與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。該與植物生物量相關(guān)的miRNA的核苷酸序列是SEQ?ID?No.1。該與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料可用于調(diào)控目的植物的生物量（如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積）。
【專(zhuān)利說(shuō)明】與植物生物量相關(guān)的mi RNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及與植物生物量相關(guān)的miRNA及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.),十字花科(Brassicaceae)鼠耳芥屬(Arabidopsis)擬南芥(A.thaliana)，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。擬南芥由于具有以下的特點(diǎn)而成為研究有花植物的遺傳、細(xì)胞、發(fā)育、分子生物學(xué)研究的模式植物:
[0003]一、擬南芥的優(yōu)點(diǎn)是植株小、每代時(shí)間短(兩個(gè)月一個(gè)世代)、結(jié)子多、生活力強(qiáng)。二、擬南芥的基因組是開(kāi)花植物中相對(duì)較小的。每個(gè)單倍染色體組(n=5)的總長(zhǎng)只有7000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，即只有小麥染色體組長(zhǎng)的1/80，其整個(gè)基因組已于2000年由國(guó)際擬南芥菜基因組合作聯(lián)盟聯(lián)合完成，也是第一個(gè)被順序分析的植物基因組。
[0004]三、擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。近十年來(lái)，植物科學(xué)家們利用擬南芥模式系統(tǒng)，對(duì)植物不同組織和器官的發(fā)育開(kāi)展了類(lèi)似的研究。通過(guò)大量擬南芥突變體的分析，科學(xué)家們對(duì)植物根、莖、葉、花、胚胎和種子的發(fā)育，對(duì)植物抗病性和抗逆性機(jī)理，以及對(duì)各種生命活動(dòng)有關(guān)的激素、光和環(huán)境因子引起的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程等進(jìn)行了深入的研究，極大豐富了人類(lèi)對(duì)于植物生命活動(dòng)內(nèi)在機(jī)理的認(rèn)識(shí)。
[0005]微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)在真核生物中廣泛存在的、長(zhǎng)度為21~24nt、具有調(diào)控作用的一類(lèi)小分子RNA。大多數(shù)植物的miRNA基因位于基因間區(qū)(intergenicregion)以單順?lè)醋有问睫D(zhuǎn)錄(Brown, J ff.1ntronic noncoding RNAs and splicing.Trends Plant Sci, 2008.13(7):p.335-42.)。大部分miRNA基因產(chǎn)物的幾個(gè)共同特征表明植物miRNA基因在RNA 聚合酶II (RNA polymerase II)的指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出pri_miRNA,即初級(jí)前體。緊接著初級(jí)前體在核內(nèi)被RNase III Dicer-likel (DCLl)兩次連續(xù)加工，從而產(chǎn)生miRNA/miRNA*雙鏈。miRNA/miRNA*雙鏈在細(xì)胞核中被HEN蛋白甲基化后，被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。成熟的miRNA從miRNA/miRNA*雙鏈中分離出來(lái)，選擇性地與核酸酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC),從而發(fā)揮功能。目前已知的植物miRNA對(duì)其靶標(biāo)基因的調(diào)控方式有三種:剪切、翻譯抑制和轉(zhuǎn)錄沉默。在植物中miRNA介導(dǎo)的靶基因剪切是其主要的作用形式，一般來(lái)講miRNA對(duì)完全互補(bǔ)或接近完全互補(bǔ)的mRNA序列進(jìn)行切割。目前已經(jīng)確認(rèn)的miRNA的靶標(biāo)基因大部分為各種調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。miRNA除了位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，還可以將蛋白水解、代謝、離子運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多種mRNA作為祀標(biāo)(Benjamin H, Ribo-gnome: the big worldof small RNAs.Science, 2005.309(5740):p.1519-24.89.；Guo, H.S.MicroRNA directsmRNA cleavage of the transcription factor NAClto downregulate auxin signals forarabidopsis lateral root development.Plant Cell, 2005.17 (5):p.1376-86.),這顯不了此類(lèi)小分子RNA具有重要的生物學(xué)意義。
[0006]在植物中，各種miRNA的表達(dá)水平是不同的。這不僅與miRNA基因上游的啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率有關(guān)，也與miRNA基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被DCL蛋白剪切的效率有關(guān)。于是為了研究低水平表達(dá)的miRNA，利用高表達(dá)水平miRNA的前體骨架構(gòu)建高表達(dá)的人工miRNA成為一種有效的方法。在植物中利用經(jīng)過(guò)改造的miRNA前體骨架(Pre-miRNA backbone)表達(dá)人工miRNA已有成功報(bào)道，并被應(yīng)用與內(nèi)源基因的調(diào)控及植物抗病毒研究，如Schwab (2006)等以MIR319a和MIR172a為前體表達(dá)的amiRNA能有小下調(diào)擬南芥內(nèi)源基因的表達(dá)(RebeccaS.Highly specific gene silencing by artificial mircoRNAs in Arabidopsis.plant cell, 2006，18:pll21-33)，Duan (2008)等利用 MIR159a 的前體表達(dá)針對(duì) CMV 基因組 RNA3’ UTR 的人工 miRNA,獲得了 對(duì) CMV 較高的抗性(Cheng-Guo Duan.ArtificialMicroRNAs Highly Accessible to Targets Confer Efficient Virus Resistance inPlants.Journal of Virology, 2008，82:pi1084-95)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種與植物生物量相關(guān)的miRNA及其關(guān)生物材料與應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所提供的miRNA，名稱(chēng)為miR847，其核苷酸序列是SEQ ID N0.1。其中，SEQID N0.1由21個(gè)核苷酸組成。[0009]miR847的編碼基因(miR847基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]可產(chǎn)生miR847的短發(fā)夾RNA (shRNA, short hairpin RNA)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該短發(fā)夾RNA是形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA，其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的一條鏈序列是SEQ ID N0.1，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1反向互補(bǔ)。
[0011]所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列具體可為Al)或A2):
[0012]Al)將SEQ ID N0.2的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列；
[0013]A2)對(duì)SEQ ID N0.2進(jìn)行如下改造得到的序列:將SEQ ID N0.2的第1_25位和第208-210位核苷酸均缺失，將SEQ ID N0.2的第26-207位的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列。
[0014]其中，SEQ ID N0.2由210個(gè)核苷酸組成。
[0015]與miR847相關(guān)的生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]上述與miR847相關(guān)的生物材料，具體可為下述BI)至B4)中的任一種
[0017]BI)含有miR847編碼基因的表達(dá)盒；
[0018]B2)含有miR847編碼基因的重組載體、或含有BI)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0019]B3)含有miR847編碼基因的重組微生物、或含有BI)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有B2)所述重組載體的重組微生物；
[0020]B4)含有miR847編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有BI)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0021]上述生物材料中，BI)所述的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄加工后形成miR847的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)miR847基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止miR847基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于:組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于:花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S;來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶(〃LAP〃, Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992);來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)I(PRl)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸曱酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5，187，267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5，057, 422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128 (CN101063139B (中國(guó)專(zhuān)利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆 beta conglycin 的啟動(dòng)子(Beachy 等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)) ? 它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于:農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子(參見(jiàn)，例如:Odell 等人(I985)Nature313:810 ；Rosenberg 等 A(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mol.Gen.Genet, 262:141;Proudfoot (1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 GenesDev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891 ；Joshi 等人(1987)Nucleic AcidRes., 15:9627)。
[0022]在本發(fā)明的實(shí)施例中，BI)所述的表達(dá)盒中啟動(dòng)所述miR847基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，終止所述miR847基因轉(zhuǎn)錄的終止子為胭脂堿合成酶基因終止子TNos。
[0023]可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有BI)所述的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pCanG、pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類(lèi)似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是 天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0024]上述B2)所述的重組載體具體可為將pCanG的SmaI和SacI位點(diǎn)間的片段替換為SEQ ID N0.2的DNA分子，保持pCanG的其它核苷酸不變得到的重組載體。
[0025]上述生物材料中，B3)所述的重組微生物具體可為酵母，細(xì)菌，藻和真菌。B4)所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系不包括植物的繁殖材料。
[0026]miR847、miR847的編碼基因、上述短發(fā)夾RNA、或上述與miR847的相關(guān)生物材料在調(diào)控植物生物量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]上述應(yīng)用中，所述生物量可為下述1-3)中的全部或部分:
[0028]I)葉重；
[0029]2)單株葉數(shù)；
[0030]3)葉片面積。
[0031]上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，如擬南芥。
[0032]本發(fā)明提供了具體的利用上述與miR847相關(guān)的生物材料提高植物生物量的方法。
[0033]本發(fā)明所提供的培育生物量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入miRNA的編碼基因得到生物量高于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述miRNA的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。
[0034]上述方法中，所述miRNA的編碼基因可為下述I)或2) DNA分子:
[0035]I)核苷酸序列是SEQ ID N0.2的DNA分子；
[0036]2)編碼序列是SEQ ID N0.2的第187-207位的DNA分子。
[0037]上述方法中，所述受體植物可為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，如擬南芥。
[0038]上述方法中，所述生物量可為下述1-3)中的全部或部分:
[0039]I)單株葉重；
[0040]2)單株葉數(shù)；
[0041]3)葉片面積。
[0042]上述方法中，所述miR847的編碼基因通過(guò)含有miR847的編碼基因表達(dá)盒導(dǎo)入所述受體植物中。所述表達(dá)盒具體可為上述BI)所述的表達(dá)盒。
[0043]上述方法中，所述miR847的編碼基因可通過(guò)含有miR847的編碼基因的重組載體導(dǎo)入所述受體植物中。該重組載體可為上述B2)所述的重組載體。
[0044]上述方法中，其中所述miR847基因可先進(jìn)行如下修飾,再導(dǎo)入所述受體植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果:
[0045] 3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；
[0046]4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；
[0047]5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于TMV, MCMV和AMV )。
[0048]所述重組載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998, Method for Plant MolecularBiology VIII, Academy Press, New York,pp.411-463;Geiserson and Corey, 1998, PlantMolecular Biology (2nd Edition)。
[0049]上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0050]本發(fā)明采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、分子克隆技術(shù)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、Northern雜交、5’ RACE等多種生物學(xué)手段，首次高表達(dá)了 miR847，證明了與受體植物相比，轉(zhuǎn)入miR847基因的轉(zhuǎn)基因植物的單株葉重、單株葉數(shù)和葉片面積高于受體植物，說(shuō)明miR847是與植物生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)相關(guān)的RNA，可用于調(diào)控目的植物的生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0051]圖1為25天擬南芥野生型以及Tl代擬南芥/pCanG-35S-miR847的葉片圖。野生型代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-3和MiR847_4為T(mén)l代擬南芥/pCanG-35S_miR847株系。
[0052]圖2為Northern雜交檢測(cè)野生型以及T2代擬南芥/pCanG-35S_miR847的21天葉片中miR847基因的表達(dá)。野生型代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-l、miR847-2、miR847-3 和 MiR847_4 為 T2 代擬南芥 /pCanG-35S_miR847 株系。
[0053]圖3為野生型和T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系培養(yǎng)29天時(shí)單株葉片數(shù)。Col-O代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-2、miR847-3和MiR847_4為T(mén)2代擬南芥/pCanG-35S-miR847 株系。
[0054]圖4為野生型和T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系培養(yǎng)29天時(shí)單株蓮座葉鮮重。Col-O代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，miR847-2、miR847-3和MiR847_4為T(mén)2代擬南芥/pCanG-35S-miR847 株系。
[0055]圖5為野生型以及T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系培養(yǎng)33天時(shí)的葉片表型。野生型表示哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，35S-miR847為T(mén)2代擬南芥/pCanG-35S_miR847。
【具體實(shí)施方式】
[0056]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0058]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0059]下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (Elizabeth E.Hood.NewAgrobacteriumhelper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Research, Julyl993, Volume2, Issue4, pp208_218)公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。[0060]下述實(shí)施例中的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(J6rn Gorlach.A Model for HighThroughput Functional Genomics in Plants.The Plant Cell, July2001vol.13n0.71499-1510)公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0061]下述實(shí)施例中的pCanG (Qi Xie, Generation of glyco-engineered BY2celllines with decreased expression of plant-specific glycoepitopes.Protein&Cell.January2011, Volume2, Issuel, pp41_47)公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得,該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0062]實(shí)施例1、miR847表達(dá)載體的構(gòu)建
[0063]利用CTAB法提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥植株的基因組DNA，利用以下引物以該基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增:上游引物(5’ 一 3’):
[0064]ACAGATCTTGATCTGACGATGGAAGCATCAAGAAGATAAGGGGTGACATGAGTTGAGCAGGGTA (下劃線為miR847序列)下游引物(5，— 3，):
[0065]CAGCATCAAGAAGAAGAGGAGTGAGAAGAGTAAAAGCCATTA (下劃線為 miR847 的反向互補(bǔ)序列)。將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(購(gòu)自TIANGEN公司)上，得到重組載體。利用上述上游引物和PGEM-T載體通用反向引物M13R PCR擴(kuò)增鑒定正向插入的重組載體并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明含有SEQ ID N0.2所示的DNA分子的重組載體命名為pGEMT-miR847。其中，SEQ ID N0.2由210個(gè)核苷酸組成，為miR847編碼基因的核苷酸序列。Bgl II單酶切pGEMT-miR847，失活酶，利用Klenown酶補(bǔ)平粘性末端并失活酶，然后利用SacI酶切，電泳后回收220bp左右的含有miR847基因的片段，與經(jīng)過(guò)Smal，SacI雙酶切后回收的pCanG的線性化質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR及酶切和測(cè)序鑒定重組載體，將pCanG的SmaI和SacI位點(diǎn)間的片段替換為SEQ ID N0.2的DNA分子，并保持pCanG的其它核苷酸不變得到的重組載體命名為 pCanG-35S-miR847。
[0066]實(shí)施例2、擬南芥/pCanG-35S_miR847的獲得
[0067]以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥為受體植物，將pCanG-35S_miR847轉(zhuǎn)入哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中，得到miR847表達(dá)植株擬南芥/pCanG-35S-miR847。具體方法如下:
[0068](一)擬南芥的轉(zhuǎn)化
[0069]將哥倫比亞生態(tài)型擬南芥幼苗置于16hr光照/Shr黑暗環(huán)境下培養(yǎng)4周，待多數(shù)植株抽薹開(kāi)花時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。將質(zhì)粒pCanG-35S-miR847轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌株EHA105，挑取單菌落在含卡那霉素的3ml LB培養(yǎng)基中28 V 250rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后將培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)至200mlLB中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。至農(nóng)桿菌液培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到2.0左右時(shí)，在菌液中加入乙酰丁香酮(AS)，使得終濃度為40 μ Μ，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)2-4h。將農(nóng)桿菌菌液于4000rpm離心30min，棄上清，將菌體懸浮于5%的蔗糖溶液中，調(diào)節(jié)OD6tltl為2.0，加入表面活性劑Silwett L-77，使終濃度為0.05%，混勻。將擬南芥花序浸入農(nóng)桿菌菌液中，輕輕搖動(dòng)約10s，然后將植物保濕暗培養(yǎng)24hr。將轉(zhuǎn)化過(guò)的擬南芥轉(zhuǎn)到正常光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一周重復(fù)浸花I次，重復(fù)
