專利名稱：:能產(chǎn)生耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌及其培養(yǎng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及l(fā))一種含細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物的生產(chǎn)方法，2)用含細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物保存食品的方法，3)能夠產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌的篩選方法。
背景技術(shù)：
：為了防止食品的腐敗和品質(zhì)退化，在各種食品中加入食品防腐劑。這樣的食品防腐劑，迄今為止主要是使用化學(xué)合成的食品防腐劑。然而，化學(xué)合成食品防腐劑有時(shí)會(huì)涉及對光的安全性問題，例如持久性或毒性。為了解決這個(gè)問題，人們期望開發(fā)出來源于傳統(tǒng)食品的安全的抗菌物質(zhì)。同時(shí)，乳酸菌是傳統(tǒng)上己經(jīng)用于生產(chǎn)各種發(fā)酵食品(包括發(fā)酵飲料)，例如醬油、豆瓣醬(H本豆醬)、泡菜和日本清酒等的有用的微生物。另外，乳酸菌已被用于生產(chǎn)發(fā)酵食品的加工。這歸因于，由于通過乳酸發(fā)酵而產(chǎn)生乳酸從而體系的pH降低，因此抑制了存在于生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品中的污染菌的生長，從而能防止這些食品腐敗和品質(zhì)退化。另外，己經(jīng)證明，由乳酸菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對于防止食品的腐敗和品質(zhì)退化也有用?？咕镔|(zhì)中，由各種細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)抗菌物質(zhì)被稱為細(xì)菌素。由乳酸菌產(chǎn)生的各種細(xì)菌素中，乳鏈菌肽是被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的公認(rèn)安全(GRAS)物質(zhì)，同時(shí)也被世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)批準(zhǔn)的具有抗菌活性的安全物質(zhì)。此外，乳鏈菌肽在全世界50多個(gè)國家被用作為食品防腐劑。然而，不利的是，包括乳鏈菌肽在內(nèi)的已知的各種細(xì)菌素與蛋白酶在一起很容易分解。換句話說，在生產(chǎn)像清酒、醬油和豆瓣醬(日本豆醬)等發(fā)酵食品的過程中，細(xì)菌素很容易被由米曲霉等產(chǎn)生的蛋白酶分解。所以細(xì)菌素不能維持滿意的抗微生物活性。例如，據(jù)報(bào)導(dǎo)，在清酒的巴斯德氏滅菌法之前加入乳鏈菌肽的情況下(公開No.JP06另外，經(jīng)過處理的肉類產(chǎn)品，例如火腿和香腸，是由于存在于其原材料自身的微生物或在生產(chǎn)過程中污染微生物而自然發(fā)酵，因此可以賦予更好的風(fēng)味和可保存性。為了穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量、縮短生產(chǎn)周期和防止有害微生物的生長，目前，己經(jīng)丌發(fā)了起子培養(yǎng)物方法(乳酸菌科學(xué)技術(shù)，聯(lián)合出版中心，1996年，239頁)。例如，Chung等人披露了在乳鏈菌肽溶液中浸漬未煮過的肉的效果或在預(yù)先注射特定菌種的新鮮的可食用肉上放置乳鏈菌肽的效果。根據(jù)報(bào)告，用于新鮮的食用肉的乳鏈菌肽很快就失去了活性(Env.Microbiol.55:(6)1329為了防止類似上述乳鏈菌肽的酶分解，一項(xiàng)包括熱處理食用肉、隨后將諸如乳鏈菌肽的羊毛硫氨酸基細(xì)菌素施于熱處理食用肉的表面上的發(fā)明被報(bào)道(公開號JP06-22685)。然而，食用肉在加入乳鏈菌肽之前應(yīng)該加熱處理。因此，該發(fā)明的使用范圍多少受到限制。目前在食品工業(yè)上，迫切要求提供適用于各種食品包括發(fā)酵食品和經(jīng)加工的肉類制品的抗蛋白酶細(xì)菌素。
