專(zhuān)利名稱(chēng)：一種枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌生產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法，屬于食品生物 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Y-glutamyltranspeptidase， y-GTP， EC 2. 3. 2. 2),即y-谷 氨酰轉(zhuǎn)移酶，是生物體內(nèi)谷胱甘肽代謝的相關(guān)酶之一，也是催化轉(zhuǎn)移L-Y-谷氨酰
基的特異性酶。Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶可以催化以下3類(lèi)反應(yīng)
(1) 轉(zhuǎn)肽反應(yīng)Glutathione+amino acid^~~ y-glu-amino acid+Cys-Gly
(2) 自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)Glutathione ^~ y-glu-glutathione+Cys-Gly (3沐解反應(yīng)Glutathione+H20 ^~ glutamine+Cys-Gly
它在生物體中分布相當(dāng)廣泛，從細(xì)菌到高等哺乳動(dòng)物體中都有該酶的存在。 血清中Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性是肝膽疾病的相當(dāng)靈敏的指示劑，在臨床上已經(jīng)用于 肝臟細(xì)胞癌變和肝癌形成的檢測(cè)指標(biāo)物，現(xiàn)也研究其在其他組織病變過(guò)程中的 作用。該酶還是Y-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)可以進(jìn)行細(xì)胞 間的氨基酸分子運(yùn)輸。目前，廣大研究者更為關(guān)注的是該酶在生物催化合成中 的重要應(yīng)用(l)催化合成藥物或藥物前體，如帕金森綜合癥的前體藥物L(fēng)-Y-谷氨 酰-L-多巴的合成、谷胱甘肽的合成、L卞谷氨酰-牛磺酸的合成(該物質(zhì)會(huì)影響 腦中的單胺的濃度、貓的攻擊性行為、以及電擊引起的失憶癥，還有抗癲癇等)， ，D-谷氨酰-L-色氨酸(SCV-07)合成(SCV-07是一種新型的廣譜免疫調(diào)節(jié)類(lèi)化合 物，其作用類(lèi)似胸腺素al)、以及茶氨酸的合成(該物質(zhì)更是具有降血壓、抗 腫瘤、提高免疫力、抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)作用、改善經(jīng)期綜合征、減輕體脂等保 健作用)。(2)氨基酸的修飾和改性，將具有苦味的氨基酸(L-型的芳香氨基酸、 堿性氨基酸及有支鏈的氨基酸)通過(guò)Y-谷氨酰化可對(duì)其進(jìn)行風(fēng)味的改變，通過(guò)Y-谷氨?；€能增強(qiáng)某些物質(zhì)的穩(wěn)定性和可溶性，如胱氨酸通過(guò)Y-谷氨?；D(zhuǎn)變?yōu)?Y-谷氨酰-胱氨酸后，其可溶性極大增強(qiáng)；Y-谷氨酰-皮啡肽因其穩(wěn)定性增強(qiáng)可用 作具有鎮(zhèn)痛作用的前體藥物。(3)氨基頭孢菌烷酸(7-ACA)的制備，7-ACA是生
產(chǎn)頭孢菌素的關(guān)鍵性中間體。
Y-谷氨?；衔锸且活?lèi)重要的氨基酸衍生物，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng) 域具有廣泛的應(yīng)用前景。利用Y- GTP生物催化合成，谷氨酰基化合物是制備系
列Y-谷氨?；衔锏挠行侄巍?br> ，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶制備主要有這樣兩個(gè)途徑 一是從動(dòng)植物中富含酶的組織中
提取純化；二是微生物法生產(chǎn)酶蛋白。由于以前采用這兩種方法獲得，GTP都 比較困難，導(dǎo)致，GTP的產(chǎn)量較低，使得采用酶法合成Y-谷氨酰基類(lèi)化合物一 直處于實(shí)驗(yàn)室的研究階段。自從1952年有人嘗試從普通變形桿菌中分離Y-GTP， 才開(kāi)始了微生物法生產(chǎn)酶蛋白的研究。此后Suzuki等利用基因工程構(gòu)建E.Coli 的"GTP生產(chǎn)菌，但由于Y-GTP含量極低，無(wú)法分離而不具有商業(yè)價(jià)值。近來(lái) 淺田芳宏等發(fā)現(xiàn)有些芽孢桿菌可在體外分泌y-GTP，并得到一株最高可產(chǎn)Y-GTP 每毫升3.0U的菌株。國(guó)內(nèi)南京工業(yè)大學(xué)徐虹教授等人從土壤里篩選分離得到一 株產(chǎn)胞外Y-GTP的Bacillus subtilisNX-2，其酶活力達(dá)到每毫升3.2 U。可見(jiàn)采用 產(chǎn)酶性能優(yōu)良的菌種，尤其是產(chǎn)胞外Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌株，摸索出成熟的工 藝條件，對(duì)以后大規(guī)模生產(chǎn)Y- GTP至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種枯草芽孢桿菌生產(chǎn)Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法。 本發(fā)明所使用的枯草芽孢桿菌，是本發(fā)明人等先前從發(fā)酵食品蝦醬中篩選
得到的一株可以高產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌株，其分類(lèi)命名為枯草芽孢桿菌 (Bacz7/"wwto'fe) SK11.004，己保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為 2008年7月10日，保藏編號(hào)CCTCCNO: M208083。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種枯草芽孢桿菌生產(chǎn)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法 (1)對(duì)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌(Bac!7/iwswMfc) SK11.004
