一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的酮胺氧化酶是如下（a）至（p）中的任意一種：（a）序列3第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（b）序列3所示蛋白質(zhì)；（c）序列5第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（d）序列5所示蛋白質(zhì)；（e）序列7第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（f）序列7所示蛋白質(zhì)；（g）序列9第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（h）序列9所示蛋白質(zhì)；（i）序列11第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（j）序列11所示蛋白質(zhì)；（k）序列13第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（l）序列13所示蛋白質(zhì)；（m）序列15第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（n）序列15所示蛋白質(zhì)；（o）序列17第1至438位組成的蛋白質(zhì)；（p）序列17所示蛋白質(zhì)。與現(xiàn)有的酮胺氧化酶相比，本發(fā)明提供的各個(gè)酮胺氧化酶的酶活性大大提高，具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—組酮胺氧化酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]美拉德反應(yīng)，又稱為非酶催化糖基化反應(yīng)，是一類自然界常見的反應(yīng)。還原糖(最常見的是葡萄糖)與氨基化合物在常溫或是高溫下發(fā)生反應(yīng)，生成Amadori產(chǎn)物，并進(jìn)一步交聯(lián)得到高級(jí)糖基化終產(chǎn)物以及類黑素類物質(zhì)。該反應(yīng)在食品的加工和儲(chǔ)存過程中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)食品的色澤，風(fēng)味和營養(yǎng)成分等都有重要的影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在生物體內(nèi)也存在美拉德反應(yīng)，反應(yīng)的產(chǎn)物與人類的衰老，糖尿病并發(fā)癥等病癥有密切的關(guān)系，從而受到廣泛的關(guān)注。
[0003]酮胺氧化酶( fructosylamine oxidases,縮寫為FAOXs)是一類存在于微生物體內(nèi)的去糖基化酶，可以催化降解Amadori產(chǎn)物，通常生成氨基化合物、葡糖醛酮和過氧化氫。在該酶發(fā)現(xiàn)之初，最先應(yīng)用于糖尿病的檢測，目前基于FAOXs的檢測已經(jīng)成為糖尿病檢測和診斷中的一項(xiàng)“金指標(biāo)”。同時(shí)，這類蛋白酶在食品質(zhì)量控制，洗滌劑添加劑以及糖尿病治療等方面也展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景。但是，目前已知的酮胺氧化酶都只能作用于小分子底物，如糖基化氨基酸或是糖基化二肽，這也極大地限制了該酶的應(yīng)用。
[0004]來源于煙曲霉Aspergillus fumigatus 的酮胺氧化酶 AmadoriaseII于1997年首次被分離，可以直接作用于一種較大分子量的底物糖基化金剛烷胺(fructosyl-adamantanamine)。該酶的晶體結(jié)構(gòu)在2008年被報(bào)道，晶體結(jié)構(gòu)顯示，在該酶表面有兩個(gè)柔性的Loop區(qū)域(氨基酸殘基序列自N末端第58-66位的殘基區(qū)域以及第110-119位的殘基區(qū)域)，位于底物通道入口附近，在底物結(jié)合過程起到重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了一組酮胺氧化酶，是如下(a)至(P)中的任意一種:(a)由序列表中序列3自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(c)由序列表中序列5自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(d)由序列表中序列5所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；Ce)由序列表中序列7自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(f)由序列表中序列7所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(g)由序列表中序列9自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(h)由序列表中序列9所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(i)由序列表中序列11自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(j)由序列表中序列11所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(k)由序列表中序列13自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(I)由序列表中序列13所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(m)由序列表中序列15自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(η)由序列表中序列15所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(ο)由序列表中序列17自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(P)由序列表中序列17所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
[0007]編碼所述酮胺氧化酶的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因?yàn)槿缦翴)至26)中任一所述的DNA分子:1)編碼區(qū)如序列表中序列4自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；2)編碼區(qū)如序列表中序列4自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；
3)編碼區(qū)如序列表中序列4所示的DNA分子；4)編碼區(qū)如序列表中序列6自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；5)編碼區(qū)如序列表中序列6自5’末端第I至1344位核苷酸所不的DNA分子；6)編碼區(qū)如序列表中序列6所不的DNA分子；7)編碼區(qū)如序列表中序列8自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；8)編碼區(qū)如序列表中序列8自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；9)編碼區(qū)如序列表中序列8所示的DNA分子；10)編碼區(qū)如序列表中序列10自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；11)編碼區(qū)如序列表中序列10自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；12)編碼區(qū)如序列表中序列10所示的DNA分子；13)編碼區(qū)如序列表中序列12自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；14)編碼區(qū)如序列表中序列12自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；15)編碼區(qū)如序列表中序列12所示的DNA分子；16)編碼區(qū)如序列表中序列14自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；17)編碼區(qū)如序列表中序列14自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；18)編碼區(qū)如序列表中序列14所示的DNA分子；19)編碼區(qū)如序列表中序列16自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；20)編碼區(qū)如序列表中序列16自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；21)編碼區(qū)如序列表中序列16所示的DNA分子；22)編碼區(qū)如序列表中序列18自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；23)編碼區(qū)如序列表中序列18自5’末端第I至1344位核苷酸所不的DNA分子；24)編碼區(qū)如序列表中序列18所不的DNA分子；25)在嚴(yán)格條件下與I)至24)中任一限定的DNA序 列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；26)與I)至24)中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC, 0.5%SDS 的溶液中，在 65。C 下雜交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
[0008]含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。所述的重組載體具體可為將所述基因插入pEAS-la質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌具體可為將所述重組載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到的重組菌。
