專(zhuān)利名稱(chēng)：包括氨基醇的酶氧化的生產(chǎn)聚胺的方法
包括氨基醇的酶氧化的生產(chǎn)聚胺的方法本發(fā)明涉及一種使用酶來(lái)生產(chǎn)聚胺的方法；特別是涉及一種在水性環(huán)境中進(jìn)行的方法；用所述方法生產(chǎn)的聚胺；以及所述聚胺用于造紙、固定酶或用于制備藥物或化妝品組合物的用途。本發(fā)明還涉及一種用于原位再生輔因子NAD (P)+的新方法。
背景技術(shù)：
聚胺，如PEI (聚乙烯亞胺)是具有十分廣泛應(yīng)用的陽(yáng)離子聚合物。PEI及其衍生物被用于例如紙漿和紙的制造中以克服由樹(shù)脂和機(jī)械木漿提取物造成的生產(chǎn)問(wèn)題(MonchD7Stange A, Linhart F,用于伴行消除和增加造紙功效的先進(jìn)生產(chǎn)概念(AdvancedProduct Concepts for Concomitant Elimination and Increased Efficiency of PaperManufacture) ,Wochenblatt fiir Papierfabrikation 1996，124 :889_892，894-895)。聚合物的荷電性也使其可用于例如酶的固定(Grunwald PiFreder RiGunsser W，聚乙烯亞胺作為酶固定載體材料的應(yīng)用(Application of polyethylene imine as carrier materialfor enzyme immobilization)Naturwissenschaften 1981，68 :525_526) ； (de LathouderKM，van Benthem DTJ,Wallin SA,Mateo C. ,Fernandez Lafuente R,Guisan JM，KapteijnF, Moulijn JA，作為酶載體的聚乙烯亞胺(PEI)官能化的蜂窩狀陶瓷載體制備和性能(Polyethyleneimine(PEI)functionalized ceramic monoliths as enzyme carriers Preparation and performance)Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic 2008,50 20-27)。最近已經(jīng)在基因傳遞方面取得了一些進(jìn)展，其中已經(jīng)表明PEI (有時(shí)與PEG聯(lián)合)增加了 DNA/RNA 的細(xì)胞滲透(Lungwitz U, Breunig M, Blunk T, G6pferich A,以聚乙烯亞胺為基礎(chǔ)的非病毒基因傳遞系統(tǒng)(Polyethylenimine-based non-viral genedelivery systems)European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2005,60:247-266) ； (Belenkov Al,Alakhov VY,Kabanov AV,Vinogradov SV,Panasci LC,MoniaBP, Chow TY.用普朗尼克P85進(jìn)行接枝的聚乙烯亞胺增強(qiáng)了 Ku86反義傳遞和體內(nèi)的電離福身寸功效(Polyethyleneimine grafted with pluronic P85 enhances Ku86antisensedelivery and the ionizing radiation treatment efficacy in vivo), Gene Therapy2004，11 1665-1672.) ； (Jeong JH, Kim Sff, Park TG. 一種以自組裝的 0DN-PEG 雜交共軛膠束為基礎(chǔ)的新的反義寡核苷酸傳遞系統(tǒng)(A new antisense oligonucleotide deliverysystem based on self-assembled ODN-PEG hybrid conjugate micelles). Journal ofControled Release. 2003,93 :183_191)。因?yàn)橐肓?AND(反義寡核苷酸)的概念，并且在2006年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)，因此，這是一種十分有前景的應(yīng)用。反編碼(anticoding)基因的成功傳遞將治愈多種疾病如HIV、癌癥、自身免疫應(yīng)答等。聚胺的另一些治療應(yīng)用包括緩解與皮膚疾病和化療有關(guān)的癥狀。

目前可獲得的聚胺如PEI和樹(shù)狀聚合物是在有機(jī)溶劑中合成的。乙烯亞胺的常規(guī)聚合是以開(kāi)環(huán)為基礎(chǔ)的，因此，將重復(fù)單元的長(zhǎng)度限制為氮原子之間兩個(gè)碳。因此，本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供一種制備聚胺的方法，其可以在水性環(huán)境中進(jìn)行，并且并不限于C2-構(gòu)造塊。
發(fā)明概述
