鹽地堿蓬耐低磷基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，更加具體地說(shuō)，涉及一種鹽地堿蓬耐低 磷基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷是生物生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)元素之一，是蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及各種重要的小 分子的重要組成成分，在植物新陳代謝過(guò)程中扮演著十分重要的角色。然而，磷是一種不可 再生的資源，大部分土壤有效磷含量較低，難以滿足植物生長(zhǎng)的正常需求。據(jù)報(bào)道，世界上 至少有30%~40%的作物產(chǎn)量受到低磷脅迫的嚴(yán)重抑制（Runge-MetzgerA.)。農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 上，主要通過(guò)施用磷肥來(lái)解決土壤磷缺乏問(wèn)題，但是使用的磷肥很容易被土壤固定為作物 不易吸收的難溶性磷，難以完全滿足作物對(duì)磷的需求。因此，提高植物對(duì)磷的吸收和利用 率，創(chuàng)制耐低磷作物品種，對(duì)于減少農(nóng)業(yè)磷的施用量，維護(hù)生態(tài)安全，提高作物的產(chǎn)量等方 面具有重要意義。隨著對(duì)植物低磷脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理研究不斷深入，特別是以擬南芥為 研究對(duì)象，植物在低磷脅迫條件下的研究取得了突破性的進(jìn)展。目前，對(duì)耐低磷基因的分離 是當(dāng)前利用基因工程方法進(jìn)行耐低磷作物培育的首要任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鹽地堿蓬耐低磷基因。
[0004] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含鹽地堿蓬耐低磷基因的重組載體。
[0005] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含上述重組載體的宿主細(xì)胞。
[0006] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鹽地堿蓬耐低磷基因的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0008] 一種鹽地堿蓬耐低磷基因，是序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0009] 含上述一種鹽地堿蓬耐低磷基因的重組載體。
[0010] 含有上述重組載體的宿主細(xì)胞。
[0011] 一種鹽地堿蓬耐低磷基因在改良植物耐低磷的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的鹽地堿蓬耐低磷基因，從鹽地堿蓬中獲取并具有序列表中SEQIDNO. 1 所示的核苷酸序列，并能夠獲得含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞，采用該基因轉(zhuǎn)染的擬 南芥表現(xiàn)出對(duì)低磷脅迫的耐受力，說(shuō)明本發(fā)明提供的耐低磷基因能在改良作物耐低磷能力 中應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是本發(fā)明的鹽地堿蓬耐低磷PHT基因克隆電泳示意圖。
[0014] 圖2是包含本發(fā)明的鹽地堿蓬耐低磷的基因S.saPHT的表達(dá)載體示意圖。
[0015] 圖3是S.saPHT轉(zhuǎn)基因擬南芥genomicDNAPCR篩選結(jié)果。
[0016] 圖4是S.saPHT轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合體半定量PCR結(jié)果。
[0017] 圖5是S.saPHT轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合體耐低磷根系實(shí)驗(yàn)效果。
[0018] 圖6是S.saPHT轉(zhuǎn)基因擬南芥耐低磷實(shí)驗(yàn)根系生長(zhǎng)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊(cè)中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 一種鹽地堿蓬耐低磷基因的獲得
[0023] 使用的植物堿蓬（鹽地堿蓬）來(lái)源為天津市濱海新區(qū)北塘口東海路。
[0024] 首先，以此為原料獲取本發(fā)明的耐低磷基因（即鹽地堿蓬PHT基因的克?。?。
[0025] 取五周新鮮鹽地堿蓬植株，使用植物RNeasyPlantMiniKit(Transgene Code#EP101_01 50rxns)提取totalRNA，并且利用EasyScriptFirst-StrandcDNASynS. saesisSuperMix(TransgeneCode#AE301_03lOOrxns)去除基因組DNA干擾，反轉(zhuǎn)錄出 cDNA〇
[0026] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的ArabidopsisthalianaPHT1 :n基因的序列保守區(qū) 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PHT-5(SEQIDN0.2 所示，5' -GGGTTCTTTACGGATGCCTACGAT-3'）和 PHT-3(SEQIDNO. 3 所示，5' -TCACCGAGCCATCCGAAGAAG-3'），然后利用RACE-PCR技術(shù) (IntrQgen，F(xiàn)irstChoiceRLM-RACEKitwithManual)獲得鹽地喊蓬PHT基因全長(zhǎng)cDNA序 列即PHT基因，將PHT基因進(jìn)行測(cè)序分析，得到完整S.saPHT基因全長(zhǎng)為1578bp，如序列表 中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，即本發(fā)明的鹽地堿蓬耐低磷基因，見(jiàn)圖1。
[0027] 根據(jù)鹽地堿蓬耐低磷基因核苷酸序列設(shè)計(jì)上下游引物PHT_F(SEQ IDN0.4 所示，5'-TCGACGACTTCCTATCTATGGC-3'）和PHT-R(SEQIDN0.5 所 示，5' -GCCAAAACAATCCTTTCCAGT-3'），利用EasyScriptFirst-StrandcDNASynS.saesis SuperMix(TransgeneCode#AE301_03100rxns)去除基因組DNA干擾，反轉(zhuǎn)錄出鹽地堿蓬 cDNA，反應(yīng)PCR程序：42°C30min，85°C5min;4°C，①。
[0028] 利用RACE-PCR技術(shù)的具體步驟，如下：
[0029] (1)cDNA第一鏈的合成，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver. 3. 0,以鹽 地堿蓬總RNA為模板，01igo(dT)為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn) 錄體系如下表所示。反應(yīng)條件：30°C10min，42°C30min，99°C5min和5°C5min。
[0030]
[0031] (2)鹽地堿蓬耐低磷基因反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量PCR擴(kuò)增檢測(cè)，用鹽地堿蓬A(yù)ctin基因特異引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及RNA質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系如下表所示。PCR反應(yīng)條件： 95°C，5min;95°C30s，55°C30s，72°C50s，35cycles;72。(：，lOmin;4。(：，①。引物S.saACT-F 如序列表中SEQIDNo. 6 所示，5' -GTGGTCGTACAACGGTAITGTG-3'，引物S.saACT-R如序列 表中SEQIDNo. 7 所示，5' -GACCTCCAATCCAGACACTG-3'。
[0032]
[0033] (3)鹽地堿蓬耐低磷基因片段的PCR擴(kuò)增，以cDNA為模板，以SEQIDNo. 2、SEQ IDNo.3所示核苷酸為上下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下表所示。PCR反應(yīng)條件： 94°C3min;94°C30s, 55°C30s，72°C60s，35cycles;72°C5min;4。(：，①。PCR結(jié)束后，取5y1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳。
[0034]
[0035]
[0036] 對(duì)通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的鹽地堿蓬耐低磷基因進(jìn)行測(cè)序分析，得到完整的鹽 地堿蓬PHT基因全長(zhǎng)為1578bp(SEQIDNo. 1)。
[0037] (4)構(gòu)建超表達(dá)載體時(shí)，在SEQIDNo. 4的5'端添加Gateway系統(tǒng)重組位點(diǎn)SEQ IDNo. 8:5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' ；在SEQIDNo. 5 的 5' 端添加Gateway 系統(tǒng)重組位點(diǎn)SEQIDNo. 9:5' -GGGGACCACTITGTACAAGAAAGCTGGGT-3' 分別得到：
[0038]SEQIDNo.10:5'-