發(fā)明內(nèi)容如上所述，乳酸菌傳統(tǒng)上已經(jīng)用于處理各種食品包括發(fā)酵食品，而且從來沒有引起任何安全問題。另外，由乳酸菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)被認(rèn)為比化學(xué)合成物質(zhì)安全。因此，本發(fā)明的目的是提供l)一種含細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物的生產(chǎn)方法；2)用含所述細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物保存食品的方法；和3)能夠產(chǎn)生抗蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌的篩選方法。為了解決這個(gè)課題，發(fā)明人對存在于諸如發(fā)酵牛奶等發(fā)酵食品中的乳酸菌進(jìn)行了分離，并篩選了產(chǎn)生新的抗蛋白酶細(xì)菌素的菌株。因此，發(fā)明人成功地分離了產(chǎn)生那種物質(zhì)的乳酸菌。發(fā)明人證實(shí)，由所述菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素是新物質(zhì)。以下詳細(xì)描述本發(fā)明。(1)一種含抗蛋白酶的細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物的生產(chǎn)方法。(2)如(1)所述的方法，其中，乳酸菌屬于Weissella、小球菌屬、乳桿菌屬或白聯(lián)珠菌屬中的任何一個(gè)屬。(3)在(2)中所述的方法，其中，屬于Weissella屬的乳酸菌是WeissellacibariaJCM12495，WissellaconfusaJCM1093、WeissellahdlenicaJCM10103、WeissellakandleriJCM5817、WeissellaminorJCM1168、WeissellaparamesenteroidesJCM9890或WeissellathailandensisJCM10694中的任何一個(gè)。(4)在(2)中所述的方法，其中，屬于小球菌屬的乳酸菌是戊糖片球菌。(5)在(2)中所描述的方法，其中，屬于乳桿菌屬的乳酸菌是植物乳桿菌、Lactobacillussalivarius或Lactobacilluspentosus中的任何一個(gè)。(6)在(2)中所描述的方法，其中，屬于白聯(lián)珠菌屬的乳酸菌是Leuconostoccitreum、Leuconostocpseudomesenteroides、Leuconostocargentinum、Leuconostoccarnosum或Leuconostocmsscntsroicks中的任何一個(gè)o(7)—種保存食物產(chǎn)品的方法，其中，(1)至(6)中任何一個(gè)所述的乳酸菌培養(yǎng)物被用于食品的生產(chǎn)過程。(8)如(7)中所述的方法，其中，食品為發(fā)酵食品或加工過的肉類制品。(9)一種篩選產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌的方法，其包括篩選所述細(xì)菌素即使在蛋白酶存在的情況下也具有抗菌活性的乳酸菌培養(yǎng)物的步驟。以下詳細(xì)描述本發(fā)明。在亞美尼亞，通常也作為一個(gè)長壽國家為人所知，現(xiàn)在已經(jīng)知道了大量傳統(tǒng)上配制給病人的健康食品。例如，食品包括諸如Matsoon和Narine、干杏、紅葡萄酒、jyesiin和tiinaff的乳酸食品。發(fā)明人將注意力主要集中在亞美尼亞人們食用的發(fā)酵牛奶Matsoon和作為發(fā)酵食品原料的清酒曲(koji)上，展開研究工作。在本發(fā)明中，"具有蛋白酶耐性的細(xì)菌素"或"耐蛋白酶細(xì)菌素"是指即使在有來源于米曲霉的蛋白酶存在的情況下仍然具有抗菌活性的細(xì)菌素。也包括其抗菌活性會(huì)被淀粉酶降低的細(xì)菌素。乳酸菌培養(yǎng)物，包含"具有蛋白酶耐性的細(xì)菌素"或"耐蛋白酶細(xì)菌素"，是指形成指示菌株抑制區(qū)的培養(yǎng)物，在下述方法中將作具體說明(1)根據(jù)普通的培養(yǎng)法(或用于分離微生物的培養(yǎng)法)配制乳酸菌培養(yǎng)物。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳酸菌培養(yǎng)物的pH至pH5.5—6.0。隨后，在12,000rpm轉(zhuǎn)速下將培養(yǎng)物離心10分鐘，用一次性注射器過濾裝置"Dismic(2)使用ListeriainnocuaATCC33090T、BacilluscirculansJCM2504T、BacilluscoagulansJCM2257、MicrococcusluteusIFO12708、BacillussubtilisJCM1465T、BacillussubtilisIAM1381、Lactococcuslactissubsp.LactisATCC19435、EnterococcusfaeciumJCM5804T、EnterococcusfaeciumJCM5803T、LactobacillusplantarumATCC14917T禾卩LactobacillussakeiJCM1157T作為指示菌株，通過后述菌苔上點(diǎn)樣法(SPOT-ON—LAWN)或菌落形成單位數(shù)的測定來選擇具有最強(qiáng)抗菌活性的指示菌。