進(jìn)行斜面、種子、發(fā)酵三級(jí)培養(yǎng)；
斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基組分以g/L計(jì)蛋白胨8 10，牛肉膏3 5，氯化鈉3 5，瓊脂20， pH7.0 7.2， 12rC滅菌20min，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35 40。C， 培養(yǎng)時(shí)間8 16小時(shí)；
種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組分以g/L計(jì)葡萄糖15 20，酵母膏10 15，玉米漿 8 12， MgSO4.7H2O0.3 0.5， K2HPO40.5 2，含消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三 油0.5mL/L， pH7.0 7.2， 12rC滅菌20min;培養(yǎng)條件為250mL三角瓶裝 液30mL，搖瓶轉(zhuǎn)速200rpm,培養(yǎng)溫度37X:，培養(yǎng)時(shí)間8 12小時(shí)； 一級(jí)種子 培養(yǎng)基按體積百分2.5 %接入裝液量為18升液體種子培養(yǎng)基的30升二級(jí)種子罐 中，培養(yǎng)條件為攪拌速度200rpm，控制通風(fēng)量0 5小時(shí)為8 10L/min， 5 12小時(shí)為12 15L/min;控制培養(yǎng)溫度為35 40°C ，培養(yǎng)時(shí)間8 12小時(shí)；
發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組分以g/L計(jì)蔗糖15 35，胰蛋白胨5 8，玉米漿 12 15， MgSO4.7H2O0.3 0.5， K2HPO40.5 2，消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油 2mL/L， pH7.0 7.2， 12rC滅菌20min，調(diào)pH7.0 7.2;種子培養(yǎng)基按體積 百分2.5%接入裝液量700升液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為攪 拌速度200rpm，控制通風(fēng)量0 8小時(shí)為10 12L/min， 8 16小時(shí)為14 16L/min;控制培養(yǎng)溫度為35 40°C ，培養(yǎng)時(shí)間14 16小時(shí)；
(2)從發(fā)酵液中分離純化得到Y(jié)-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶粉；
將制得的發(fā)酵液經(jīng)離心或板框過(guò)濾去菌體，制得發(fā)酵液上清液，經(jīng)超濾除
去鹽和雜蛋白，再經(jīng)20°/。酒精沉淀，離心得沉淀，最后將沉淀進(jìn)行冷凍干燥， 即得Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶粉。
本發(fā)明中的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，是通過(guò)使酶作用于Y-谷氨酰對(duì)硝基苯胺和 雙甘肽，定量所生成的對(duì)硝基苯胺而測(cè)定。該酶的單位定義為每1分鐘生成 lpmol對(duì)硝基苯胺的酶量。
本發(fā)明的有益效果枯草芽孢桿菌SK11.004最初來(lái)源于發(fā)酵食品蝦醬，是 無(wú)人體寄生性的高度安全的菌類(lèi)，通過(guò)細(xì)菌進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)成本低。本發(fā)明 得到的枯草芽孢桿菌所產(chǎn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活可達(dá)4U/mL以上。其發(fā)酵產(chǎn)品無(wú) 毒，可以直接用于生產(chǎn)許多有價(jià)值的Y-谷氨酰類(lèi)化合物，如L-Y-谷氨酰-L-多巴、 Y-谷氨酰?；撬?、Y-谷氨酰色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸等。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
將枯草芽孢桿菌SK 11.004在下述條件下進(jìn)行發(fā)酵
斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基組分(g/L):蛋白胨IO，牛肉膏5，氯化鈉5，瓊脂20， pH7.0， 12rC滅菌20min，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37'C，培養(yǎng)時(shí)間14小時(shí)；
種子培養(yǎng):培養(yǎng)基組分(g / L):葡萄糖20，酵母膏10，玉米槳10，MgSO4 '7H20 0.5， K2HP041， pH7.0, 12rC滅菌20min，培養(yǎng)條件為250 mL三角瓶裝液 30mL，搖瓶轉(zhuǎn)速200rpm,培養(yǎng)溫度37。C，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)； 一級(jí)種子培養(yǎng)基 按體積百分2.5 %接入30升二級(jí)種子罐(裝液量18升)液體種子培養(yǎng)基中，其 中消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5 (mL/L)，培養(yǎng)條件為攪拌速度200rpm， 控制通風(fēng)量0 5小時(shí)為10L/min， 5 12小時(shí)為15 L/min;控制培養(yǎng)溫度為 37°C，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)；