[0009]本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白質(zhì)在制備酮胺氧化酶中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白質(zhì)在降解糖基化底物中的應(yīng)用。所述糖基化底物具體可為糖基化多聚賴氨酸或糖基化金剛烷胺。本發(fā)明還保護(hù)所述重組菌在生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。[0010]應(yīng)用所述重組菌制備所述蛋白質(zhì)時(shí)，可采用如下方法:將所述重組菌進(jìn)行發(fā)酵，收集發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)物中即含有所述蛋白質(zhì)。所述方法具體包括如下步驟:(I)將所述重組菌培養(yǎng)至OD6tltlnm為0.5時(shí)加入IPTG并使其濃度為0.5mM,繼續(xù)30°C、250rpm培養(yǎng)6小時(shí)，收集菌體；(2)將步驟(1)得到的菌體進(jìn)行超聲破碎，收集上清液；(3)將步驟(2)得到的上清液上樣于結(jié)合Ni2+的HiTrapTM Chelating HP柱，先用洗脫液甲(含500mM氯化鈉和30mM咪唑的20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)去除雜蛋白，然后用洗脫液乙(含500mM氯化鈉和400mM咪唑的20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)洗脫目的蛋白，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為含有所述蛋白質(zhì)的溶液。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白質(zhì)作為酮胺氧化酶的應(yīng)用。
[0012]與現(xiàn)有的酮胺氧化酶相比，本發(fā)明提供的各個(gè)酮胺氧化酶的酶活性大大提高，具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0015]pUC18-cI857/pR-SRRz_rrnB質(zhì)粒，簡稱pEAS-la質(zhì)粒，是一種熱誘導(dǎo)自裂解質(zhì)粒。提及 pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB 質(zhì)粒的參考文獻(xiàn):Xu, L., et al., Heat-1nducibleautolyticvector for high-throughput screening.BioTechniques, 2006.41(3):p.319-322.。
[0016]大腸桿菌BL21:購自 Novagen。
[0017]野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII由序列表的序列I自N末端第I至438位氨基酸殘基組成。野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII基因的編碼區(qū)如序列表的序列2自5’末端第I至1314位核苷酸所示。
[0018]實(shí)施例1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0019]一、重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 的構(gòu)建
[0020]1、合成序列表的序列2自5’末端第I至1314位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。
[0021]2、將步驟I合成的雙鏈DNA分子作為模板，用AMA-for和CT_AMA-rev組成的引物對(duì)，采用高保真的De印Vent' DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022]AMA-for:5’ -AGAGGGATCCGATGGCGGTAACCAAGTCA-3，(其中下劃線部分為 BamHI 內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn))；
[0023]CT-AMA-rev:
[0024]5，-ATTCCTGCAGTTA |；Τ(；(；Τ(；(；?(；(；Τ(；(；Τ(；(?Τ(| GGAAGCAGCTCCTAACTTGGAAATATCTC-3，
(其中下劃線部分為PstI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，方框內(nèi)是HiS6S簽的編碼序列，粗體表示連接肽)。[0025]3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Pst I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0026]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0027]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII(野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII基因的表達(dá)載體)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1o
[0028]二、重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII (V113F)的構(gòu)建
[0029]1、以重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII為模板，用ΕΡ-for和V113F_rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0030]EP-for:5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0031 ] V113F-rev:5’ -CCGGGCCTAAAACGGACTCCAAGGCGGTCCA-3，。
[0032]2、以重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII為模板，用V113F_for和ΕΡ-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0033]V113F-for: 5’ -GGAGTCCGTTTTAGGCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3’ ；
[0034]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0035]3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0036]EP-for和EP-rev分別對(duì)應(yīng)于重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII中序列2所示雙鏈DNA分子的上游和下游。
[0037]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0038]5、用限制性內(nèi)切酶BmHI和PstI雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0039]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (V113F)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII (V113F)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列4的差異僅在于將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5’末端第337-339位核苷酸由“gtc”突變?yōu)榱恕癟TT”。序列表的序列4所示的DNA分子編碼序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相比，序列表的序列3的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱恕癋”。將序列表的序列3自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0040]三、重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F)的構(gòu)建
[0041]1、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112F_V113F_rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0042]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0043]R112F-V113F-rev:5’ -GGTCCTCACCGGGCCTAAAAAAGACTCCAAGGCGGTCCA-3’。
[0044]2、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112F_V113F-for 和 EP-rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。[0045]R112F-V113F-for: 5’ -TTGGACCGCCTTGGAGTCTTTTTTAGGCCCGGTGAGGA-3’ ；
[0046]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0047]3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0048]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0049]5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS-la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0050]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112F-V113F)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列6的差異僅在于將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5’末端第334-339位核苷酸由“cgt gtc”突變?yōu)榱?“TTT T TT”。序列表的序列6所示的DNA分子編碼序列表的序列5所示的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相比，序列表的序列5的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第112位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱?“F”，第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱?“F”。將序列表的序列5自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為R112F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII ο