(3)酶，使用來源于曲霉(UMAMIZYMEG，AmanoEnzymeCo)的蛋白酶。(4)在如(1)所述的樣品中添加IO至100unit/ml的(3)所述的蛋白酶，在30。C下反應(yīng)1小時(shí)以上。(5)將表現(xiàn)出(2)中所述的最強(qiáng)抗菌活性的指示菌株涂在中厚板上，例如指示菌可以生長的MRS中厚板，在中厚板的中心處滴下0.01毫升如(4)所述的蛋白酶處理過的樣品，在適合指示菌生長的最適溫度下(對于Listeriainnocua，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，Enterococcusfaecium或Pediococcuspentosaceus是37°C,對于其他菌是30°C)培養(yǎng)20至24小時(shí)。然后，可以觀察到指示菌的抑制區(qū)。，本發(fā)明的能夠產(chǎn)生耐蛋白酶的細(xì)菌素的乳酸菌是從發(fā)酵食品等中分離出來的。當(dāng)然，也可以使用通過下述篩選方法獲得的具有抗菌活性的乳酸菌。換言之，任何產(chǎn)生耐蛋白酶的細(xì)菌素的乳酸菌都適宜使用，而對于從哪種菌中分離出來的沒有特殊的限制。根據(jù)發(fā)明人研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乳酸菌當(dāng)中，Weissella屬、小球菌屬(Pediococcus)、Lactobacillus屬、Leuconostoc屬等產(chǎn)生所期望的耐蛋白酶細(xì)菌素。不言而喻，除上述以外，只要是能夠產(chǎn)生耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌，都可以使用。通過在生產(chǎn)醬油、味噌和魚醬等各種發(fā)酵食品以及火腿、香腸等各種加工過的肉制品的工藝中使用含耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物，所述含耐蛋白酶細(xì)菌素的培養(yǎng)物是通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌而得到的，這樣就可以防止目標(biāo)食物的腐敗和品質(zhì)退化。細(xì)菌素可以分離后使用?；蛘撸部梢圆恍璺蛛x直接將包含細(xì)菌素的培養(yǎng)物用作細(xì)菌素。由于分離等純化過程通常很麻煩，所以優(yōu)選將乳酸菌培養(yǎng)物本身添加到生產(chǎn)各種發(fā)酵食品的工藝中。此外，含有耐蛋白酶細(xì)菌素的培養(yǎng)物在生產(chǎn)發(fā)酵食品、加工過的肉制品等的工藝中可以添加一次或多次。細(xì)菌素或液體培養(yǎng)基被分成多少份添加可以自由決定。為獲得預(yù)期的包含耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物，乳酸菌應(yīng)該被培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)次數(shù)、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基可以選擇通常用來培養(yǎng)乳酸菌的培養(yǎng)條件。另外，凝膠過濾等常規(guī)的分離和純化方法也可以用來分離。本發(fā)明的乳酸菌培養(yǎng)物是指含有被培養(yǎng)的乳酸菌的培養(yǎng)基或通過離心等除去所培養(yǎng)的乳酸菌的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是液體、固體或凝膠狀物。當(dāng)使用液體培養(yǎng)基時(shí)，有時(shí)也寫成乳酸菌培養(yǎng)液。當(dāng)然，乳酸菌培養(yǎng)物包括乳酸菌培養(yǎng)液。另外，本發(fā)明的乳酸菌培養(yǎng)物包括，通過噴霧干燥、冷凍干燥等得到的液體乳酸菌培養(yǎng)物的干粉，通過過濾、蒸發(fā)等得到液體乳酸菌培養(yǎng)物的濃縮液或糊狀物，通過凝膠過濾、層析法等得到的具有抗菌活性的液體乳酸菌培養(yǎng)物的一部分。含耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物可以被添加到任何食品中，對比并沒有特殊的限制。最好為，將培養(yǎng)物添加到在生產(chǎn)過程中引入微生物的發(fā)酵食品和加工過的肉制品中。發(fā)酵食品包括醬油、魚醬、清酒、豆瓣醬、味噌、泡菜、乳酪等。這些只是一部分例子，含有耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物可以用于除上述例子之外的食品中。發(fā)酵食品中，一直以來使用氯化鈉作為抑菌劑。由于近年來對低鹽飲食需求的增加以及通過在發(fā)酵作用中降低鹽或除去鹽可以加快蛋白質(zhì)分解速率的優(yōu)勢，已經(jīng)開展了在發(fā)酵食品中使用諸如乳鏈菌肽的細(xì)菌素的研究工作。然而，由于乳鏈菌肽和各種細(xì)菌素被存在于生產(chǎn)過程中的蛋白酶分解，所以目前還沒有觀察到抑菌力。在這樣的生產(chǎn)發(fā)酵食品的工藝中，也可以使用含有耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物。另外，加工過的肉制品包括，例如火腿和香腸。當(dāng)然，這只是舉一些例子。含有耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物可以用于除上述例子之外的食品中。添加了包含耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物的食品，例如發(fā)酵食品和加工過的肉制品等，具有非常高的耐存儲性。在以下的實(shí)施例中，描述作為本發(fā)明的一個(gè)重要方面的產(chǎn)生耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌的篩選方法，在這些實(shí)施例中，乳酸菌是從發(fā)酵食品Matsoon中分離出來的。將從發(fā)酵食品之一的發(fā)酵牛奶Matsoon中收集的樣品在乳酸菌能夠生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基有例如MRS培養(yǎng)基(表1)或M17培養(yǎng)基(表2)，培養(yǎng)溫度為30'C至37'C，放入培養(yǎng)基的樣品量是0.5%。培養(yǎng)天數(shù)為l天、5天或10天。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液涂布在包含0.5%碳酸鈣的瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂1.2%)上并培養(yǎng)。從產(chǎn)生的菌落中收集乳酸菌。表l.MRS培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將收集的乳酸菌按前述方法培養(yǎng)。接著，將來源于米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶的UmamizymeG(Amano酶公司)經(jīng)過濾后添加到MRS瓊脂培養(yǎng)基，在上述MRS瓊脂培養(yǎng)基的平皿內(nèi)接種并培養(yǎng)這些乳酸菌24小時(shí)。隨后，將預(yù)先混合了指示菌株的LactobacilliAOAC培養(yǎng)基(表3)疊加在平皿上，培養(yǎng)24小時(shí)，形成指示菌株的抑制區(qū)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>關(guān)于添加蛋白酶的方法，除了將蛋白酶混合在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的方法外，還可以使用例如以下方法。1)將蛋白酶和指示菌株一起混合至培養(yǎng)基內(nèi)的方法。2)在瓊脂培養(yǎng)基上涂布蛋白酶的方法。3)在培養(yǎng)乳酸菌菌落時(shí)添加蛋白酶的方法，在這種情況下,蛋白酶可以在開始培養(yǎng)時(shí)、在培養(yǎng)期間內(nèi)、或培養(yǎng)結(jié)束后添加。4)將樣品適量滴在混合了指示菌株的培養(yǎng)皿上，觀察抑制區(qū)形成的方法，其中，所述樣品是在培養(yǎng)乳酸菌菌落、然后將培養(yǎng)液中的菌體滅菌或殺死之后，添加了蛋白酶的樣品。再次說明，方法不局限于1)至4)所述的方法。另夕卜，蛋白酶不局限于UmamizymeG。然后，通過分析抗菌譜進(jìn)行評價(jià)。采用菌苔上點(diǎn)樣法(spot-on-lawn)在培養(yǎng)皿上點(diǎn)樣具有抗菌活性的乳酸菌培養(yǎng)物的上清液，考察如下所述的抗菌活性，考查抗菌譜。首先配制具有抗菌活性的樣品。將由上述方法獲得的具有抗菌活性的菌株培養(yǎng)液在10,000rpm下離心10分鐘，從而獲得培養(yǎng)物上清液。然后通過過濾器過濾上清液來獲得無菌樣品。