發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組分(g/L):蔗糖25，胰蛋白胨5，玉米槳15，MgSCV7H20 0.5， K2HP041，消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油2 (mL/L)， pH 7.2， 121。C滅菌 20min;種子培養(yǎng)基按體積百分2.5 %接入1噸發(fā)酵罐(裝液量700升)液體發(fā) 酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為攪拌速度200 rpm，控制通風(fēng)量:0 8小時(shí)為12 L/min， 8 16小時(shí)為15L/min;控制培養(yǎng)溫度為37"C，培養(yǎng)時(shí)間16小時(shí)，得到發(fā)酵液 的酶活為4.1U/mL;
實(shí)施例2
酶粉的制備
將制得的發(fā)酵液經(jīng)離心(4000rpm)去菌體，制得發(fā)酵液上清液，再經(jīng)截流 分子量為l萬(wàn)的超濾膜超濾除去鹽和雜蛋白，后經(jīng)20%酒精沉淀，離心得沉淀， 最后將沉淀進(jìn)行冷凍干燥，即得Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶粉，酶活達(dá)3.8U/mL。
權(quán)利要求
1、一種枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法，其特征在于(1)對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SK11.004進(jìn)行斜面、種子、發(fā)酵三級(jí)培養(yǎng)；斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基組分以g/L計(jì)蛋白胨8～10，牛肉膏3～5，氯化鈉3～5，瓊脂20，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20min，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35～40℃，培養(yǎng)時(shí)間8～16小時(shí)；種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組分以g/L計(jì)葡萄糖15～20，酵母膏10～15，玉米漿8～12，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO4 0.5～2，含消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20min；培養(yǎng)條件為250mL三角瓶裝液30mL，搖瓶轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間8～12小時(shí)；一級(jí)種子培養(yǎng)基按體積百分2.5％接入裝液量為18升液體種子培養(yǎng)基的30升二級(jí)種子罐中，培養(yǎng)條件為攪拌速度200rpm，控制通風(fēng)量0～5小時(shí)為8～10L/min，5～12小時(shí)為12～15L/min；控制培養(yǎng)溫度為35～40℃，培養(yǎng)時(shí)間8～12小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組分以g/L計(jì)蔗糖15～35，胰蛋白胨5～8，玉米漿12～15，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO4 0.5～2，消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油2mL/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min，調(diào)pH 7.0～7.2；種子培養(yǎng)基按體積百分2.5％接入裝液量700升液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為攪拌速度200rpm，控制通風(fēng)量0～8小時(shí)為10～12L/min，8～16小時(shí)為14～16L/min；控制培養(yǎng)溫度為35～40℃，培養(yǎng)時(shí)間14～16小時(shí)；(2)從發(fā)酵液中分離純化得到γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶粉；將制得的發(fā)酵液經(jīng)離心或板框過(guò)濾去菌體，制得發(fā)酵液上清液，經(jīng)超濾除去鹽和雜蛋白，再經(jīng)20％酒精沉淀，離心得沉淀，最后將沉淀進(jìn)行冷凍干燥，即得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶粉。
全文摘要
一種枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SK11.004進(jìn)行斜面、種子、發(fā)酵三級(jí)培養(yǎng)；從發(fā)酵液中分離純化得到γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶粉。本發(fā)明提供的利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SK 11.004生產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法，其育種工作量小，費(fèi)用低，安全性能可靠，可以進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，成本低，可用于大規(guī)模生產(chǎn)，本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌所產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活可達(dá)4U/mL以上。其發(fā)酵產(chǎn)品無(wú)毒，可以直接用于生產(chǎn)許多有價(jià)值的γ-谷氨酰類(lèi)化合物，如L-γ-谷氨酰-L-多巴、γ-谷氨酰?；撬?、γ-谷氨酰色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸等。
文檔編號(hào)C12N9/10GK101363014SQ200810021188
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者帥玉英, 濤 張, 波 江 申請(qǐng)人:江南大學(xué)