[0051]四、重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112V-V113F)的構(gòu)建
[0052]1、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112V_V113F_rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0053]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0054]R112V-V113F-rev:5’ -GGTCCTCACCGGGCCTAAACACGACTCCAAGGCGGTCCA-3’。
[0055]2、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112V_V113F-for 和 EP-rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0056]R112V-V113F-for: 5’ -TTGGACCGCCTTGGAGTCGTGTTTAGGCCCGGTGAGGA-3’ ；
[0057]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0058]3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0059]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0060]5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Pst I雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0061]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112V-V113F)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112V-V113F)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamH I和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列8的差異僅在于將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5’末端第334-339位核苷酸由“cgt gtc”突變?yōu)榱恕癎TG TTT”。序列表的序列8所不的DNA分子編碼序列表的序列7所不的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相比，序列表的序列7的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第112位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱?“V”，第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱?“F”。將序列表的序列7自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為R112V-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII ο
[0062] 五、重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F)的構(gòu)建
[0063]1、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112W-V113F - rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0064]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0065]R112W-V113F - rev:5’-GGTCCTCACCGGGCCTAAACCAGACTCCAAGGCGGTCCA-3’。
[0066]2、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112W_V113F-for 和 EP-rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0067]R112ff-V113F-for: 5’ -TTGGACCGCCTTGGAGTCTGGTTTAGGCCCGGTGAGGA-3’ ；
[0068]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0069]3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0070]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0071]5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0072]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII(R112W-V113F)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列10所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列10的差異僅在于將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5’末端第334-339位核苷酸由“cgt gtc”突變?yōu)榱?“TGG TTT”。序列表的序列10所不的DNA分子編碼序列表的序列9所不的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相t匕，序列表的序列9的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第112位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱?“W”，第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱?“F”。將序列表的序列9自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0073]六、重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F-R114S)的構(gòu)建
[0074]1、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112F_V113F-R114S_rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0075]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0076]R112F-V113F-R114S-rev:5’-TTGGGGTCCTCACCGGGAGAAAAAAAGACTCCAAGGCGGTCCAA-3，。
[0077]2、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112F_V113F-R114S-for 和 EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0078]R112F-V113F-R114S-for: 5’ -CTTGGAGTCTTTTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3’ ；
[0079]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0080]3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0081]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0082]5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS-la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0083]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F-R114S)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112F-V113F-R114S)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列12所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列12的差異僅在于將序列表的序列2所不雙鏈DNA分子自5’末端第334-342位核苷酸由“cgtgtc agg”突變?yōu)榱恕癟TTTTT TCT”。序列表的序列12所示的DNA分子編碼序列表的序列11所示的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相比，序列表的序列11的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第112位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱?“F”，第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱恕癋”，第114位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱恕癝”。將序列表的序列11自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為R112F-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0084]七、重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAI I (R112W-V113F-R114S)的構(gòu)建
[0085]1、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112W-V113F-R114S_rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0086]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0087]R112ff-V113F-R114S-rev:5’-TTGGGGTCCTCACCGGGAGAAAACCAGACTCCAAGGCGGTCCAA-3，。
[0088]2、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112W_V113F-R114S-for 和 EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0089]R112ff-V113F-R114S-for: 5’ -CTTGGAGTCTGGTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3’ ；
[0090]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0091 ] 3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0092]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Pst I雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0093]5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Pst I雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0094]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F-R114S)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112W-V113F-R114S)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamHI和Pst I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列14所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列14的差異僅在于將序列表的序列2所不雙鏈DNA分子自5’末端第334-342位核苷酸由“cgtgtc agg”突變?yōu)榱恕癟GGTTT TCT”。序列表的序列14所示的DNA分子編碼序列表的序列13所示的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相比，序列表的序列13的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第112位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱?“W”，第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱恕癋”，第114位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱恕癝”。將序列表的序列13自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。 [0095]八、重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112Y-V113F-R114S)的構(gòu)建
[0096]1、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112Y_V113F-R114S_rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。[0097]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0098]Rl 12Y-V113F-R114S-rev:5’ -GGGTCCTCACCGGGAGAAAAATAGACTCCAAGGCGGTCCA-3’。
[0099]2、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112Y_V113F-R114S-for 和 EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0100]R112Y-V113F-R114S-for:5’-CGCCTTGGAGTCTATTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3，；
[0101]EP-rev: 5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0102]3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0103]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0104]5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Pst I雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。 [0105]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112Y-V113F-R114S)。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112Y-V113F-R114S)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pEAS-la質(zhì)粒的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列16所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列16的差異僅在于將序列表的序列2所不雙鏈DNA分子自5’末端第334-342位核苷酸由“cgtgtc agg”突變?yōu)榱恕癟ATTTT TCT”。序列表的序列16所示的DNA分子編碼序列表的序列15所示的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相比，序列表的序列15的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第112位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱?“Y”，第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱恕癋”，第114位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱恕癝”。將序列表的序列15自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0106]九、重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII (N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S)的構(gòu)建
[0107]1、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 N63D_K64Q-rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0108]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0109]N63D-K64Q-rev:5’ -CTCAATTTCGTCCTGATCGTTGCTATATTGGCCGGAGGAGAT-3’。
[0110]2、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 N63D_K64Q-for 和 EP-rev 組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0111]N63D-K64Q-for: 5’ -GGCCAATATAGCAACGATCAGGACGAAATTGAGGTCAACGAGATTCT-3’ ；
[0112]EP-rev: 5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0113]3、同時(shí)將步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0114]4、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0115]5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0116]6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (N63D-K64Q)。
[0117]7、以重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII (N63D-K64Q)為模板，用 EP-for 和R112ff-V113F-R114S-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0118]EP-for: 5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0119]R112ff-V113F-R114S-rev:5’-TTGGGGTCCTCACCGGGAGAAAACCAGACTCCAAGGCGGTCCAA-3，。
[0120]8、以重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII(N63D-K64Q)為模板，用 Rl 12W-V113F-R114S-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0121 ] R112W-V113F-R114S-for:5’ -CTTGGAGTCTGGTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3’ ；