將樣品每次稀釋2倍，直至配制成稀釋級數(shù)為2"的稀釋系列。當(dāng)活性比較低的情況下，在室溫下每次將樣品減壓濃縮2倍，逐漸配制濃度級數(shù)至2—3。然后，培養(yǎng)欲混合在培養(yǎng)皿上來考査抗菌活性的指示菌株。在TSBYE培養(yǎng)基(表5和6)或MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)表4所示的指示菌株。桿菌屬和小球菌屬是用振蕩器培養(yǎng)而其他菌是靜置培養(yǎng)。另外，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、李斯特菌屬(Listeria)、小球菌屬(Pediococcus)和腸球菌(Enterococcus)在37'C培養(yǎng)而其他菌則在3(TC培養(yǎng)。表4.評價(jià)抗菌活性指示菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6.TSB培養(yǎng)基的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>此外，配制考查抗菌活性的平皿在12rC對10毫升MRS瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂1.2%)和5毫升LactobacilliAOAC瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂1.2%)分別滅菌15分鐘，然后，保持溫度55°C。將滅菌后的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注在無菌的陪氏培養(yǎng)皿，然后放置在凈化操作臺上l小時(shí)。隨后，將50ml的指示菌株培養(yǎng)液混合在LactobacilliAOAC瓊脂培養(yǎng)基，保持溫度為55。C。將培養(yǎng)液傾注在MRS平皿上。在凈化操作臺上打開平皿的蓋子(大約15分鐘)，干燥表面。將如上所配制的10pl每一種具有抗菌活性的樣品滴加到平皿上。然后，蓋上蓋子，按照原樣放置大約一小時(shí)，干燥平皿。在適宜于各個(gè)指示菌株的溫度下培養(yǎng)平皿20小時(shí)，來考査抑制區(qū)的形成。這里，抗菌活性(AU/ml)定義如下抗菌活性(AU/ml)=(形成抑菌圈的最大稀釋比)xi000/10按這種方式進(jìn)行了抗菌譜分析的樣品具有蛋白酶耐性，表現(xiàn)出廣泛的抗菌譜。具伴實(shí)施方式現(xiàn)在結(jié)合以下實(shí)施例說明本發(fā)明。然而，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1預(yù)先培養(yǎng)來自典型培養(yǎng)物的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5890、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149、LactobacillussalivariusJCM1231，然后在MRS培養(yǎng)基(表l)中培養(yǎng)。菌株在37。C培養(yǎng)。在分別添加了表3所示的0U/ml(未添加)、200U/ml和400U/ml的UmamizymeG的MRS培養(yǎng)基上接種乳酸菌，培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)是這樣實(shí)施的在500毫升Sakaguchi燒瓶內(nèi)裝入100毫升MRS培養(yǎng)基，然后接種100ml每一種前培養(yǎng)液，在100次/分的振蕩下振蕩培養(yǎng)。接著，覆蓋混合了Lactobacillussakei菌株JCM1157作為指示菌株的LactobacilliAOAC培養(yǎng)基。將這些平皿培養(yǎng)24小時(shí)。從而，形成指示菌的抑制區(qū)(表10)。結(jié)果表明每個(gè)菌株都產(chǎn)生耐蛋白酶細(xì)菌素。表10.產(chǎn)生PRB菌株的抑制區(qū)直徑(毫米)<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Lactobacillussakeis加inJCMU57被用作指示菌株。表中的數(shù)值表示生長抑制區(qū)的直徑。實(shí)施例230。C下在MRS培養(yǎng)基上培紫Lactock)ccuslactisNCD0497(乳鏈菌肽A產(chǎn)生菌)和LactococcuslactisNCIMB702054(乳鏈菌肽Z產(chǎn)生菌)。與實(shí)施例1同樣的方法，用Lactobacillussakei菌株JCMl157作為指示菌株評價(jià)抗菌活性。