專利名稱:一種棘胸蛙微衛(wèi)星dna標記及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子標記技術，具體涉及一種棘胸蛙的DNA分子遺傳標記及其用途。
技術背景
微衛(wèi)星(又稱為簡單重復序列，SSR)是由1-6個核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復多次而組成的一段DNA。由于微衛(wèi)星側翼序列相對保守，根據(jù)其側翼序列設計引物，可用PCR 擴增出微衛(wèi)星位點的序列。由于微衛(wèi)星中重復單元的重復次數(shù)不同，因而擴增出的微衛(wèi)星序列的長度呈現(xiàn)多態(tài)性。微衛(wèi)星序列廣泛存在于真核生物基因組中，而且隨機分布，具有高度多態(tài)性，選擇上中性，共顯性等特點，是十分有效的遺傳標記，被廣泛應用于遺傳圖譜構建、基因定位、遺傳關系分析、品種鑒定等領域。如用微衛(wèi)星標記分析苧麻品種的親緣關系 (Zhou 等，2005，Progress in Natural Science，15 137-142)、用微衛(wèi)星 DNA 標記進行豬品種分類的專利申請“適于豬品種分類的豬微衛(wèi)星DNA標記”(公開號CN1370834A)、用微衛(wèi)星DNA標記進行家蠶分子連鎖遺傳分析的專利申請“家蠶的SSR標記及其應用”(公開號CN 1970792A)。
棘胸蛙(Paa spinosa David)，屬兩棲綱、無尾目、蛙科。棘胸蛙個體大，肉質細嫩潔白，味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，素有“百蛙之王”的美稱。由于人為捕殺和自然環(huán)境的惡化，野生棘胸蛙資源遭到嚴重破壞，開展棘胸蛙人工養(yǎng)殖既有助于保護野生資源，又能滿足市場需求?，F(xiàn)在，棘胸蛙是我國重要的養(yǎng)殖蛙類之一，但是由于其基礎研究薄弱，要實現(xiàn)規(guī)模養(yǎng)殖還有許多亟待解決的問題，其中包括需要一套有效的分子標記對其進行遺傳關系分析、種質資源調查、標記輔助育種等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記，利用這些分子標記能對棘胸蛙進行遺傳分析、種質資源調查和輔助育種。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記，該微衛(wèi)星DNA標記的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :8這8種序列中的任意一種；所述SEQID NO :1對應的微衛(wèi)星編號為I3SpiejEQ ID NO 2對應的微衛(wèi)星編號為I^sp 17，SEQ IDNO :3對應的微衛(wèi)星編號為Ι^ρ18，SEQ ID N0:4對應的微衛(wèi)星編號為Ι^ρ19，SEQ ID NO :5對應的微衛(wèi)星編號為Ι^ρ20，SEQ ID Ν0:6對應的微衛(wèi)星編號為Ι^ρ21，SEQ ID NO 7對應的微衛(wèi)星編號為Ι^ρ22，SEQ ID NO 8對應的微衛(wèi)星編號為Ι^ρ23。
作為本發(fā)明的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記的改進棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記引物選自下列引物對，其中的核苷酸序列為5' -3'，
Psp 16 正向GTATCATTTTGTGTTTTTT
反向:TTTGAATTGTCTTTTGTC
Pspl7 正向AGTTATGTGGCAGAGAAAC
反向AAGAGCACAGGAGAGTCA[0011]Pspl8 正向GCTTATTGTTGGGCTTCA
反向TCACTGGCATCAGGTCTG
Pspl9 正向TCACAATCGACGTAATGG
反向ACACACAGAGGGTCACACT
Psp20 正向TTGGCTCATCAACTACCC
反向AGTCACATAACATACCCCCT
Psp21 正向ACTCTCGCCTCAATCC
反向ATGTAGCTCAGCGTACTG
Psp22 正向ATCTTAGGTGCAGCAACTT
反向TCCCTTGTGTAGTGTTCAGT
Psp23 正向TCGACGATTGCCAGAGACC
反向GCTGGTGGGGAAACTACATTAT。
本發(fā)明還同時提供了該類棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記的用途用于對棘胸蛙進行遺傳 分析、種質資源調查或輔助育種。
實現(xiàn)上述發(fā)明的技術方案包括棘胸蛙(CA)n微衛(wèi)星富集文庫的構建、含微衛(wèi)星序 列的陽性克隆的篩選及測序，確定了 8個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記I^spie、I^pl7、I^splS、 Pspl9、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。
