能夠鑒定蘇御糯的issr-scar標(biāo)記及其篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于本發(fā)明屬于分子標(biāo)記鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種鑒定太湖名貴糯稻一一 蘇御懦的特異性分子標(biāo)記及方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 稻（Oryza sativa L.)屬禾本科（Gramineae)稻屬（Oryza)，為一年生水生草本， 是亞熱帶地區(qū)廣泛種植的重要谷物?！吨袊?guó)植物志》將其分為2個(gè)亞種，分別為秈稻（Oryza sativa L. subsp. indica Kato)和梗稻（Oryza sativa L. subsp. japonica Kato)〇我 國(guó)是亞洲栽培稻起源地之一，稻作歷史悠久，稻種類型繁多，其數(shù)量之多列世界之最。據(jù)統(tǒng) 計(jì)，截止2003年，我國(guó)共編目稻種資源已達(dá)77541份。由于水稻資源數(shù)量眾多，水稻品種鑒 別一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和作物育種等環(huán)節(jié)面臨的重要難題。
[0004] 以往對(duì)水稻品種的鑒別，主要包括形態(tài)鑒定法、物理鑒定法和生物化學(xué)鑒定法等。 但這些鑒定方法往往容易受到發(fā)育時(shí)期、環(huán)境條件等因素干擾，因此尋求一種快速、穩(wěn)定、 準(zhǔn)確的水稻品種鑒定方法極其重要。由于DNA水平上的分子標(biāo)記能從本質(zhì)上反應(yīng)個(gè)體差 異，具有個(gè)體特異性，并且不受內(nèi)外環(huán)境的影響，不存在組織、生長(zhǎng)階段或季節(jié)性的差異，近 年來(lái)在水稻品種的鑒定方面得到應(yīng)用。但目前報(bào)道的通過(guò)DNA分子標(biāo)記對(duì)水稻品種的鑒別 大多通過(guò)構(gòu)建DNA指紋圖譜對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，該方法操作繁瑣、重復(fù)性差，并且不是可直接應(yīng) 用的專一性、特異性分子標(biāo)記，因此不適合用于穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確的品種鑒別體系的開(kāi)發(fā)。
[0005] 蘇御糯是太湖地區(qū)栽培歷史悠久的名貴農(nóng)家品種，在歷史上曾作為貢品敬獻(xiàn)給歷 代帝王享用，在國(guó)內(nèi)享有盛名。該品種具有粒大飽滿，色澤白凈，糯性適中，甘口軟濃郁等特 點(diǎn)，素有"一家煮食滿村香"的美譽(yù)。在1984年江蘇省第一屆優(yōu)質(zhì)稻米品嘗鑒定會(huì)上，經(jīng)專 家們?cè)u(píng)定，其外觀品質(zhì)和蒸煮品質(zhì)綜合評(píng)分在特色稻米類型中居首位。但蘇御糯從形態(tài)上 與其他水稻品種仍然較難區(qū)分，因此開(kāi)發(fā)鑒定蘇御糯的專一性、特異性鑒別的分子標(biāo)記具 有重要的科學(xué)意義。
[0006] 本發(fā)明是首次對(duì)太湖名貴糯稻品種一一蘇御糯進(jìn)行特異性鑒別分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)， 本發(fā)明提供的鑒定蘇御糯的特異性標(biāo)記方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能 夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)太湖蘇御糯品種的特異性鑒定，對(duì)于我國(guó)水稻的品種鑒別和種質(zhì)資源保護(hù)均具有 十分重要的意義。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒定太湖名貴糯稻一一蘇御糯的特異性分子標(biāo)記，通過(guò) 篩選能夠在蘇御糯中擴(kuò)增出特異性條帶的ISSR引物，并針對(duì)特異性條帶設(shè)計(jì)序列特異性 引物，最終將蘇御糯和其它水稻品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)太湖蘇御糯的特異性鑒定，為水稻的 品種鑒別和種質(zhì)資源保護(hù)提供有力的技術(shù)支持。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 能夠在蘇御糯中擴(kuò)增得到的特異性片段，該片段的核苷酸序列如SEQIDN0: 2所述。
[0010] 一組能夠鑒別蘇御糯的SCAR引物，該引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNO: 3和SEQ IDNO: 4 所述。
[0011] -種鑒別蘇御糯的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，所述的方法包括如下步驟： (1) 采用32條ISSR引物對(duì)12個(gè)水稻品種進(jìn)行擴(kuò)增，得到1條蘇御糯特異性片段； (2) 將步驟（1)中的特異性片段進(jìn)行切膠回收并測(cè)序； (3) 針對(duì)步驟（2)中的序列設(shè)計(jì)序列特異性引物； (4) 用步驟（3)中的引物在所有水稻品種中進(jìn)行單株驗(yàn)證； (5) 用步驟（3)中的引物在蘇御糯和4個(gè)秈稻中進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序； (6) 針對(duì)步驟（5)中的序列設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性引物； (7 )用步驟（6 )中的引物在所有水稻品種中進(jìn)行單株驗(yàn)證，得到僅在蘇御糯中能擴(kuò)增出 特異性條帶的引物。
