一種胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明公開的一株雜交瘤細胞，其保藏編號為CGMCC?No.8705。本發(fā)明公開的一種胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體可以應(yīng)用于大豆、豆餅、豆粕等飼料原料的胰蛋白酶抑制因子檢測，由此制備的試劑盒檢測胰蛋白酶抑制因子具有快速、簡便、更適合批量檢測的特點,解決了目前的檢測難題。
【專利說明】一種胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗體及其應(yīng)用；特別是涉及一種胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆中胰蛋白酶抑制因子對植物本身具有保護作用，可防止大豆籽粒自身發(fā)生分解代謝，使種子處于休眠狀態(tài)，能調(diào)節(jié)大豆蛋白質(zhì)的合成和分解，并具有抗蟲作用。胰蛋白酶抑制因子可抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，降低蛋白質(zhì)的消化、吸收利用，降低了大豆的營養(yǎng)價值和利用效果。
[0003]目前食品工業(yè)及飼料廠只能用尿酶活性來間接測試胰蛋白酶抑制因子含量。但酶化學(xué)檢測方法步驟繁瑣，每次檢樣量少，靈敏度低，結(jié)果變異大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用，該抗體可以應(yīng)用于胰蛋白酶抑制因子的檢測。
[0005]一株雜交瘤細胞，其保藏編號為CGMCC N0.8705。
[0006]由所述的雜交瘤細胞制備的抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0007]所述抗體具體為單克隆抗體。
[0008]一種檢測樣品中胰蛋白酶抑制因子含量的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，該試劑盒含有由所述的雜交瘤細胞制備的胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體。
[0009]上述試劑盒中，所述試劑盒由所述的雜交瘤細胞制備的胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體、胰蛋白酶抑制因子、包被緩沖液、封閉液、20X濃縮洗液、30X濃縮樣品提取液、抗體稀釋液、I X樣品稀釋液、酶標(biāo)板、蓋板膜、酶標(biāo)試劑、底物液A、底物液B和終止液組成；
[0010]所述包被緩沖液為0.02M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液；
[0011]所述封閉液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為BSA、小牛血清、吐溫20和蔗糖；所述BSA在所述封閉液中的濃度為lg/100ml，所述小牛血清在所述封閉液中的體積百分含量為10%，所述吐溫20在所述封閉液中的體積百分含量為0.05%,所述蔗糖在所述封閉液中的濃度為10g/100ml ；
[0012]所述20X濃縮洗液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和吐溫20 ;所述氯化鈉在所述20X濃縮洗液中的濃度為160.0g/L，所述氯化鉀在所述20 X濃縮洗液中的濃度為4.0g/L，所述十二水合磷酸氫二鈉在所述20 X濃縮洗液中的濃度為72.6g/L，所述磷酸二氫鉀在所述20 X濃縮洗液中的濃度為4.8g/L，所述吐溫20在所述20 X濃縮洗液中的濃度為10mL/L ；
[0013] 所述30X濃縮樣品提取液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為Tris、HCl和β -巰基乙醇；所述Tris在所述30 X濃縮樣品提取液中的濃度為181.7g/L，所述HCl在所述30X濃縮樣品提取液中的濃度為73ml/L，所述β-巰基乙醇在所述30X濃縮樣品提取液中的濃度為21ml/L ；
[0014]所述抗體稀釋液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為0.02M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液，溶質(zhì)為吐溫20和明膠；所述吐溫-20在所述抗體稀釋液中的濃度為0.lml/L，所述明膠在所述抗體稀釋液中的濃度為lg/L ；
[0015]所述IX樣品稀釋液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為PBS緩沖液，溶質(zhì)為巰基乙醇和明膠，所述巰基乙醇在所述I X樣品稀釋液中的濃度為0.2M，所述明膠在所述I X樣品稀釋液中的濃度為0.01M ;所述PBS緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為NaCl、KCUKH2PO4和Na2HPO4 ;所述NaCl在所述PBS緩沖液中的濃度為8g/L，所述KCl在所述PBS緩沖液中的濃度為0.2g/L，所述KH2PO4在所述PBS緩沖液中的濃度為0.2g/L，所述Na2HPO4在所述PBS緩沖液中的濃度為0.46g/L，所述PBS緩沖液的pH值為7.4 ;
[0016]所述酶標(biāo)試劑為用所述抗體稀釋液按體積比1: 5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG溶液；