本發(fā)明旨在分離克隆微衛(wèi)星DNA標記，建立棘胸蛙的微衛(wèi)星DNA的技術體系井利 用這些分子標記進行遺傳分析、種質資源調查和輔助育種。因此，本發(fā)明提供了 8個棘胸蛙 微衛(wèi)星位點的DNA序列及擴增上述8個棘胸蛙微衛(wèi)星位點的引物序列和擴增方法，8個棘胸 蛙微衛(wèi)星位點用于棘胸蛙種質資源研究，遺傳關系分析，標記輔助選種和標記輔助育種，重 復性好，多態(tài)性高，是ー種可靠有效的分子標記。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進ー步詳細說明。
圖1是本發(fā)明涉及的13個棘胸蛙自然種群的structure聚類圖(K = 3)。
具體實施方式
實施例1、棘胸蛙(CA)n微衛(wèi)星富集文庫的構建
依次進行以下步驟
1)、用經(jīng)典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(廣西龍勝)基因組DNA。用限制性內(nèi) 切酶Sau3AI酶切棘胸蛙基因組DNA，酶切產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下 300-1000bp大小的DNA片段并用凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。
2)、將堿基互補的寡核苷酸Sau3AI Oligo A -GGCCAGAGACCCCMGCTTCG-3‘禾ロ Oligo B 5' -pGATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3‘(上海生工合成，HPLC 級純化，200pmol/ iil)各取10 iil輕輕蝸旋混勻，在PCR儀上80°C變性10分鐘，然后在室溫下使寡核普酸鏈 緩慢退火復性約1小吋，加入60 iU高純水制備成濃度為25pmol/ia帶有Sau3AI酶切識 別位點的接頭。
3)、將上述步驟1)所得的酶切產(chǎn)物和步驟2)所得的接頭用T4DNA連接酶連接，將所得的連接液用維特潔公司的清潔試劑盒純化，去除鹽離子、蛋白和多余的接頭片段，溶解于50 μ 1 TE緩沖液中；得連接產(chǎn)物。
4)、用生物素標記的寡核苷酸探針(CA)15與步驟幻所得的連接產(chǎn)物DNA片段雜交。具體操作為在總體積100 μ 1雜交液(6 X SSC, 0. 1% SDS)中加入500ng連接產(chǎn)物和 IOOpmol生物素標記的寡核苷酸探針，并在95°C下變性10min，60°C雜交1小時。
5)、在步驟 4)所得物中加入 100μ 1(10μ g/μ 1)磁珠(Dynabeads M180，購自 Dynal Biotech公司)，并在室溫放置30分鐘。
6)、在磁力架上吸附磁珠，棄上清。磁珠用400 μ 1洗滌緩沖液(6 X SSC, 0. 1 % SDS) 在60°C下洗滌15分鐘，然后在室溫下分別用2XSSC和IXSSC溶液洗滌兩次，并棄上清。
7)、在步驟6)所得物中加入50 μ 1無菌水，在90°C下保溫10分鐘，小心吸取上清， 上清液即為含有(CA)n重復序列的單鏈DNA片段。以Oligo A為引物，以單鏈DNA片段為模板進行PCR擴增獲得雙鏈目的片段。
25 μ IPCR 反應體系包含大約 IOOng 單鏈 DNA 片段，20mm Tris-HCI (pH8. 3)， IOOmmKCI, 3mm MgCl2, dNTP # 1000 ym,3pmol Oligo A, 0. 8units Taq polymerase (Shanghaipromega)。
PCR循環(huán)程序設置為95°C預變性3分鐘，接著5個循環(huán)包括95°C變性30s，60°C 退火30s，72°C延伸45s，然后進行另外30個循環(huán)的92°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 55s，最后于72°C下延伸10分鐘。檢測PCR產(chǎn)物并使用維特潔公司的純化試劑盒純化，產(chǎn)物溶解于30 μ 1 TE緩沖液中。
8)、將步驟7)所得的擴增產(chǎn)物純化后連接到PMD18-T載體上，然后將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌感受細胞，轉化菌液涂布在含有IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上進行藍白斑篩選。
實施例2、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序及微衛(wèi)星引物設計
依次進行以下步驟
1)、挑取實施例1所得的白色菌落并接種到:3ml LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)過夜，然后提取質粒。
2)、以質粒 DNA 為模板，采取三引物法(Gardner 等，1999，Journal of Heredity, 90,301-304)篩選含有(CA)n微衛(wèi)星序列的陽性克隆。
3)、將陽性克隆測序，分析是否含有(CA)n重復序列，以及是否有足夠的側翼序列用于引物設計。
4)、根據(jù)微衛(wèi)星重復序列兩側的保守序列，用primer premier5. 0軟件設計引物， 引物長度一般在16—22堿基之間，選擇擴增的目標片段在150-350bp之間。
實施例3、棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記穩(wěn)定性和多態(tài)性檢測