2-3次。培養(yǎng)一段時(shí)間后收種。
[0070](二)擬南芥/pCanG-35S_miR847的篩選及鑒定
[0071]轉(zhuǎn)化后得到的當(dāng)代轉(zhuǎn)基因種子即為T(mén)l代轉(zhuǎn)基因種子。將種子鋪于含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上后，放置4°C 2到4天后，放于22 °C 16hr光照/8hr黑暗的環(huán)境下培養(yǎng)9天后，挑選出能夠正常萌發(fā)生長(zhǎng)的植株即轉(zhuǎn)基因Tl代植株命名為擬南芥/pCanG-35S-miR847植株，轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)25天并進(jìn)行觀察。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，Tl代擬南芥/pCanG-35S-miR847植株中，85.7% (54株/63株)出現(xiàn)有葉重增加、單株葉數(shù)增多、葉片面積增大的表型(如圖1)。Tl代擬南芥/pCanG-35S-miR847植株收獲種子后，挑選4個(gè)葉重增加、單株葉數(shù)增多、葉片面積增大的T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系(名稱(chēng)為miR847_4、miR847_3、miR847-2、miR847_l )，播種到含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選后，轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)土中分別培養(yǎng)21天，29天、33天。培養(yǎng)21天時(shí)分別收集葉片，利用Trizol試劑提取葉片總RNA進(jìn)行Northern blotting檢測(cè)RNA中的miR847的表達(dá)量；培養(yǎng)29天時(shí)統(tǒng)計(jì)各株系的葉片數(shù)和蓮座葉鮮重；培養(yǎng)33天時(shí)觀察葉片表型。以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥作為對(duì)照，進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)。
[0072](三)Northernblotting 檢測(cè) RNA 中的 miR847 的表達(dá)量
[0073]Trizol試劑法提取植物組織RNA，方法如下:
[0074](I)將待檢測(cè)植株葉片在研缽中用液氮研磨成粉末，每50~IOOmg組織加入1mlTrizol，于離心管中勻漿至完全裂解；室溫放置5min。[0075](2)在裝有裂解物的離心管中加入0.2倍體積的氯仿(1ml Trizol加入0.2ml氯仿)，用振蕩器充分振蕩混勻30秒，室溫放置2~3min。
[0076](3)4°C，14000rpm，離心10min，吸取上層水相至一新的離心管中，每毫升RNAVzoI可吸取約0.6~0.75ml ο
[0077](4)按(3)中水相的體積加入等體積的異丙醇，顛倒數(shù)次，混勻，室溫沉淀lOmin。
[0078](5)4°C，l，4000rpm，離心10min，在管底可見(jiàn)RNA沉淀。棄上清，每毫升最初的RNAVzoI加入lml75%乙醇，輕輕顛倒混勻，以清洗RNA沉淀。棄去液體，小心勿丟棄RNA沉淀。室溫倒置晾干(5~IOmin)。
[0079](6)加入適量的50%去離子甲酰胺溶解RNA沉淀，存放于_80°C備用。
[0080]提取RNA后，以小核仁RNA U6為內(nèi)參,利用Northern blotting來(lái)檢測(cè)RNA中的miR847的表達(dá)量。方法如下:
[0081](I)制備探針
[0082]檢測(cè)miR847 的探針序列:5’ -CATCAAGAAGAAGAGGAGTGA-3’，
[0083]檢測(cè)U6 的探針序列:5’ CTCGATTTATGCGTGTCATCCTTGC3’。
[0084]米用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對(duì)上述序列末端磷酸基團(tuán)進(jìn)行同位素(Y-32P ATP)標(biāo)記,得到用于Northern雜交的探針。
[0085](2) miRNA Northern 雜交
[0086]a.取30ug溶于50%去離子甲酰胺上述提取的擬南芥RNA樣品，100°C變性5min，冰上放置5min。變性后的RNA樣品中加入IOX加樣緩沖液(50%甘油，IOmmoI/L EDTA, 0.25%溴酚藍(lán)，0.25% 二甲基苯腈藍(lán)乙酸)，快速混勻，上樣。
[0087]b.RNA樣品用17%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉(zhuǎn)移裝置(BIO-RAD)轉(zhuǎn)移到 HybondN+ 尼龍膜(Amersham Biosciences)上。
[0088]c.轉(zhuǎn)移有RNA樣品的尼龍膜紫外交聯(lián)5min，使RNA固定在尼龍膜上。
[0089]d.配制用于LNA修飾的寡核苷酸探針雜交液，將雜交緩沖液放入雜交管中，37°C預(yù)熱15min，將膜放進(jìn)雜交管中，37°C預(yù)雜I~2小時(shí)。然后將標(biāo)記好的探針?lè)湃腚s交管中，37 °C雜交過(guò)夜。
[0090]e.雜交結(jié)束后，小心倒出雜交液，用洗膜緩沖液2XSSC/0.2%SDS，37°C /15~20min條件下，洗膜2次，檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)弱，若信號(hào)仍很強(qiáng)可再用0.2XSSC/0.2%SDS洗10~20mino
[0091 ] f.將洗好的膜從雜交管中拿出，轉(zhuǎn)移至兩層塑料膜中，檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)弱。將膜放入磷屏(GE Healthcare)中壓過(guò)夜后,用磷屏成像系統(tǒng)(GE Healthcare)檢測(cè)磷屏信號(hào)強(qiáng)度。
[0092]Northern blotting結(jié)果如圖2所示，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(受體植物)中無(wú)miR847 的雜交信號(hào)。而 miR847_4、miR847_3、miR847_2、miR847_l 這四個(gè) T2 代擬南芥 /pCanG-35S-miR847株系都有較強(qiáng)的miR847信號(hào)。
[0093]T2 代擬南芥 /pCanG-35S-miR847 株系(miR847_2、miR847_3 和 MiR847_4)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥培養(yǎng)29天的單株葉片數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3，單株蓮座葉鮮重統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖
4。結(jié)果表明，miR847-2、miR847_3和MiR847_4的單株平均葉片數(shù)是哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的1.5倍、1.46倍和1.57倍;miR847-2、miR847_3和MiR847_4的單株平均單株蓮座葉鮮重是哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的2.04倍、1.86倍和1.75倍。圖3中，miR847_2共13株、miR847-3共13株、MiR847_4共14株，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥共13株。圖4中，miR847_2共8株、miR847-3共8株、MiR847_4共9株，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥共7株。
[0094]T2代擬南芥/pCanG-35S_miR847株系和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥培養(yǎng)33天的葉片表型如圖5所示，T2代擬南芥/pCanG-35S-miR847株系的第8、9、10片葉片面積明顯大于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。圖5中，從左至右依次為第2、3、4、5、6、7、8、9、10……片葉，這個(gè)等差數(shù)列的公差為I。
[0095] 可見(jiàn)轉(zhuǎn)入miR847基因的轉(zhuǎn)基因植物的單株葉重、單株葉數(shù)和葉片面積高于受體植物，說(shuō)明miR847是與植物生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)相關(guān)的RNA，可用于調(diào)控目的植物的生物量(如單株葉重和/或單株葉數(shù)和/或葉片面積)。
【權(quán)利要求】
1.培育生物量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入miRNA的編碼基因得到生物量高于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述miRNA的核苷酸序列是SEQ IDN0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述miRNA的編碼基因?yàn)橄率鯥)或2)的DNA分子: 1)核苷酸序列是SEQID N0.2的DNA分子； 2)編碼序列是SEQID N0.2的第187-207位的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述生物量為下述1-3)中的全部或部分: 1)單株葉重； 2)單株葉數(shù)； 3)葉片面積。
4.miRNA，其特征在于:所述miRNA的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。
5.權(quán)利要求4所述的miRNA的編碼基因，為下述I)或2)的DNA分子: 1)核苷酸序列是SEQ ID N0.2的DNA分子； 2)編碼序列是SEQID N0.2的第187-207位的DNA分子。
6.形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA，其特征在于:所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的一條鏈序列是SEQID N0.1，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖的另一條鏈序列與SEQ ID N0.1反向互補(bǔ)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的短發(fā)夾RNA，其特征在于:所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列是Al)或 A2): Al)將SEQ ID N0.2的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列； A2)對(duì)SEQ ID N0.2進(jìn)行如下改造得到的序列:將SEQ ID N0.2的第1_25位和第208-210位核苷酸均缺失，將SEQ ID N0.2的第26-207位的所有T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA序列。
8.與權(quán)利要求4所述的miRNA相關(guān)的生物材料，為下述BI)至B4)中的任一種: BI)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的表達(dá)盒； B2)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的重組載體、或含有BI)所述表達(dá)盒的重組載體；B3)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的重組微生物、或含有BI)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有B2)所述重組載體的重組微生物； B4)含有權(quán)利要求5所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有BI)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求4所述的miRNA、權(quán)利要求5所述的編碼基因、權(quán)利要求6或7所述的短發(fā)夾RNA、或權(quán)利要求8所述的相關(guān)生物材料在調(diào)控植物生物量中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述生物量為下述1-3)中的全部或部分: 1)單株葉重； 2)單株葉數(shù)； 3)葉片面積。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103937832SQ201410157643
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】郭惠珊, 汪晶晶 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所