一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法，如下：將枯草芽孢桿菌種子液按照0.5-5％的接種量加入到含有體積百分?jǐn)?shù)70％培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，在34-37℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rpm，通氣量0.2-1vvm，pH＝6-9，發(fā)酵培養(yǎng)32-40小時；然后將發(fā)酵后的培養(yǎng)液在600nm的分光度計下測量值為8-9，鏡檢視野中90％以上呈現(xiàn)芽孢狀時，通過流加和導(dǎo)出裝置，每小時導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的3-5％，再補充相同量新的培養(yǎng)液，連續(xù)操作70-80小時；導(dǎo)出的發(fā)酵液即為枯草芽孢桿菌的液體菌懸液。本發(fā)酵過程中僅需要一次種子培養(yǎng)，減少了生產(chǎn)的工序，同等時間產(chǎn)出的發(fā)酵液多于單批次發(fā)酵，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人們對枯草芽孢桿菌生防潛能的研究已經(jīng)有很多年了，田間應(yīng)用研究已經(jīng)證實枯草芽孢桿菌菌劑在產(chǎn)品中的穩(wěn)定性枯草芽孢桿菌是生物防治中報道較多的一種拮抗細(xì)菌，在植物病害的生物防治中發(fā)揮尤為重要的作用。在土地中代謝產(chǎn)生光譜抗菌性物質(zhì)，形成優(yōu)勢菌群，有抗逆能力和抗菌防毒作用，目前有很多人已經(jīng)分離出很好的優(yōu)良菌株用于植物生長防病上?，F(xiàn)有的發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的工序的復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法。本發(fā)明在發(fā)酵過程中可以根據(jù)用量進(jìn)行連續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)菌種，不需要每個批次都進(jìn)行種子的培養(yǎng)，減少生產(chǎn)工序,降低生產(chǎn)成本。
[0004]本發(fā)明所采用的技術(shù)如下:一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法，本方法在無菌條件下進(jìn)行，方法如下:將枯草芽孢桿菌種子液按照0.5-5%的接種量加入到含有體積百分?jǐn)?shù)70%培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，在34-37°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rpm，通氣量0.2-lvvm, pH = 6-9,培養(yǎng)32-40小時；然后將發(fā)酵后的培養(yǎng)液在600nm的分光度計下測量值為8_9，鏡檢視野中90%以上呈現(xiàn)芽孢狀時，通過流加和導(dǎo)出裝置，每小時導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的3_5%，再補充相同量新的培養(yǎng)液，連續(xù)操作70-80小時；導(dǎo)出的發(fā)酵液即為枯草芽孢桿菌的液體菌懸液；
[0005]本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征:`[0006]1、所述的培養(yǎng)液按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)配比如下:玉米粉2-3 %，酵母粉0.2-0.4 %，蛋白胨 0.2-0.4%，硫酸銨 0.3-0.4%，磷酸二氫鉀 0.25-0.35%，磷酸氫二鉀 0.6-0.8%, pH =7.0-7.5。
[0007]2、所述的培養(yǎng)時間優(yōu)選為發(fā)酵36小時后開始進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[0008]本發(fā)明的有益效果為:發(fā)酵過程中僅需要一次種子培養(yǎng)，減少了生產(chǎn)的工序，同等時間產(chǎn)出的發(fā)酵液多于單批次發(fā)酵，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明所述的發(fā)酵形式可用于連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)和批次發(fā)酵培養(yǎng)，適用于帶有機(jī)械攪拌的液體發(fā)酵容器。
【具體實施方式】
[0009]以下實施例都在無菌條件下進(jìn)行:
[0010]實施例1
[0011]菌種:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ACCCl 1088 ；
[0012]菌種活化:將凍干管保存的菌種接種到牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基上，在氣浴要床上轉(zhuǎn)速150-200rpm，溫度28_32°C下培養(yǎng)20-24小時；取0.1ml溶液按照涂平板的方法均勻平鋪到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中在溫度28-32°C下培養(yǎng)20-24小時，作為一代菌種使用；在上述平板中挑取單菌落到LB斜面培養(yǎng)基中在溫度28-32°C下培養(yǎng)20-24小時，備用；
[0013]種子液的制備:取一接種環(huán)在LB培養(yǎng)基上活化好的菌種接種到裝液量為100mL種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28-32°C，搖床轉(zhuǎn)速150_200rpm下培養(yǎng)16-20小時，所得即為枯草芽孢桿菌液體種子液；
[0014]上述的種子液配方為，按質(zhì)量百分含量:玉米漿2-4%，蛋白胨0.5-1.5%，葡萄糖2-3%，磷酸二氫鉀 0.5-0.6%，磷酸氫二鉀 1-2%，ρΗ7.0-7.5 ；
[0015]實施例2
[0016](I)發(fā)酵方式:5L發(fā)酵罐，連續(xù)流加發(fā)酵；
[0017](2)發(fā)酵過程:將實施例1制得的種子液按照0.5%的接種量，接種到含有體積百分?jǐn)?shù)70%培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵控制溫度為34°C，pH = 6，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通氣量為lvvm，培養(yǎng)到40小時，檢測指標(biāo)數(shù)據(jù)在600nm的分光度計下測量值為8.17，鏡檢視野中90%以上呈現(xiàn)芽孢狀時，通過發(fā)酵罐的流加和導(dǎo)出裝置，每小時導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的3%先導(dǎo)出，后流加補足已滅好菌的新的培養(yǎng)液。此時需要開始需要每小時取樣，檢測在指標(biāo)范圍內(nèi)即可導(dǎo)出和流加發(fā)酵液，持續(xù)70小時；本發(fā)明產(chǎn)生的發(fā)酵液經(jīng)過菌和液分離，減壓低溫烘干菌粉。
[0018]所述的培養(yǎng)液按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)配比如下:玉米粉3%，酵母粉0.3%，蛋白胨0.4%，硫酸銨0.3，磷酸二氫鉀，0.3%，磷酸氫二鉀0.6%，pH = 7.0-7.5 ；
[0019](3)發(fā)酵結(jié)果:最終發(fā)酵液在600nm的分光度計下測量值為8.17，鏡檢結(jié)果超過90%呈現(xiàn)芽孢狀，在制作成菌劑測得菌數(shù)102億CFU/克，最終產(chǎn)生發(fā)酵液的數(shù)量為13.58升，比較等同時間單批次發(fā)酵約為10.5升有很大的提高。證明此方法可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
[0020]所述的培養(yǎng)液按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)配比如下:玉米粉3%，酵母粉0.3%，蛋白胨0.4%，硫酸銨0.3，磷酸二氫鉀，0.3%，磷酸氫二鉀0.6%，pH = 7.0-7.5。
[0021]實施例2
[0022](I)發(fā)酵方式:500L發(fā)酵罐，連續(xù)流加發(fā)酵；
[0023](2)將將實施例1制得的種子液按照5%的接種量，接種到含有體積百分?jǐn)?shù)70%培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵控制溫度為35°C，pH = 7.5,0.5vvm的通氣量，罐壓0.02Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)到36小時，檢測指標(biāo)數(shù)據(jù)在600nm的分光度計下測量值為8_9，鏡檢視野中90 %以上呈現(xiàn)芽孢狀時，每小時導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的4 %，后流加補足已滅好菌的新的培養(yǎng)液。此時需要開始需要每小時取樣，檢測在指標(biāo)范圍內(nèi)即可導(dǎo)出和流加發(fā)酵液，持續(xù)72小時；本發(fā)明產(chǎn)生的發(fā)酵液經(jīng)過菌和液分離，減壓低溫烘干菌粉。
[0024]所述的培養(yǎng)液按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)配比如下:玉米粉3%，酵母粉0.3%，蛋白胨0.4%，硫酸銨0.3，磷酸二氫鉀，0.3%，磷酸氫二鉀0.6%，pH = 7.0-7.5 ；
[0025](3)發(fā)酵結(jié)果:最終發(fā)酵液在600nm的分光度計下測量值為8.72，鏡檢結(jié)果超過90%呈現(xiàn)芽孢狀，在制作成菌劑測得菌數(shù)121億CFU/克，最終產(chǎn)生發(fā)酵液的數(shù)量為1462升，比較等同時間單批次發(fā)酵約為1050升有很大的提高。證明此方法可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