用上述實施例2所得的微衛(wèi)星標記擴增32個來自同一自然種群的棘胸蛙個體 (浙江)，確定了 8個多態(tài)性豐富，適于棘胸蛙遺傳多樣性檢測的微衛(wèi)星標記(表1)。具體操作過程如下
1)、用經(jīng)典的酚-氯仿法抽提32個棘胸蛙個體的DNA作為模板。
2)、設計的引物合成后對引物正確性和可行性進行實驗驗證，用溫度梯度PCR擴增多個模板。15 μ 1的PCR反應體系中含大約50ng基因組DNA，10mm Tris-HCI (pH8. 3), 50mm
5KCI, 1. 5mm MgCl2, dNTP # 500 μ m，lpmol弓|_，0. 5units Taq polymerase (Shanghai
promega)。根據(jù)實驗結果確定哪些引物能夠擴增出穩(wěn)定的目的條帶，以及確定最佳退火溫度(見表一)。最終篩選出8個位點，分別命名為Ι^ρ16、Ι^ρ17、Ι^ρ18、Ι^ρ19、Ι^ρ20、 Psp21、Psp22、Psp23。
3)、分別用上述8個位點的8對引物(引物序列見表1)擴增這若干個棘胸蛙個體的DNA。其中任意一條SSR引物的5’端被加上一段沒有遠紅外熒光標記的M13序列，而另一條IRDye標記的M13引物同時包含在這個反應體系中。按上述步驟2)的反應條件進行 PCR擴增。PCR產(chǎn)物在LI-C0R4300S遺傳自動分析儀上進行基因分型，配合使用內(nèi)置STR分子量標準(STR Marker，LI-COR Bioseienee)和軟件SAGAgt自動判讀條帶，輔以人工校正。
4)、使用軟件CERVUS 2. 0統(tǒng)計等位基因數(shù)目，多態(tài)信息含量(PIC)，觀測雜合度 (Observed heterozygosities, Ho)禾口期望雜合度(Expected heterozygosities, He)。哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)偏離測試和位點間的連鎖不平衡檢驗(Linkagedisequilibrium, LD)使用 GENEP0P 軟件 version3. 4 完成，之后輔以連續(xù)的 Bonefermni校正。使用MICR0-CHEKER軟件估算每個位點的無效等位基因情況。
最終確定了以下8個棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記，分別是
編號為Pspl6的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
編號為Psp 17的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
編號為Pspl8的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
編號為Pspl9的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
編號為Psp20的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
編號為Psp21的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
編號為Psp22的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
編號為Psp23的微衛(wèi)星DNA標記，其核苷酸序列如SEQ
表1、引物特性表引物序列，退火溫度，片段大小
權利要求
1.一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記，其特征是該微衛(wèi)星DNA標記的核苷酸序列為SEQ IDNO :1，該微衛(wèi)星編號為Ι^ρ16。
2.根據(jù)權利要求
1所述的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記，其特征是所述棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記引物為下列引物對，其中的核苷酸序列為5' -3'，Pspl6 正向:GTATCATTTTGTGTTTTTT 反向:TTTGAATTGTCTTTTGTCo
3.根據(jù)權利要求
1或2所述的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記的用途，其特征是用于對棘胸蛙進行遺傳分析、種質資源調查或輔助育種。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記，該微衛(wèi)星DNA標記的核苷酸序列分別為SEQ ID NO1～SEQ ID NO8這8種序列中的任意一種。本發(fā)明還同時提供了該棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標記的用途用于對棘胸蛙進行遺傳分析、種質資源調查和輔助育種。
文檔編號C12N15/11GKCN101392253 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200810121952
公開日2012年5月9日 申請日期2008年10月23日
發(fā)明者葉容暉, 成斌, 楊光, 鄭榮泉 申請人:浙江師范大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan