明的系列優(yōu)化措施包括剔除與靶標序列最后12個堿基或 NGG PAM片段吻合的片段。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。
[0019] 引物BtTRP-F:GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAG AAATAGC；
[0020] 引物 SgRNA-R:AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAA CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇
[0021] 2、sgRNA 的合成：
[0022] (1)使用Phusion聚合酶（New England Biolabs)和HF緩沖液混合，進行30yL體系 的無模板PCR反應，具體為：HF buffer 3.0yL、sgRNA-R 1.2yL、BtTRP-F 1.2yL、dNTP 0·6μ L、Phusion Polymerase 0.6yL、滅菌ddH2〇 23.4yL〇
[0023] (2)反應條件為：98￡€3〇8;98°(：1〇8,6〇1€3〇8,72°(：158,35個循環(huán) ；72°(：1〇11^11，1〇1€ 00 ο
[0024] (3)PCR擴增結(jié)果檢測:PCR產(chǎn)物用1%的凝膠電泳檢測，并送上海生工生物工程技 術(shù)服務有限公司進行測序。
[0025] (4)sgRNA模板的純化：利用TIANGEN的TIANquick Midi Purification Kit試劑盒 將PCR產(chǎn)物進行純化。
[0026] (5)sgRNA的合成：以上一步合成的DNA作為模板，用MEGAscript T7Kit試劑盒 (Ambion)進行體外轉(zhuǎn)錄過程。
[0027] (6)酚氯仿萃取并用異丙醇沉淀純化sgRNA，用ddH20稀釋到1μg/μL并放于-80°C冰 箱保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 3、Cas9mRNA 的合成
[0029] (1)提取質(zhì)粒（plasmid 42251，Addgene)DNA，利用AXYGEN plasmid miniprep kit 試劑盒進行提取；
[0030] (2)質(zhì)粒線性化:用PmeI(New England Biolabs)對質(zhì)粒進行線性化反應；
[0031] (3)乙醇沉淀純化；
[0032] (4)體外轉(zhuǎn)錄合成Cas9mRNA:利用mMESSAGE mMACHINE T7Kit(Ambion)試劑盒進行 轉(zhuǎn)錄合成；
[0033] (5)聚腺苷酸化反應；
[0034] 4、顯微注射
[0035] (1)注射試劑：在30yL體系中，將0.5yg sgRNA和10yg Cas9mRNA混合（大約摩爾比 為2:1)，溶于3yL 3M的醋酸鈉溶液中（pH 5.2)，并用3倍體積的無水乙醇沉淀濃縮(-20°C過 夜沉淀）。12000印111離心30111；[11，加75%的乙醇，12000印1]1離心5111；[11，重復一次，注射前用IlyL 水重懸；
[0036] (2)注射方法:收集煙粉虱MED隱種紅眼期偽蛹，排列并粘附在事先貼有透氣雙面 膠的蓋玻片表面上。使用Femtojet Express(Eppendorf)，femtotip II針（Eppendorf)和 InjectMan NI 2顯微注射儀，從尾端注射，注射壓強為llOOhPa左右，注射時間為0.1 s。
[0037] (3)培育方法:將蓋玻片放置在瓊脂培養(yǎng)基上，放入人工氣候箱中使其完成發(fā)育。 溫度為26±1°C，相對濕度60-80%，光周期為16L:8D。
[0038] 5、CRISPR/Cas9在BtTRP基因溫度耐受性功能驗證中的應用
[0039]現(xiàn)有技術(shù)已研究表明，TRP基因在煙粉虱MED隱種溫度耐熱性中起關(guān)鍵作用 [0040] (1)高溫脅迫處理統(tǒng)計擊倒時間：
[0041] 用吸蟲器收集初羽化煙粉虱成蟲(<3h)(包括注射型和野生型成蟲），放入PCR管，管 口塞已消毒的脫脂棉團，每管1頭成蟲，分別編號。將裝有煙粉虱的PCR管5個一組，同時插入漂 浮板，將漂浮板置于由德國Huber 溫度控制器（CC-106A，Germany，Huber K_Sltem:ase!iinenb:aii GmbH)控溫的水浴槽內(nèi)，溫度提前設置為恒溫45°C，保持液面與脫脂棉團下端齊平，使整個 PCR管腔體都浸沒水中。在PCR管置于水浴槽內(nèi)lmin后，開始計時，觀察管內(nèi)煙粉虱的活動狀 態(tài)，以煙粉虱失去對身體的控制能力，無法自主站立作為熱擊倒計時結(jié)束的標準，并將這段 時間作為高溫擊倒時間TKD(heat knockdown time)。
[0042] (2)低溫脅迫處理統(tǒng)計恢復時間：
[0043]用吸蟲器收集初羽化煙粉虱成蟲（<3h)(包括注射型和野生型成蟲），放入PCR管， 管口塞已消毒的脫脂棉團，每管1頭成蟲，分別編號。將裝有煙粉虱的PCR管10個一組，同時 插入塑料泡沫制成的漂浮板，將漂浮板置于由德國Huber溫度控制器(CC-106A，Germany， HuberKMtemaschinenb.au.GmbH)控溫的內(nèi)置溫控腔體內(nèi)，腔體內(nèi)溫度提前設置丨旦溫于-5°C， 保持液面與脫脂棉團下端齊平，使整個PCR管腔體浸沒水中，并將低溫腔體蓋嚴。在PCR管置 于水浴槽內(nèi)lOmin后，迅速將其取出，擦干管壁上的水，置于室溫26°C環(huán)境下，開始計時。觀 察管內(nèi)煙粉虱的活動狀態(tài)，以煙粉虱逐漸恢復對身體的控制能力，能夠自主站立作為冷擊 倒恢復計時的標準，將這段時間作為冷致昏恢復時間TRc(chillcoma recovery time)。 [0044] 實驗結(jié)果如圖1、2所示。圖1顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在驗證煙粉虱MED隱種BtTRP基 因耐熱性功能中的應用，比較煙粉虱注射型和野生型耐熱性表型值差異，即觀察高溫脅迫 后擊倒時間，注射型的打到時間顯著低于野生型，所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù) 據(jù)統(tǒng)計分析，顯著性檢驗水平為P〈〇 . 05。圖2顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在驗證煙粉虱MED隱種 BtTRP基因耐寒性功能中的應用：比較煙粉虱注射型和野生型耐寒性表型值差異，即觀察低 溫脅迫后恢復時間，注射型的低溫恢復時間顯著高于野生型。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0統(tǒng)計 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，顯著性檢驗水平為P〈〇.05。驗證了 BtTRP基因在煙粉虱溫度耐受性 中起了關(guān)鍵作用，說明本發(fā)明的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能從核基因水平抑制目的基因表達，從而 達到持久穩(wěn)定的效果，成持久穩(wěn)定的突變型。
【主權(quán)項】
1. 煙粉虱MED隱種TRP基因的CRISPR/cas9系統(tǒng)，其特征在于，煙粉虱MED隱種TRP基因序 列的sgRNA靶標位點的合成引物為： 引物 BtTRP-F: GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGAAAT AGC； 引物 sgRNA-R: AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTG CTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇2. 權(quán)利要求1所述煙粉虱MED隱種TRP基因的CRISPR/cas9系統(tǒng)在獲得煙粉虱MED隱種 TRP基因突變型方面的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK106086008SQ201610405985
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月10日
【發(fā)明人】呂志創(chuàng), 王原, 劉萬學, 萬方浩
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所