上述問(wèn)題通過(guò)提供一種新的聚胺合成方法得到了解決，該方法可以在水性介質(zhì)中進(jìn)行并且如所附權(quán)利要求書(shū)中進(jìn)一步定義的那樣，該方法是以某些酶的應(yīng)用為基礎(chǔ)的。
具體地講，提供了如圖1和2中概述的合成聚胺的新方法。通過(guò)醇脫氫酶如馬肝醇脫氫酶(HLADH)的作用(用NAD+/NADH作為輔因子)(圖1)或通過(guò)醇氧化酶的作用(用分子氧作為電子受體)(圖2)，在水性環(huán)境中將氨基醇例如3-氨基-1-丙醇氧化成氨基醛。 由此形成的氨基醛在中等酸性PH下自發(fā)性與亞胺反應(yīng)，從而形成聚亞胺。然后，通過(guò)還原， 例如用氰基硼氫化鈉還原來(lái)將所述聚亞胺轉(zhuǎn)化成聚胺。聚合物中的重復(fù)單元可在氮原子之間具有兩個(gè)或多個(gè)碳原子、可具有官能團(tuán)，并且可以是手性化合物，其僅受酶接受作為底物的起始氨基醇的容量的限制。在自然界中發(fā)現(xiàn)了許多具有不同的底物特異性和/或活性的醇脫氫酶和醇氧化酶。
為了支持底物的完全轉(zhuǎn)化，應(yīng)用一種用于輔因子再生的方法是有利的。迄今為止，NAD+的再生一直是個(gè)問(wèn)題；一種方法利用酶NADH-氧化酶，其是一種十分昂貴的物質(zhì)(Riebel BR, Gibbs PR, Wellborn WB, Bommarius AS，得自 NADH 的 NAD+和得自 NADPH 的NADP+的輔因子再生得自舊金山乳桿菌的NADH氧化酶(Cofactor Regeneration of both NAD+from NADH an d NADP+from NADPH :NADH Oxidase from Lactobacillus sanfranciscensis)Advanced Synthesis & Catalysis 2003，345 :707-712)。
本發(fā)明以乙酸乙烯酯的自發(fā)水解為基礎(chǔ)，提出了一種簡(jiǎn)單的新方法，該方法可以與酶聚合反應(yīng)相結(jié)合。
在使用醇氧化酶的情況中，通過(guò)將該反應(yīng)與氧化酶、特別是過(guò)氧化氫酶的催化活性結(jié)合，所形成的過(guò)氧化氫被迅速轉(zhuǎn)化成水和氧，從而使反應(yīng)平衡進(jìn)一步向醛一側(cè)移動(dòng)，并因此支持了底物的完全轉(zhuǎn)化。


圖1 :用醇脫氫酶催化的聚胺合成的圖示。將pH降至pH 4. 5以使聚亞胺形成。然后，用氰基硼氫化物進(jìn)行聚亞胺的還原。在原位用所形成的乙醛來(lái)進(jìn)行輔因子的再循環(huán)，所述乙醛是在堿性PH下或者用酯酶進(jìn)行乙酸乙烯酯的自發(fā)水解后形成的。
圖2 :用醇氧化酶催化的聚胺合成的圖示。將pH降至pH 4. 5以使聚亞胺形成。然后，用氰基硼氫化物進(jìn)行聚亞胺的還原。該酶利用氧并且在原位用過(guò)氧化氫酶進(jìn)一步氧化所形成的過(guò)氧化氫。
圖3 :排阻色譜。從頂端開(kāi)始由2-苯基甘氨醇制得的聚合物、對(duì)照(PEI1800)(未起作用(也許是上樣過(guò)多))、由3-氨基丙醇制得的聚合物、由D-丙氨醇制得的聚合物、由 L-丙氨醇制得的聚合物。各聚合物具有約IOOODa的分子量(Mw標(biāo)準(zhǔn)品未示出)。
圖4 :由2-苯基甘氨醇形成的低聚物的MALD1-T0F光譜。
圖5 PEI1800 的 MALD1-T0F 光譜。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案
1.在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)通式(4)的聚胺的方法，特別是在含水反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行的方法，
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)通式(4)的聚胺的方法
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)的氨基醇是其中X= -CH2-CH2-的式(I)化合物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟a)的酶選自脫氫酶和氧化酶，特別是醇脫氫酶E.C.1.1.1.1、醇脫氫酶(NADP+)1.1.1. 2、烯丙基-醇脫氫酶E. C.1.1.1. 54、醇脫氫酶[NAD(P)+]E.C.1.1. 1.71、芳基-醇脫氫酶E.C.1.1.1. 90、芳基-醇脫氫酶(NADP+) E. C.1.1.1. 91,3-羥基芐基-醇脫氫酶E. C.1.1.1. 97、紫蘇醇脫氫酶E. C.1.1.1. 144、長(zhǎng)鏈醇脫氫酶E. C.1.1.1. 192、松柏醇脫氫酶E. C.1.1.1. 194、肉桂醇脫氫酶E. C.1.1.1. 195、 環(huán)己醇脫氫酶E. C.1.1. 1.245、4-(羥基甲基)苯磺酸酯脫氫酶E. C.1.1. 1.257,3-甲基丁醛還原酶E. C.1.1. 1.265、S-(羥基甲基)谷胱甘肽脫氫酶E. C.1.1.1. 284、醇脫氫酶(受體)E. C.1.1. 99. 8、聚乙烯基-醇脫氫酶(受體)E. C.1. 1.99. 23、甲醛脫氫酶(谷胱甘肽) Ε. C. 1.2.1.1和醇氧化酶，Ε. C.1. 1.3. 