另外，用1000IU/ml的乳鏈菌肽A溶液(ICNBiomedicalInc.(ICN生物醫(yī)學(xué)公司))代替使用乳鏈菌肽產(chǎn)生菌，在MRS瓊脂培養(yǎng)基平皿上點(diǎn)樣10pl，評價(jià)抗菌活性。在沒有蛋白酶的情況下，形成指示菌株的抑制區(qū)。在有蛋白酶存在的情況下，當(dāng)?shù)鞍酌笣舛容^高時(shí)(表ll)活性降低。表ll.不產(chǎn)生PRB菌株的抑制區(qū)直徑(毫米)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>LactobacillussakeistrainJCMl157被用作指示菌株。表中的數(shù)值表示生長抑制區(qū)的直徑。ND=未檢出實(shí)施例3培養(yǎng)戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、LactococcuslactisNCD0497(乳鏈菌肽A產(chǎn)生菌)禾卩LactobacillussakeiJCM1157菌株。在10，000rpm下離心培養(yǎng)液10分鐘，來獲得培養(yǎng)物上清液。向上清液添加2000U/mlUmamizyme、用酶處理24小時(shí)后，用過濾器(DISMIC25CS,ADVANTEC;0.45pm)過濾上清液，配制無菌樣品。使用菌苔上點(diǎn)樣法(spot-on-lawn)考查抗菌譜。結(jié)果，與乳酸菌肽產(chǎn)生菌的培養(yǎng)液和不產(chǎn)生細(xì)菌素的LactobacillussakeiJCMl157的培養(yǎng)液相比，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885即使在經(jīng)過蛋白酶處理后仍然保持抗菌活性(表12)。這表明戊糖片球菌(PediococcuspentosaceusJCM5885)產(chǎn)生耐蛋白酶細(xì)菌素。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>培養(yǎng)液用蛋白酶處理后，用菌苔上點(diǎn)樣法評價(jià)上清液。數(shù)值表示抗菌活性。抗菌活性(AU/ml)=(形成抑菌圈的最大稀釋比)xlOOO/10,ND二未檢出實(shí)施例4按照實(shí)施例3所述的方法，用酶處理戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JCMl149、LactobacillussalivariusJCM1231、LeuconostoccitreumJCM9698、LeuconostocpseudomesenteroidesJCM9696、JCMl1045禾口LactococcuslactisNCIMB702054(乳鏈菌肽Z產(chǎn)生菌)菌株的培養(yǎng)物上清液?？莶輻U菌(Bacillussubtilis)IAM1381被用作指示菌株。使用與實(shí)施例3同樣的來源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的UmamizymeG作為酶。另夕卜，將來源于枯草桿菌(Bacillussubtilis)的a-淀粉酶(WakoPure化學(xué)藥品有限公司)以100U/ml的量添加至乳酸菌培養(yǎng)液中，在3(TC使其反應(yīng)一小時(shí)以上。然后，按同樣的方法以枯草桿菌(Bacillussubtilis)IAM1381作為指示菌株，采用菌苔上點(diǎn)樣法評價(jià)抗菌活性，研究a—淀粉酶對抗菌活性的影響。如表13所示，WeissellacibariaJCMl2495、WeissellaconfusaJCM1093、WeissellahellenicaJCM10103、WeissellakandleriJCM5817、WeissellaminorJCMl168、Weissellaparap^esenteroidesJCM9890、WeissellathailandensisJCMl0694、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5885、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JCMl149、LactobacillussalivariusJCM1231、LactobacilluspentosusJCM1558、LeuconostoccitreumJCM9698、LeuconostocpseudomesenteroidesJCM9696、JCMl1045、LeuconostocargentinumJCMl1052、LeuconostoccarnosumJCM9695、禾口LeuconostocmesenteroidesJCM6124即使經(jīng)過蛋白酶處理后仍然保持抗菌的活性。