[0012] 優(yōu)選的，所述的一種鑒別蘇御糯的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，步驟（1)和步驟 (5)中的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20ML，其組分及終濃度為：DNA模板（20ng/ML) 1. 0ML， 2XReactionMix(含 20mMTris-HCl，100mMKC1，3mMMgCl2,400 剛的dNTPs，溴酚藍(lán)） 10.0ML，引物（10mM)1.5ML，TaqDNA聚合酶（2.5U/W)0.4ML，雙蒸水補(bǔ)齊至 20ML; 94°C，5min預(yù)變性；94°C變性lmin，53°C退火1min，72°C延伸1. 5min，40個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸10min;PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，溴化乙錠（EB)染色，電壓80V，電泳 1. 5h后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，以DL2000作為DNAmarker。
[0013] 優(yōu)選的，所述的一種鑒別蘇御糯的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，步驟（1)中能在蘇 御糯中擴(kuò)增出特異性條帶的引物序列如SEQIDN0: 1所述；步驟（2 )中蘇御糯中特異性片 段的序列如SEQIDN0: 2所述；步驟（3)中特異性引物的序列如SEQIDN0: 3和SEQID NO: 4所述。
[0014] 優(yōu)選的所述的一種鑒別蘇御糯的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，步驟（4)中PCR驗(yàn) 證體系為20yL，其組分及終濃度為：DNA模板（20ng/>l)L0ML，2XReactionMix(含 20mMTris-HCl，100mMKC1，3mMMgCl2,400 剛的dNTPs，溴酚藍(lán)）10.0ML，引物（10mM) 各1.0ML，TaqDNA聚合酶（2. 5U/ML) 0.4ML，最后用雙蒸水補(bǔ)齊至20ML;擴(kuò)增程序?yàn)椋?94°C，5min預(yù)變性；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72°C 延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB)染色，電壓80V，電泳0.5 h后用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，以DL2000作為DNAmarker。
[0015] 優(yōu)選的，所述的一種鑒別蘇御糯的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，所述蘇御糯和其 它 4 個(gè)秈稻品種的序列分別如SEQIDNO: 5、SEQIDNO: 6、SEQIDNO: 7、SEQIDN0: 8 和SEQIDNO: 9 所述。
[0016] 優(yōu)選的，所述的一種鑒別蘇御糯的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，步驟（6)中設(shè)計(jì)的 位點(diǎn)特異性引物序列如SEQIDN0: 10和SEQIDN0: 11所述。
[0017] 優(yōu)選的，所述的一種鑒別蘇御糯的特異性分子標(biāo)記的篩選方法，步驟（7)中PCR驗(yàn) 證體系同步驟（1)相同，不同在于退火溫度為60°C。
[0018] 有益效果：本發(fā)明提供了一種可以快速、準(zhǔn)確地鑒定蘇御糯的特異性分子標(biāo)記及 方法，對(duì)于開(kāi)發(fā)水稻特異性品種鑒別體系及水稻種質(zhì)資源保護(hù)具有重要的意義。
[0019]
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是蘇御糯和11個(gè)其它水稻品種的ISSR引物（SEQIDNO. 1)擴(kuò)增圖譜。
[0021] 泳道1-12從左至右依次為：太湖糯、浙糯5號(hào)、紹糯9714、鎮(zhèn)糯19號(hào)、金陵香糯、鎮(zhèn) 稻2號(hào)、廣陵香糯、鴨血糯、桂朝糯、揚(yáng)輻糯4號(hào)、揚(yáng)秈糯32-2、蘇御糯，泳道M為DNAMarker。
[0022] 圖2是蘇御糯和其它水稻品種各10個(gè)單株的ISSR-SCAR(SEQ ID N0. 3和SEQ ID NO. 4)檢測(cè)圖譜。
[0023] A:太湖糯；B:浙糯5號(hào)；C:紹糯9714;D:鎮(zhèn)糯19號(hào)；E:金陵香糯；F:鎮(zhèn)稻2號(hào)； G:廣陵香糯；H:鴨血糯；I:桂朝糯；J:揚(yáng)輻糯4號(hào)；K:揚(yáng)秈糯32-2;L:蘇御糯；M表示DNA marker; 1-10為該品種的10個(gè)個(gè)體。
[0024] 圖3是蘇御糯和其它水稻品種各10個(gè)單株的位點(diǎn)特異性引物（SEQIDN0. 10和 SEQIDNO. 11)檢測(cè)圖譜。
[0025] A:太湖糯；B:浙糯5號(hào)；C:紹糯9714;D:鎮(zhèn)糯19號(hào)；E:金陵香糯；F:鎮(zhèn)稻2號(hào)； G:廣陵香糯；H:鴨血糯；I:桂朝糯；J:揚(yáng)輻糯4號(hào)；K:揚(yáng)秈糯32-2;L:蘇御糯；M表示DNA marker; 1-10為該品種的10個(gè)個(gè)體。
[0026]
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。引物均由南京銳真生物技 術(shù)有限公司合成；DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金公司，Taq酶和DL2000 DNA marker購(gòu)自 廣州東勝生物科技有限公司，PMD19-T Vector和大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞為Takara公司 產(chǎn)品；Tissue Lyser LT組織破碎儀為德國(guó)QIAGEN產(chǎn)品；核酸蛋白檢測(cè)儀為美國(guó)eppendorf 產(chǎn)品；PCR儀為BioMetra T1型。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0028] 、植物基因組總DNA的提取 選擇蘇御糯及江浙地區(qū)通常栽培的11個(gè)水稻品種(表1)，每個(gè)品種隨機(jī)選取10個(gè)個(gè) 體，分別提取其基因組DNA。具體為：待植株苗高l(Tl5cm時(shí)剪取新鮮葉片100mg，經(jīng)Tissue LyserLT組織破碎儀將樣品進(jìn)