13、芳基-醇氧化酶E. C.1. 1.3. 7、仲-醇氧化酶 Ε. C.1.1. 3. 18、長(zhǎng)鏈醇氧化酶Ε. C.1.1. 3. 20、聚乙烯基-醇氧化酶E. C.1.1. 3. 30、香草醇氧化酶 Ε. C.1.1. 3. 38。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述酶是馬肝醇脫氫酶(HLADH)并且具有SEQID NO 1的多肽序列，或者是具有SEQ ID NO :2的多肽序列的醇氧化酶；或者是它們的與SEQ ID NO I或2的序列具有至少60%序列一致性的突變體或變型。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中在步驟a)中，如果使用醇脫氫酶，則用NAD+作為氧化的輔因子；或者如果使用醇氧化酶，則該反應(yīng)在需氧條件下進(jìn)行。
6.權(quán)利要求5的方法，其中通過(guò)用相同的脫氫酶將醛或酮還原成相應(yīng)的醇來(lái)通過(guò)酶再生NAD+輔因子。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述醛或酮是通過(guò)活性酯的水解形成的。
8.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中化學(xué)還原步驟c)是在存在NaBH3CN或Pd/H2 的情況下進(jìn)行的。
9.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中獲得分子范圍為Mn= 100至7，000，000的聚胺。
10.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中步驟b)是在具有支持形成聚亞胺的pH、優(yōu)選3. 5至6的pH的水性介質(zhì)中進(jìn)行的。
11.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中步驟a)是在pH范圍為6至10的水性介質(zhì)中進(jìn)行的。
12.前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中所述酶是以溶解、分散或固定的形式使用的。
13.可用前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法獲得的聚胺。
14.如權(quán)利要求3和4中任意一項(xiàng)所定義的酶用于生產(chǎn)聚胺的用途。
15.可用權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)的方法獲得的聚胺用于造紙；固定酶；或制備藥物或化妝品組合物的用途。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述藥物組合物選自用于改善DNA和/或RNA的細(xì)胞滲透的組合物；用于治療皮膚疾病的軟膏；用于治療化療副作用的組合物；藥物傳遞組合物。
17.一種再生在脫氫酶催化的由所述酶的第一底物SI生成第一種氧化的產(chǎn)物Pl的氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的NAD(P)+的方法，該方法包括通過(guò)使所述的脫氫酶催化的氧化反應(yīng)與第二個(gè)同時(shí)進(jìn)行的脫氫酶催化的由不同于SI和Pl的所述酶的第二底物S2生成不同于Pl 和SI的第二個(gè)還原的產(chǎn)物P2的還原反應(yīng)相結(jié)合來(lái)再生NAD(P)+，其中所述底物S2是由前體分子PrS2產(chǎn)生的。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述脫氫酶是醇脫氫酶(ADase)。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述PrS2分子是羧酸的乙烯酯，其在水解時(shí)被分解成相應(yīng)的羧酸和作為第二底物S2的乙醛。
20.權(quán)利要求17至19中任意一項(xiàng)的方法，其中所述第一底物SI是一種可被所述ADase 氧化的醇。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的醇是上面式(I)的氨基醇。
22.權(quán)利要求18至21中任意一項(xiàng)的方法，其中所述再生反應(yīng)是在水性介質(zhì)中進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用酶來(lái)生產(chǎn)聚胺的方法；特別是涉及一種在水性環(huán)境中進(jìn)行的方法；用所述方法生產(chǎn)的聚胺；以及所述聚胺用于造紙、固定酶或用于制備藥物或化妝品組合物的用途。本發(fā)明還涉及一種原位再生輔因子NAD(P)+的新方法。
文檔編號(hào)C12P13/00GK103052716SQ201080049472
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日
發(fā)明者B·豪爾, D·K·恩格馬克卡西姆吉, P·貝里隆德 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司