[0122]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0123]9、同時(shí)將步驟7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟8的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0124]10、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切步驟9的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0125]11、用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質(zhì)粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0126]12、將步驟10的酶切產(chǎn)物和步驟11的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (N6 3D-K64Q-R112W-V113F-R114S)? 根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII ((N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S))進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在 pEAS-la 質(zhì)粒的BamHI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列18所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列18的差異僅在于將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5’末端第187-192位核苷酸由“aac aag”突變?yōu)榱?“GAT CAG”，第334-342位核苷酸由“cgtgtc agg”突變?yōu)榱恕癟GGTTT TCT”。序列表的序列18所示的DNA分子編碼序列表的序列17所示的蛋白質(zhì)。與序列表的序列I相比，序列表的序列17的差異僅在于將序列表的序列I自N末端第63位氨基酸殘基由“N”突變?yōu)榱恕癉”，第64位氨基酸殘基由“K”突變?yōu)榱恕癚”，第112位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱恕癢”，第113位氨基酸殘基由“V”突變?yōu)榱恕癋”，第114位氨基酸殘基由“R”突變?yōu)榱恕癝”。將序列表的序列17自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)命名為N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0127]實(shí)施例2、酮胺氧化酶AmadoriaseII的制備
[0128]一、野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII的制備
[0129]1、將重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAI I導(dǎo)入大腸桿菌BL21，得到重組菌。
[0130]2、將步驟I得到的重組菌的單菌落接種于15ml含50 μ g/ml氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基，30°C、250rpm過夜培養(yǎng)。
[0131]3、將步驟2得到的培養(yǎng)體系以1:40的體積比接種于400ml含有50 μ g/ml氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基；30°C、250rpm培養(yǎng)至OD6tltlnm為0.5時(shí)加入IPTG并使其濃度為0.5mM,繼續(xù)30°C、250rpm培養(yǎng)；從加入IPTG開始計(jì)時(shí)，6小時(shí)后收集菌體。
[0132]4、將步驟3得到的菌體進(jìn)行超聲破碎(超聲破碎功率200W，超聲4秒停3秒，共99次)，然后15000rpm離心25min,收集上清液。
[0133]5、用0.22 μ m低蛋白質(zhì)結(jié)合的濾膜過濾步驟4得到的上清液，收集濾液。
[0134]6、取步驟5得到的濾液,利用蛋白純化設(shè)備(:ΑΚΤΑ explorerTM station),上樣至已結(jié)合 Ni2+的 HiTrapTM Chelating HP 柱(購自安瑪西亞(Amersham Biosciences,體積lmL)，先用15ml洗脫液甲(含500mM氯化鈉和30mM咪唑的20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)去除雜蛋白，然后用3ml洗脫液乙(含500mM氯化鈉和400mM咪唑的20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)洗脫目的蛋白，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0135]二、V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII的制備
[0136]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (V113F)代替重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為Vl 13F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0137]三、Rl 12F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII的制備
[0138]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F)代替重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為R112F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有R112F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0139]四、Rl 12V-V113F型麗胺氧化酶AmadoriaseII的制備
[0140]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112V-V113F)代替重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為R112V-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有R112V-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0141]五、R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII的制備 [0142]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F)代替重組質(zhì)粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0143]六、Rl12F-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 的制備
[0144]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F-R114S)代替重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAI I，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為Rl 12F-V113F-R114S型酮胺氧化酶Amadoriasell蛋白液(含有Rl 12F-V113F-R114S型酮胺氧化酶Amadoriasell和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0145]七、Rl12W-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 的制備
[0146]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII (R112W-V113F-R114S)代替重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為R112W-V113F-R114S型麗胺氧化酶AmadoriaseI I蛋白液(含有Rl 12W-V113F-R114S型麗胺氧化酶AmadoriaseI I和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0147]八、Rl12Y-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 的制備
[0148]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII (R112Y-V113F-R114S)代替重組質(zhì)粒pEAS-la-CTAMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有Rl 12Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0149]九、N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶 Amadoriase II 的制備
[0150]用重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII (N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S)代替重組質(zhì)粒pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱后溶液，即為 N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 Amadoriase II 蛋白液(含有N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 和 His 標(biāo)簽的融合蛋白)。
[0151]實(shí)施例3、酮胺氧化酶Amadoriase II的酶活
[0152]—、糖基化模式底物的制備
[0153]1、糖基化多聚賴氨酸的制備
[0154]按照摩爾比5:6稱取多聚賴氨酸混合物(購自Sigma-Aldrich,產(chǎn)品目錄號(hào)為P8954-500MG ;每個(gè)聚賴氨酸分子含有3_13個(gè)賴氨酸)和葡萄糖，加入200mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中，葡萄糖的終濃度為0.75M，混合均勻后60°C水浴6小時(shí)，得到糖基化產(chǎn)物(含有糖基化多聚賴氨酸)。
[0155]2、糖基化金剛烷胺的制備
[0156]按照摩爾比5:6稱取金剛烷胺(購自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品目錄號(hào)為A1260-5G)和葡萄糖，加入水中，葡萄糖的終濃度為0.75M，通過滴加IM的氫氧化鈉溶液促使金剛烷胺溶解，混合均勻后121°C反 應(yīng)15分鐘，得到糖基化金剛烷胺。