[0026]實施例3
[0027](I)發(fā)酵方式:5L發(fā)酵罐，連續(xù)流加發(fā)酵；[0028](2)發(fā)酵過程:將實施例1制得的種子液按照0.5%的接種量，接種到含有體積百分?jǐn)?shù)70%培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵控制溫度為37°C，pH = 9，攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，通氣量為0.2vvm保微罐壓情況下培養(yǎng)到36小時，檢測指標(biāo)數(shù)據(jù)在600nm的分光度計下測量值為8-9，鏡檢視野中90%以上呈現(xiàn)芽孢狀時，通過發(fā)酵罐的流加和導(dǎo)出裝置，每小時導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的5%，再補充相同量新的培養(yǎng)液，連續(xù)操作。此時需要開始需要每小時取樣，檢測在指標(biāo)范圍內(nèi)即可導(dǎo)出和流加發(fā)酵液，持續(xù)80小時，本發(fā)明產(chǎn)生的發(fā)酵液經(jīng)過菌和液分離，減壓低溫烘干菌粉。
[0029](4)發(fā)酵結(jié)果:此過程菌種生長達(dá)到的要求時間較長約6-7小時可連續(xù)一次，最終發(fā)酵液在600nm的分光度計下測量值為8.05，鏡檢結(jié)果超過90%呈現(xiàn)芽孢狀，在制作成菌劑測得菌數(shù)109億CFU/克，最終產(chǎn)生發(fā)酵液的數(shù)量為11.98升，比較等同時間單批次發(fā)酵約為10.5升有所的提高。證明此方法可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
[0030]實施例4
[0031](I)產(chǎn)物:連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生的菌體經(jīng)過菌液分離，減壓低溫烘干，形成的枯草芽孢桿菌粉。
[0032](2)與味精下腳料粉末，1,3-丙二醇發(fā)酵廢渣，干雞糞，磷酸二銨，解磷草酸青霉菌孢子粉、哈茨 木霉、膠凍樣芽胞桿菌混合造粒形成生物復(fù)合肥。
[0033](3)實驗結(jié)果:形成的復(fù)合肥在黑龍江省富錦縣水稻專用上與常規(guī)施肥相比增幅達(dá)到27%。形成的復(fù)合肥黑龍江省寶清縣玉米專用上與常規(guī)施肥相比增幅達(dá)到11%。形成的復(fù)合肥黑龍江省嫩江縣大豆專用上與常規(guī)施肥相比增幅達(dá)到11.33%。事實證明連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生的枯草芽孢桿菌可用農(nóng)業(yè)作物中。
【權(quán)利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法，本方法在無菌條件下進(jìn)行，其特征在于，方法如下:將枯草芽孢桿菌種子液按照0.5-5%的接種量加入到含有體積百分?jǐn)?shù)70%培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，在34-37°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rpm，通氣量0.2_lvvm，pH = 6-9，發(fā)酵培養(yǎng)32-40小時；然后將發(fā)酵后的培養(yǎng)液在600nm的分光度計下測量值為8-9，鏡檢視野中90%以上呈現(xiàn)芽孢狀時，通過流加和導(dǎo)出裝置，每小時導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的3-5%，再補充相同量新的培養(yǎng)液，連續(xù)操作70-80小時；導(dǎo)出的發(fā)酵液即為枯草芽孢桿菌的液體菌懸液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法，其特征在于:所述的培養(yǎng)液按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)配比如下:玉米粉2-3 %，酵母粉0.2-0.4 %，蛋白胨0.2-0.4 %，硫酸銨0.3-0.4%，磷酸二氫鉀 0.25-0.35%，磷酸氫二鉀 0.6-0.8%, pH = 7.0-7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法，其特征在于:所述的培養(yǎng)時間優(yōu)選為發(fā)酵36小時后開 始進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N1/20GK103881953SQ201410157802
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】趙景坤, 徐振達(dá), 喬凱 申請人:哈爾濱方依達(dá)肥業(yè)股份有限公司