[0017]所述HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為ZB-2305。[0018]所述底物液A由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為過氧化氫脲、十二水合磷酸氫二鈉、一水檸檬酸和吐溫20 ;所述過氧化氫脲在所述底物液A中的濃度為0.lg/100ml,所述十二水合磷酸氫二鈉在所述底物液A中的濃度為3.58g/100ml,所述一水檸檬酸在所述底物液A中的濃度為1.03g/100ml,所述吐溫20在所述底物液A中的體積百分含量為0.01% ；
[0019]所述底物液B由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸、一水合檸檬酸、硫代硫酸鈉；所述四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸在所述底物液B中的濃度為0.04g/100ml,所述一水合檸檬酸在所述底物液B中的濃度為0.2g/100ml,所述硫代硫酸鈉在所述底物液B中的濃度為0.01g/100ml ；
[0020]所述終止液為濃度為2M的H2SO4的水溶液；
[0021]所述試劑盒還包含使用說明書，使用說明書記載內(nèi)容如下:如果待測樣品為固體，將待測樣品粉碎成60目以上顆粒，將其溶于IX樣品提取工作液中，25°C振蕩提取，靜置，取上層液體離心得上清液為待測樣品溶液；用包被緩沖液配制4 μ g/mL的胰蛋白酶抑制因子溶液，得包被液；用包被液包被酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體，得到包被的酶標(biāo)板；向包被的酶標(biāo)板中加入封閉液，得到封閉的酶標(biāo)板；用IX洗滌工作液洗滌封閉的酶標(biāo)板，拍干；將IX樣品稀釋液配制的待測樣品溶液或用抗體稀釋液配制的不同濃度的胰蛋白酶抑制因子標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入酶標(biāo)板中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中包含胰蛋白酶抑制因子濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入用抗體稀釋液配制的胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體，振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)；加入酶標(biāo)試劑振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光反應(yīng)；用IX洗滌工作液洗滌酶標(biāo)板，拍干；將等體積的底物液A與底物液B混合，得顯色液；將顯色液加入酶標(biāo)板中，用蓋板膜蓋板后，置37°C避光反應(yīng)；加入終止液，振蕩混勻，于450nm處讀取待
測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔的數(shù)值；按照如下公式計算待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率:
[0022]
百分吸光率(%) =B/BoX100%[0023]B—標(biāo)準(zhǔn)品中除胰蛋白酶抑制因子濃度為O外的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品的450nm平均吸光度值；
[0024]Btl—標(biāo)準(zhǔn)品中胰蛋白酶抑制因子濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)品450nm平均吸光度值；
[0025]以標(biāo)準(zhǔn)品中除胰蛋白酶抑制因子濃度為O外的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(單位ng/ml)的Ig值為橫坐標(biāo)，以相對應(yīng)的百分吸光率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式；將待測樣品的百分吸光率帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到待測樣品中胰蛋白酶抑制因子的濃度；
[0026]所述IX樣品提取工作液由雙蒸水或去離子水將30X濃縮樣品提取液稀釋30倍得到；
[0027]所述IX洗滌工作液由雙蒸水或去離子水將20X濃縮洗液稀釋20倍得到。
[0028]所述振蕩提取的時間為16小時；
[0029]所述離心的條件為4000rpm離心5min ；
[0030]所述包被的條件為4°C包被過夜或37°C孵育2h。
[0031]上述任一所述的試劑盒中，所述胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體制備過程如下:用所述的雜交瘤細胞通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法得到腹水；將腹水進行二氧化硅吸附，得到澄清的腹水；將澄清的腹水依次進行辛酸一硫酸銨沉淀法和親和層析純化得到。
[0032]上述任一所述的試劑盒中，所述小鼠為6~8周齡雌性健康BALB/c小鼠。
[0033]所述親和層析采用的試劑盒為NAb Protein G Spin Purification Kit該試劑盒購自Thermo scientific公司，產(chǎn)品目錄號為89949。
[0034]一種檢測樣品中胰蛋白酶抑制因子含量的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，包括如下步驟:
[0035](I)用包被緩沖液配制胰蛋白酶抑制因子溶液，得包被液；
[0036]所述包被緩沖液為0.02M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液；
[0037](2)用(I)制備的包被液包被酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體，得到包被的酶標(biāo)板；
[0038]( 3 )向包被的酶標(biāo)板中加入封閉液，得到封閉的酶標(biāo)板；
[0039]所述封閉液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為BSA、小牛血清、吐溫20和蔗糖；所述BSA在所述封閉液中的濃度為lg/100ml，所述小牛血清在所述封閉液中的體積百分含量為10%，所述吐溫20在所述封閉液中的體積百分含量為0.05%,所述蔗糖在所述封閉液中的濃度為10g/100ml ；
[0040](4)用I X洗滌液工作液洗滌封閉的酶標(biāo)板，拍干；
[0041]所述IX洗滌工作液由雙蒸水或去離子水將20X濃縮洗液稀釋20倍得到；
[0042]所述20X濃縮洗液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和吐溫20 ;所述氯化鈉在所述20X濃縮洗液中的濃度為160.0g/L，所述氯化鉀在所述20 X濃縮洗液中的濃度為4.0g/L，所述十二水合磷酸氫二鈉在所述20 X濃縮洗液中的濃度為72.6g/L，所述磷酸二氫鉀在所述20 X濃縮洗液中的濃度為4.8g/L，所述吐溫20在所述20X濃縮洗液中的濃度為10mL/L ；
[0043]( 5 )將樣品溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入步驟(4 )制備的酶標(biāo)板中，再加入抗體工作液，振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)；
[0044]所述抗體工作液為用抗體稀釋液配制的胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體溶液；
[0045] 所述標(biāo)準(zhǔn)品為胰蛋白酶抑制因子；[0046]所述標(biāo)準(zhǔn)品中含有標(biāo)準(zhǔn)品1，標(biāo)準(zhǔn)品1為標(biāo)準(zhǔn)品濃度為O的空白溶液；
[0047]所述樣品溶液是用1 X樣品稀釋液配制而成；
[0048]所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液用抗體稀釋液配制而成；
[0049]所述1 X樣品稀釋液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為PBS緩沖液，溶質(zhì)為巰基乙醇和明膠，所述巰基乙醇在所述I X樣品稀釋液中的濃度為0.2M，所述明膠在所述I X樣品稀釋液中的濃度為0.01M ;所述PBS緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為NaCl、KCUKH2PO4和Na2HPO4 ;所述NaCl在所述PBS緩沖液中的濃度為8g/L，所述KCl在所述PBS緩沖液中的濃度為0.2g/L，所述KH2PO4在所述PBS緩沖液中的濃度為0.2g/L，所述Na2HPO4在所述PBS緩沖液中的濃度為0.46g/L，所述PBS緩沖液的pH值為7.4 ;
[0050]所述抗體稀釋液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為0.02M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液，溶質(zhì)為吐溫20和明膠；所述吐溫-20在所述抗體稀釋液中的濃度為0.lml/L，所述明膠在所述抗體稀釋液中的濃度為lg/L ；
[0051](6)重復(fù)步驟(4) 一次；
[0052](7)在步驟(6)的酶標(biāo)板中加入酶標(biāo)試劑，振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光反應(yīng);
[0053]所述酶標(biāo)試劑為用抗體稀釋液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG ；
[0054](8 )將等體積底物液A與底物液B混合，得顯色液；
[0055]所述底物液A由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為蒸餾水，溶質(zhì)為過氧化氫脲、十二水合磷酸氫二鈉、一水檸檬酸、吐溫20 ;所述過氧化氫脲在所述底物液A中的濃度為0.lg/100ml,所述十二水合磷酸氫二鈉在所述底物液A中的濃度為3.58g/100ml,所述一水檸檬酸在所述底物液A中的濃度為1.03g/100ml,所述吐溫20在所述底物液A中的體積百分含量為0.01% ；
[0056]所述底物液B由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為蒸餾水，溶質(zhì)為四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸、一水合檸檬酸、硫代硫酸鈉；所述四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸在所述底物液B中的濃度為0.04g/100ml,所述一水合檸檬酸在所述底物液B中的濃度為0.2g/100ml,所述硫代硫酸鈉在所述底物液B中的濃度為0.01g/100ml ；
[0057](9)將顯色液加入步驟(7)的酶標(biāo)板中，用蓋板膜蓋板后，置37°C避光反應(yīng)；
[0058](10)加入終止液，振蕩混勻，于450nm處讀取樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔的數(shù)值；
[0059]所述終止液為濃度為2M的H2SO4水溶液；
[0060](11)按照如下公式計算樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率:
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一株雜交瘤細胞，其保藏編號為CGMCC N0.8705。
2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞制備的抗體。
3.—種檢測樣品中胰蛋白酶抑制因子含量的試劑盒，該試劑盒含有由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞制備的胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞制備的胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體、胰蛋白酶抑制因子、包被緩沖液、封閉液、.20X濃縮洗液、30X濃縮樣品提取液、抗體稀釋液、IX樣品稀釋液、酶標(biāo)板、蓋板膜、酶標(biāo)試劑、底物液A、底物液B和終止液組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于:所述胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體制備過程如下:用權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法得到腹水；將腹水進行二氧化硅吸附，得到澄清的腹水；將澄清的腹水依次進行辛酸一硫酸銨沉淀法和親和層析純化得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的試劑盒，其特征在于:所述小鼠為6~8周齡雌性健康BALB/c小鼠。
7.—種檢測樣品中胰蛋白酶抑制因子含量的方法，包括如下步驟: (1)用包被緩沖液配制胰蛋白酶抑制因子溶液，得包被液； 所述包被緩沖液為0.02M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液； (2)用(I)制備的包被液包被酶標(biāo)板，棄去孔內(nèi)液體，得到包被的酶標(biāo)板； (3)向包被的酶標(biāo)板中加入封閉液，得到封閉的酶標(biāo)板； 所述封閉液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為BSA、小牛血清、吐溫20和蔗糖；所述BSA在所述封閉液中的濃度為lg/100ml，所述小牛血清在所述封閉液中的體積百分含量為.10%，所述吐溫20在所述封閉液中的體積百分含量為0.05%，所述蔗糖在所述封閉液中的濃度為 10g/100ml ； (4)用IX洗滌液工作液洗滌封閉的酶標(biāo)板，拍干； 所述IX洗滌工作液由雙蒸水或去離子水將20X濃縮洗液稀釋20倍得到； 所述20X濃縮洗液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和吐溫20 ;所述氯化鈉在所述20X濃縮洗液中的濃度為160.0g/L，所述氯化鉀在所述20 X濃縮洗液中的濃度為4.0g/L，所述十二水合磷酸氫二鈉在所述20 X濃縮洗液中的濃度為72.6g/L，所述磷酸二氫鉀在所述20 X濃縮洗液中的濃度為.4.8g/L，所述吐溫20在所述20 X濃縮洗液中的濃度為10mL/L ； (5)將樣品溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入步驟(4)制備的酶標(biāo)板中，再加入抗體工作液，振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)； 所述抗體工作液為用抗體稀釋液配制的胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體溶液； 所述標(biāo)準(zhǔn)品為胰蛋白酶抑制因子； 所述標(biāo)準(zhǔn)品中含有標(biāo)準(zhǔn)品I，標(biāo)準(zhǔn)品I為標(biāo)準(zhǔn)品濃度為O的空白溶液； 所述樣品溶液是用IX樣品稀釋液配制而成； 所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液用抗體稀釋液配制而成； 所述IX樣品稀釋液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為PBS緩沖液，溶質(zhì)為巰基乙醇和明膠，所述巰基乙醇在所述IX樣品稀釋液中的濃度為0.2M，所述明膠在所述IX樣品稀釋液中的濃度為0.01M ;所述PBS緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為NaCl、KCUKH2PO4和Na2HPO4 ;所述NaCl在所述PBS緩沖液中的濃度為8g/L，所述KCl在所述PBS緩沖液中的濃度為0.2g/L，所述KH2PO4在所述PBS緩沖液中的濃度為0.2g/L，所述Na2HPO4在所述PBS緩沖液中的濃度為0.46g/L，所述PBS緩沖液的pH值為7.4 ; 所述抗體稀釋液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為0.02M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液，溶質(zhì)為吐溫20和明膠；所述吐溫-20在所述抗體稀釋液中的濃度為0.lml/L，所述明膠在所述抗體稀釋液中的濃度為lg/L ； (6)重復(fù)步驟(4)一次; (7)在步驟(6)的酶標(biāo)板中加入酶標(biāo)試劑，振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光反應(yīng)； 所述酶標(biāo)試劑為用抗體稀釋液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG ； (8)將等體積底物液A與底物液B混合，得顯色液； 所述底物液A由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為蒸餾水，溶質(zhì)為過氧化氫脲、十二水合磷酸氫二鈉、一水檸檬酸、吐溫20 ;所述過氧化氫脲在所述底物液A中的濃度為0.lg/100ml,所述十二水合磷酸氫二鈉在所述底物液A中的濃度為3.58g/100ml,所述一水檸檬酸在所述底物液A中的濃度為1.03g/100ml,所述吐溫20在所述底物液A中的體積百分含量為0.01% ；所述底物液B由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為蒸餾水，溶質(zhì)為四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸、一水合檸檬酸、硫代硫酸鈉；所述四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸在所述底物液B中的濃度為0.04g/100ml,所述一水合檸檬酸在所述底物液B中的濃度為0.2g/100ml,所述硫代硫酸鈉在所述底物液B中的濃度為0.01g/100ml ； (9)將顯色液加入步驟(7)的酶標(biāo)板中，用蓋板膜蓋板后，置37°C避光反應(yīng)； (10)加入終止液，振蕩混勻，于450nm處讀取樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔的數(shù)值； 所述終止液為濃度為2M的H2SO4水溶液； (11)按照如下公式計算樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率:
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)中胰蛋白酶抑制因子溶液的濃度為4 μ g/mL ； 所述步驟(2)中包被液的體積為每孔100 μ I,所述包被的條件為4°C過夜或37°C孵育2h ； 所述步驟(3)中封閉液的體積為200μ 1，所述封閉的條件為37°C孵育2h ； 所述步驟(4)中所述IX洗滌工作液的體積為350 μ I/孔，所述洗滌的次數(shù)為3次；所述IX洗滌工作液每次浸泡的時間為2秒； 所述步驟(5)中所述胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體為由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞制備的單克隆抗體，所述樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的體積為50 μ 1，所述標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為 Ong/ml、15ng/ml、45ng/ml、135ng/ml、405ng/ml 和 1215ng/ml,所述抗體工作液的體積為.50 μ 1，所述抗體工作液中所述胰蛋白酶抑制因子的單克隆抗體用所述抗體稀釋液按體積比1:8000稀釋，所述反應(yīng)的時間為30分鐘； 所述步驟(7)中所述酶標(biāo)試劑為用所述抗體稀釋液按體積比1: 5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG溶液，所述HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為ΖΒ-2305，所述酶標(biāo)試劑的體積為100 μL/孔，所述反應(yīng)的時間為30分鐘； 所述步驟(9)中所述顯色液的體積為100 μ L/孔，所述反應(yīng)的時間為15分鐘； 所述步驟(10)中所述終止液的體積為50 μ L/孔，所述數(shù)值在加入所述終止液后5分鐘內(nèi)讀??； 所述步驟(12)中所述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為Y=-0.340Χ+1.325。
9.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞或權(quán)利要求2所述的抗體在制備檢測樣品中胰蛋白酶抑制因子含量的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要 求3-6任一所述的試劑盒在檢測樣品中胰蛋白酶抑制因子含量中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/20GK103911353SQ201410158020
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】譙仕彥, 何濤, 魏寒冰, 李悅, 張學(xué), 付巍 申請人:北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司