[0157]二、酮胺氧化酶的酶活測定
[0158]1、制備反應(yīng)液
[0159]取2.7個(gè)紅掊酹單位(purpurogallin unit)的辣根過氧化物酶,0.45mM的4-氨基安替比林,0.5mM的N-乙基-N-(2-羥基_3_磺丙基)-m_甲苯胺(N_ethy 1_N_(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine)和100 μ I糖基化底物(即步驟一的I得到的體系或步驟一的2的得到的體系)，溶于3mlIOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)。
[0160]2、制備蛋白稀釋液
[0161]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的野生型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液稀釋至50倍體積,得到野生型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0162]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積,得到V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0163]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的R112F-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112F-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0164]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的R112V-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase I I蛋白液稀釋至50倍體積,得到R112V-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0165]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的R112W-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112W-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0166]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的R112F-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112F-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。[0167]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。
[0168]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。
[0169]用IOOmM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)將實(shí)施例2制備的N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。
[0170]3、蛋白濃度測定
[0171]分別檢測步驟2得到的各個(gè)蛋白稀釋液中的蛋白濃度，具體方法如下:
[0172]檢測280nm處的光吸收值，然后按照下式計(jì)算:
[0173]蛋白濃度(mg/ml)=A280/( ε Xb)；
[0174]A28tl—蛋白稀釋液在280nm處的光吸收值山一光程，cm ； ε 一消光系數(shù)。
[0175]消光系數(shù)，可按照下式計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)至(P)中的任意一種: Ca)由序列表中序列3自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列3所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (c)由序列表中序列5自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (d)由序列表中序列5所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； Ce)由序列表中序列7自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (f)由序列表中序列7所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (g)由序列表中序列9自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (h)由序列表中序列9所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (i)由序列表中序列11自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (j)由序列表中序列11所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (k)由序列表中序列13自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (I)由序列表中序列13所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； Cm)由序列表中序列15自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (η)由序列表中序列15所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (ο)由序列表中序列17自N末端第I至438位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (P)由序列表中序列17所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦翴)至26)中任一所述的DNA分子: 1)編碼區(qū)如序列表中序列4自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 2)編碼區(qū)如序列表中序列4自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 3)編碼區(qū)如序列表中序列4所示的DNA分子； 4)編碼區(qū)如序列表中序列6自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 5)編碼區(qū)如序列表中序列6自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 6)編碼區(qū)如序列表中序列6所示的DNA分子； 7)編碼區(qū)如序列表中序列8自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 8)編碼區(qū)如序列表中序列8自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 9)編碼區(qū)如序列表中序列8所示的DNA分子； 10)編碼區(qū)如序列表中序列10自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 11)編碼區(qū)如序列表中序列10自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 12)編碼區(qū)如序列表中序列10所示的DNA分子； 13)編碼區(qū)如序列表中序列12自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 14)編碼區(qū)如序列表中序列12自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 15)編碼區(qū)如序列表中序列12所示的DNA分子； 16)編碼區(qū)如序列表中序列14自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 17)編碼區(qū)如序列表中序列14自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 18)編碼區(qū)如序列表中序列14所示的DNA分子； 19)編碼區(qū)如序列表中序列16自5’末端第I至1314位核苷酸所不的DNA分子；20)編碼區(qū)如序列表中序列16自5’末端第I至1344位核苷酸所不的DNA分子； 21)編碼區(qū)如序列表中序列16所示的DNA分子； 22)編碼區(qū)如序列表中序列18自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 23)編碼區(qū)如序列表中序列18自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 24)編碼區(qū)如序列表中序列18所示的DNA分子； 25)在嚴(yán)格條件下與1)至24)中任一限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 26)與1)至24)中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所述基因插入pEAS-la質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌為將權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到的重組菌。
7.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在制備酮胺氧化酶中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在降解糖基化底物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述重組菌在生產(chǎn)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)作為酮胺氧化酶的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103937762SQ201310022610
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月22日
【發(fā)明者】林章凜, 錢昱, 鄭靜 申請(qǐng)人:清華大學(xué)