一種圓口銅魚微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及8個圓口銅魚微衛(wèi)星標(biāo)記，其 擴增引物對及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微衛(wèi)星DNA，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單序列重復(fù)。它是以1-6個堿基的短核苷 酸為基本單位首尾相連組成串聯(lián)重復(fù)序列，由于重復(fù)次數(shù)不同以及重復(fù)程度的不完全造成 了每個位點的長度多態(tài)性。由于每個微衛(wèi)星兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，可根 據(jù)其兩端設(shè)計一對特異性引物，通過PCR技術(shù)來擴增相應(yīng)位點的微衛(wèi)星序列，再經(jīng)電泳分 析，即可顯示不同基因型個體微衛(wèi)星的多態(tài)性。微衛(wèi)星由于分布廣泛，密度大，多態(tài)性豐富， 遵循孟德爾分離定律，共顯性遺傳、易于PCR擴增，所需DNA數(shù)量極少，對DNA質(zhì)量要求不 高，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點，目前已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜構(gòu)建、 功能基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。
[0003] 圓 口銅魚（Coreiusguichenoti)，隸屬趣形目Cypriniformes，鉤亞科 Gobioninae，銅魚屬Coreius，是一種主要分布于長江上游、金沙江中下游及其部分支流如 雅礱江下游的特有魚類。圓口銅魚屬于典型的河道洄游性魚類，成熟親魚向上溯游到金沙 江中下游產(chǎn)卵，受精卵和初孵仔魚在天然河道漂流才能完成孵化過程并具有主動游泳能 力，整個生活史均需在河道中完成。圓口銅魚成魚只生活在干流的急流河灘和較流動的洄 水沱中，不進入水流緩慢的小支流，而性成熟個體只在金沙江中下游以及雅礱江干流等部 分江段發(fā)現(xiàn)，該江段也是圓口銅魚產(chǎn)卵場的分布區(qū)域。隨著長江上游干支流梯級電站建設(shè) 的逐步實施，圓口銅魚棲息地面積日益縮小，生境相互隔離。已建成的葛洲壩工程阻隔了長 江中游圓口銅魚對金沙江繁殖群體的補充通道，同時蓄水運行的三峽工程也對順流而下的 圓口銅魚幼魚產(chǎn)生一定的阻隔作用，再加上過度捕撈、環(huán)境污染等原因，圓口銅魚資源嚴(yán)重 下降，在1997-2000年的調(diào)查中，圓口銅魚和銅魚在巴南與萬州江段的漁獲物總重中分別 47%和17%，在2005-2006年的調(diào)查中，已下降到36%和8%，因此，對圓口銅魚的研究和保 護工作迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供圓口銅魚微衛(wèi)星標(biāo)記及其擴增引物，即提供8個圓口銅魚的 微衛(wèi)星標(biāo)記，以及相應(yīng)的擴增引物對，為圓口銅魚的種群遺傳學(xué)、家系鑒定及分子標(biāo)記輔助 育種技術(shù)提供有效的工具。
[0005] 本發(fā)明一個方面提供8個微衛(wèi)星標(biāo)記，其核苷酸序列分別如SEQIDN0 :1-8之一 所示，或為上述核苷酸序列的互補序列。
[0006] 本發(fā)明還提供分別用于擴增上述8個微衛(wèi)星標(biāo)記的引物對。優(yōu)選地，所述引物對 設(shè)計參數(shù)為：引物長度17_25bp，PCR產(chǎn)物片段長度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65°C， 6(：含量在40%-60%之間。優(yōu)選地，上下游序列分別為3￡01〇勵：9化61]0064)、3￡0 IDN0:10(CGU006-R)的引物對，用于擴增核苷酸序列如SEQIDN0:1所示的微衛(wèi)星標(biāo)記 (CGU006);上下游序列分別為SEQIDN0:11(CGU060-F)、SEQIDN0:12(CGU060-R)的引 物對，用于擴增核苷酸序列為SEQIDNO:2(CGU060)的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為 SEQIDN0:13(CGU068-F)、SEQIDN0:14(CGU068-R)的引物對，用于擴增核苷酸序列為 SEQIDN0:3(CGU068)的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQIDN0:15(CGU070-F)、SEQ IDN0:16(CGU070-R)的引物對，用于擴增核苷酸序列為SEQIDN0:4(CGU070)的微衛(wèi)星 標(biāo)記；上下游序列分別為SEQIDN0:17(CGU075-F)、SEQIDN0:18(CGU075-R)的引物對， 用于擴增核苷酸序列為SEQIDNO:5(CGU075)的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQID N0:19(CGU076-F)、SEQIDN0:20(CGU076-R)的引物對，用于擴增核苷酸序列為SEQID N0:6(CGU076)的微衛(wèi)星標(biāo)記；上下游序列分別為SEQIDN0:21(CGU079-F)、SEQIDNO: 22(CGU079-R)的引物對，用于擴增核苷酸序列為SEQIDN0:7(CGU079)的微衛(wèi)星標(biāo)記；上 下游序列分別為SEQIDN0:23(CGU104-F)、SEQIDN0:24(CGU104-R)的引物對，用于擴增 核苷酸序列為SEQIDN0:8(CGU104)的微衛(wèi)星標(biāo)記。
[0007] 另一方面，本發(fā)明涉及所述微衛(wèi)星標(biāo)記或擴增所述微衛(wèi)星標(biāo)記的引物對在檢測圓 口銅魚種群遺傳多樣性中的應(yīng)用。
[0008] 另一方面，本發(fā)明涉及所述微衛(wèi)星標(biāo)記或擴增所述微衛(wèi)星標(biāo)記的引物對在分析圓 口銅魚親緣關(guān)系中的應(yīng)用。
[0009] 另一方面，本發(fā)明涉及所述微衛(wèi)星標(biāo)記或擴增所述微衛(wèi)星標(biāo)記的引物對在圓口銅 魚輔助育種中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了檢測圓口銅魚種群遺傳多樣性的方法，包括如下步驟：
[0011] (1)提取圓口銅魚基因組DNA;
[0012] (2)微衛(wèi)星PCR擴增：利用經(jīng)熒光標(biāo)記的用于擴增本發(fā)明的微衛(wèi)星標(biāo)記的引物對， 以圓口銅魚基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物；
[0013] (3)測序儀檢測擴增產(chǎn)物：將擴增產(chǎn)物避光保存，用ABI3730XL測序儀進行毛細 管電泳和STR分析；
[0014] (4)遺傳多樣性分析：根據(jù)每個圓口銅魚個體微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的分子量大小確定 基因型，采用GENEP0P4. 0. 10計算遺傳多樣性參數(shù)。
[0015] 優(yōu)選地，步驟（1)采用酚-氯仿法提取圓口銅魚鰭條組織的基因組DNA;
[0016] 優(yōu)選地，步驟（2)中所述熒光標(biāo)記為FAM標(biāo)記。
[0017] 本發(fā)明從圓口銅魚基因組DNA中篩選8個微衛(wèi)星標(biāo)記，根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端 的側(cè)翼區(qū)設(shè)計特異性引物并進行擴增，獲得的擴增產(chǎn)物具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用 于圓口銅魚的群體遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0018] 下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不 背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0019] 對于實施例中未注明具體條件的實施方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克 (Sambrook)等編寫的《分子克隆實施指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運 行。
[0020] 1、含有微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列的查找
[0021] 從構(gòu)建的圓口銅魚基因文庫的序列中用軟件SSRHunterl. 3進行微衛(wèi)星重復(fù)單元 序列的查找；參數(shù)設(shè)置為查找