因此，發(fā)現(xiàn)這些菌株產(chǎn)生耐蛋白酶的細(xì)菌素。表」13.酶處理后的殘存抗菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例5分別將大豆(10g)和純水(10毫升)放進(jìn)六個(gè)錐形瓶(體積200ml)，在高壓鍋內(nèi)120°C下滅菌30分鐘。冷卻后，添加0.04g曲霉(kojimold)(醬油用紫色1NO.l菌)，3(TC下靜置培養(yǎng)2天。將40毫升無菌純水添加到培養(yǎng)樣品(樣品No.l)中，40毫升鹽水添加至SampleNo.2中調(diào)整樣品含鹽量至18%，40毫升LactococcuslactisNCIMB702054(乳鏈菌肽Z產(chǎn)生菌)培養(yǎng)物上清液添加至樣品No.3，40毫升PediococcuspentosaseceusJCM5885的培養(yǎng)物上清液添加至樣品5，40毫升Lact6bacillssalivariusJCM1231的培養(yǎng)物上清液添加至樣品6。用過濾器過濾過的6N鹽酸和6NNaOH調(diào)節(jié)產(chǎn)物混合物至pH6.5—7.0。200pl在TSBYE培養(yǎng)基內(nèi)3(TC下用振蕩器振蕩培養(yǎng)20小時(shí)的枯草桿菌IAM1381另外地接種、充分混合、30'C下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、2、7天，收集培養(yǎng)液在GAM瓊脂培養(yǎng)基(GAM肉湯"NISSUI"，Nissui藥物有限公司)上計(jì)算枯草桿菌IAM1381的活細(xì)胞數(shù)。在純水樣品中存在的污染菌枯草桿菌IAM1381為每克108細(xì)胞以上。在18%的含鹽樣品中沒有發(fā)生污染。同時(shí)，在加入不含鹽的乳鏈菌肽上清液的情況下，在第1天及以后乳鏈菌肽被來源于曲霉的蛋白酶分解。因此，產(chǎn)生每克108細(xì)胞以上的污染，沒有觀察到抗菌效果。然而，在使用PediococcuspentosaseceusJCM5885禾口LactobacillussalivariusJCM1231的上清液的情況下，從發(fā)酵的第1天ij第7天都沒有觀察到污染菌枯草桿菌IAM1381(表14)。表14.在醬油的生產(chǎn)工藝中使用細(xì)菌素代替鹽的測試<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>PRB:耐蛋白細(xì)菌素工業(yè)實(shí)用性通過在發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程中添加由例如戊糖片球菌、植物乳桿菌和Lactobacillussalivarius等產(chǎn)生的含耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物，可以提供良好的保存食品的方法。權(quán)利要求1.能產(chǎn)生耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌，包括選自于LactobacillusplantarumJCM1149，LactobacillussalivariusJCM1231和LactobacilluspentosusJCM1558中的至少一種。2.含有耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌培養(yǎng)物，是如權(quán)利要求1所述的乳酸菌的培養(yǎng)物。3.添加了如權(quán)利要求1所述的乳酸菌和/或如權(quán)利要求2所述的乳酸菌培養(yǎng)物的食品。4.如權(quán)利要求3所述的食品，其特征在于，所述食品為發(fā)酵食品或加工過的肉制品。5.—種保存食品的方法，其特征在于，在食品的生產(chǎn)過程中添加如權(quán)利要求l所述的乳酸菌和/或如權(quán)利要求2所述的乳酸菌培養(yǎng)物。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述食品為發(fā)酵食品或加工過的肉制品。專利摘要本發(fā)明涉及含耐蛋白酶細(xì)菌素的乳酸菌及其培養(yǎng)物，在食品中使用所述乳酸菌及其培養(yǎng)物可以改進(jìn)食品的耐存儲性。文檔編號A23B4/14GKCN101363007SQ200810149464公開日2009年2月11日申請日期2004年11月5日發(fā)明者上原章敬,取出恭彥申請人:味之素株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan