專利名稱：用于鑒定患者是否將是免疫治療的反應(yīng)者的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因表達(dá)譜(gene expression profiles)；用于分類患者的方法；微陣列；和通過使用本文所述的方法和微陣列選出的患者群體的治療。背景黑素瘤是源自表皮中的黑素細(xì)胞的腫瘤?；加羞h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤(根據(jù)美國癌癥聯(lián)合研究會(AJCC)分類為IV期)的患者的平均存活時間是1年，長期存活率僅僅5%。即使用于IV期黑素瘤的標(biāo)準(zhǔn)化療僅僅具有8-25%的治療反應(yīng)率，但對總體存活沒有效果。患有區(qū)域性黑素瘤(III期)的患者平均存活2-3年，具有非常低的長期存活幾率，即使在對原發(fā)和區(qū)域性黑素瘤進(jìn)行足夠的手術(shù)控制后也是如此(Balch等，1992)。大多數(shù)I-III期黑素瘤患者手術(shù)切除了腫瘤，但這些患者仍然保留復(fù)發(fā)的切實危險。因此，仍然需要預(yù)防黑素瘤進(jìn)展，并且需要具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)移性黑素瘤治療方案，以及用于切除了原發(fā)黑素瘤的患者的輔助治療。存在兩類肺癌非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。該名稱僅僅描述了腫瘤中存在的細(xì)胞的類型。NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌并且占肺癌的大約80%。NSCLC難以治愈，并且可獲得的治療傾向于具有盡可能延長生命并且緩解疾病癥狀的目的。NSCLC是最常見的肺癌類型，并且與不良結(jié)局相關(guān)(Gatzmeier等，1994)。在所有NSCLC患者中，僅僅約25%在診斷時具有局部-區(qū)域性疾病并且仍然可以進(jìn)行手術(shù)切除(根據(jù)AJCC分類是IB、IIA或IIB期)。但是，這些患者中50 %以上將在完全手術(shù)切除后兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。因此，需要對這些患者提供更好的治療。常規(guī)化療是基于給患者施用毒性物質(zhì)，并且部分依賴于腫瘤/癌細(xì)胞對毒性劑的積極攝取。這些毒性物質(zhì)不利地影響患者的免疫系統(tǒng)，使得個體身體虛弱并且易患感染。已知并不是所有患者都對當(dāng)前的癌癥治療有反應(yīng)。認(rèn)為僅僅30%或更少的癌癥患者對給定治療有反應(yīng)。不響應(yīng)于治療的癌癥被描述為抗性的。在很多情況下，沒有可靠的方法用于確定患者是否對治療有反應(yīng)。但是，給作為反應(yīng)者和非反應(yīng)者的患者都施用治療(因為他們不能被區(qū)分)是對資源的低效利用，并且甚至更差的是，可能對患者是有損害的，因為如已經(jīng)討論過的，很多癌癥治療具有顯著副作用，如嚴(yán)重的免疫抑制、嘔吐和/或脫發(fā)。認(rèn)為許多情況下，患者在不必要或不是有效的情況下接受了治療。目前很多研究組正在研究基于抗原、肽、DNA等的新一代癌癥治療。許多所述治療后的策略(通常稱作癌癥免疫治療)是刺激患者的免疫系統(tǒng)對抗癌。這些治療可能是有利的，因為預(yù)期使用這些治療的副作用與目前進(jìn)行癌癥治療的患者經(jīng)受的副作用相比是最小的。用于癌癥免疫治療的抗原可以稱作ASCI，它是抗原特異性的免疫治療。在二十世紀(jì)八十年代早期，Van Pel和Boon公開了針對呈遞在腫瘤細(xì)胞上的抗原的溶胞性T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。這導(dǎo)致表征了第一個腫瘤特異性的共有抗原黑素瘤AGE-1(MAGE-1，隨后重新指定為MAGE-A1)。隨后鑒定了許多共有相同表達(dá)模式的基因它們在廣泛腫瘤類型(如黑素瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌)中表達(dá)。它們不在正常細(xì)胞(除睪丸外)中表達(dá)。但是，睪丸中的該表達(dá)通常不導(dǎo)致抗原表達(dá)，因為這些生殖系細(xì)胞不表達(dá)MHC I類分子。從它們的特定表達(dá)譜，給這些基因提出了癌睪丸(CT)基因的名稱。MAGE抗原是由黑素瘤相關(guān)抗原基因(MAGE)家族編碼的抗原。MAGE基因主要在黑素瘤細(xì)胞(包括惡性黑素瘤)上表達(dá)，并且一些其它癌癥，包括NSCLC (非小細(xì)胞肺癌)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、膀胱移行細(xì)胞癌和食道癌，但不能在除睪丸和胎盤的正常組織上檢測到(Gaugler 等，Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanomaby autologous cytolytic T lymphocytes J Exp Med. 1994 Mar 1 ； 179(3) :921-930)；Weynants 等，Expression of mage genes by non-small-cell lung carcinomas Int. JCancer. 1994 Mar 15 ；56 (6) :826-829, Patard 等，Int J. Cancer 64:60,1995)。MAGE-A3在60%的黑素瘤中表達(dá)(Gaugler，1994)，并且也可以在44%的NSCLCaoshimatsu 1988)，48%的頭頸鱗狀細(xì)胞癌，34%的膀胱移行細(xì)胞癌，57%的食道癌，32%的結(jié)腸癌和的乳腺癌中檢測至 1J (Van Pel，等，Genes coding for tumor antigens recognized by cytolyticT lymphocytes Immunological Reviews 145,229-250,1995,1995.) ；Inoue 1995 ；Fujie1997 ；Nishimura 1997)。表達(dá)MAGE蛋白的癌癥也稱作Mage相關(guān)腫瘤。最近進(jìn)行了大量工作，用于輔助癌癥患者的診斷和預(yù)后，例如，鑒定不需要進(jìn)一步治療的患者，因為他們沒有疾病轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或進(jìn)展的危險。WO 2006/124836鑒定了一些致癌途徑上的某些基因表達(dá)標(biāo)記，從而定義患者的預(yù)后和對靶定這些途徑的治療劑的敏感性。特定的癌基因是Myc、Ras, E2、S3、Src和β -連環(huán)蛋白。US 2006/(0265138公開了建立基因譜的方法，一般地用于鑒定原發(fā)腫瘤，從而可以施用合適的治療。US 2006/0Μ0441和US 2006/0252057描述了基于某些基因的差別表達(dá)診斷肺癌
的方法。US 2006/0234259涉及鑒定和使用與前列腺癌相關(guān)的某些基因表達(dá)譜。WO 2006/103442描述了在一個雌激素受體(ER)陽性腫瘤子集中表達(dá)的基因譜，其作為對某些激素治療如他莫昔芬以及某些化療的反應(yīng)的預(yù)測性標(biāo)記。
WO 2006/093507描述了用于將結(jié)直腸癌癥患者表征為具有良好預(yù)后或不良預(yù)后的基因譜，其中具有良好預(yù)后的患者適于化療。WO 2006/0擬610描述了基于某些基因的差別表達(dá)和疾病的新標(biāo)志物，(特別是TSBYl、CYBA和MT2A)而監(jiān)測黑素瘤進(jìn)展的方法。WO 2005/0498 描述了一組分離的標(biāo)記基因，其可以用于預(yù)測某些癌癥對化療劑的敏感性，所述化療劑是erbB受體激酶抑制劑，如吉非替尼(gefitinib)。已經(jīng)證實，微陣列基因繪譜(gene profiling)是用于預(yù)測癌癥患者是否會對治療做出反應(yīng)或用于評估疾病的預(yù)后(不論任何治療性干預(yù))的有力技術(shù)。許多大規(guī)模臨床試驗?zāi)壳罢谶M(jìn)行中，以驗證被認(rèn)為與乳腺癌和濾泡淋巴瘤的不同預(yù)后有關(guān)的譜(Dave，2004 ；Hu, 2006 ；Weigelt, 2005)。細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)表達(dá)數(shù)百種甚至數(shù)千個基因。對治療做出反應(yīng)的患者相對于不做出反應(yīng)的患者的基因差別表達(dá)，可能實現(xiàn)針對可能做出反應(yīng)的患者的治療的特異性定制(specific tailoring)。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明提供了一種將患者分類為適當(dāng)免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法，所述方法包括下述步驟(a)測定患者來源的樣品中一個或多個基因的表達(dá)水平，其中所述基因選自表1 ；(b)基于(a)的表達(dá)水平，使用算法(其參數(shù)由訓(xùn)練集定義)，將所述患者分類為反應(yīng)者或非反應(yīng)者組。在一個方面，本發(fā)明提供了一種將患者表征為治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法，所述方法包括下述步驟(a)分析患者來源的樣品中表1的一個或多個基因的基因產(chǎn)物的差別表達(dá)，和(b)基于步驟(a)的結(jié)果，將樣品的來源患者表征為反應(yīng)者或非反應(yīng)者，其中通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用算法(其參數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到)，進(jìn)行所述表征步
馬聚ο在一個實施方案中，提供了一種治療患者的方法，其中得到患者來源的樣品中表1的一個或多個基因的基因產(chǎn)物的差別表達(dá)的分析結(jié)果。所述結(jié)果將患者表征為免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者，且通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用算法(其參數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到)，進(jìn)行所述表征步驟。如果所述患者被表征為免疫治療的反應(yīng)者，則選擇所述患者進(jìn)行適當(dāng)免疫治療的至少一種施用。在一個實施方案中，提供了一種測定患者是否是免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法，其中得到患者來源的樣品，并分析患者來源的樣品中表1的一個或多個基因的基因產(chǎn)物的差別表達(dá)。所述結(jié)果確定所述患者是否被表征為免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者，且通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用算法(其參數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到)，進(jìn)行所述表征步驟。在一個實施方案中，步驟(b)是基于數(shù)學(xué)判別函數(shù)或決策樹。所述決策樹可能包含至少一個二變量分類步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種將患者表征為治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法，所述方法包括分析患者來源的樣品中被表1中列出的一個或多個探針集合(它們的靶序列顯示在表3中)識別的基因產(chǎn)物，其中通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用算法(其參數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到)，進(jìn)行所述表征步驟。在一個示例性的實施方案中，表1的一個或多個基因或探針集合是在表1中列出的至少63個基因或在表1中列出的至少74個探針集合。在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明的方法包括測定所述基因的表達(dá)水平，或測量在表2、5、7或9中指出的探針集合的基因產(chǎn)物。在這些表中的每個基因和探針集合以及基因或探針集合的組，形成本發(fā)明的具體方面。在表2、5、7和9中的基因和探針集合代表在表1中的基因和探針集合的具體子集。也提供了一種預(yù)示性基因譜，其可以用于區(qū)分MAGE-A3ASCI或任何免疫治療方案的反應(yīng)者患者和非反應(yīng)者患者，其中所述譜包含一個或多個選自下述的基因在表1中列出的基因。在一個實施方案中，提供了本文所述的基因譜，其中所述基因是在表1中列出的探針集合所識別的基因。在另一個方面，譜包含在表1中列出的所有基因或由其組成，或者包含在表1中列出的探針集合所識別或靶向的所有基因或由其組成。在一個方面，本發(fā)明提供了一種包含多核苷酸探針的微陣列，所述多核苷酸探針與至少一個基因的基因產(chǎn)物的序列互補且可雜交，所述基因選自在表1中列出的基因，其中與表1的基因互補且可雜交的多核苷酸探針或探針集合構(gòu)成在所述微陣列上的至少50%的探針或探針集合。在一個方面，本發(fā)明提供了一種包含多核苷酸探針的微陣列，所述多核苷酸探針與至少一個基因的基因產(chǎn)物的序列互補且可雜交，所述基因選自在表1中列出的基因。在一個方面，本發(fā)明提供了一種固體表面，與其連接了在表1中列出的至少63個基因的多種檢測劑，所述檢測劑能夠檢測所述基因的表達(dá)或由所述基因編碼的多肽。在一個方面，本發(fā)明提供了一種診斷試劑盒，其包含用于檢測在表1中列出的一個或多個基因或在表1中列出的基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)的裝置。借助于與mRNA或cDNA基因產(chǎn)物雜交的探針，可以檢測所述表達(dá)。在一個方面，本發(fā)明提供了一種或多種探針，所述探針用于鑒定下述物質(zhì)的基因產(chǎn)物(例如mRNA或cDNA)表1的一個或多個基因，或在表1中列出的基因的基因產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明提供了 PCR(或其它已知的技術(shù))用于鑒定表1的一種或多種基因產(chǎn)物或本文所述的基因譜的基因產(chǎn)物的差別表達(dá)(諸如增量調(diào)節(jié))的用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療患者的方法，所述患者被表征為治療的反應(yīng)者，所述方法包括給所述患者施用本文所述的治療、疫苗或免疫原性的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療患者的方法，根據(jù)本文所述的方法或使用本文所述的診斷試劑盒，所述患者被表征為治療的非反應(yīng)者，所述方法包括施用替代治療或治療組合，例如可以使用化療和/或放療，以替代或添加給本文所述的疫苗或免疫原性的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含腫瘤相關(guān)抗原的組合物在制備藥劑中的用途，所述藥劑用于治療根據(jù)本文所述的方法被表征為反應(yīng)者的患者，本文所述的微陣列的用途，本文所述的基因譜的用途，或本文所述的診斷試劑盒的用途。


圖 1/21 顯示了留出一個交叉驗證(Leave One Out Cross Validation,L00CV)的方案。圖2/21顯示了 L00CV的結(jié)果，所述L00CV選擇最好的100個PS用于每個循環(huán)的分類?？招膱A圈=非反應(yīng)者，AS02B組。實心圓圈=反應(yīng)者，AS02B組?？招娜切?非反應(yīng)者，AS15組。實心三角形=反應(yīng)者，AS15組。圖3/21顯示了探針集合(PS)在每個L00CV (PS編號在X軸上)中的100個最高s2n(信噪比)內(nèi)的次數(shù)。圖4/21顯示了所有患者在II期黑素瘤試驗中通過佐劑得到的總存活數(shù)的卡普蘭-邁耶曲線(KM)。實線=AS15組。虛線=AS02B組。圖5/21顯示了通過基于L00CV分類的基因標(biāo)記得到的總存活數(shù)的KM。實線=基因標(biāo)記陽性的(GS+)；虛線=基因標(biāo)記陰性的(GS-)。圖6/21顯示了通過佐劑和通過基于L00CV分類的基因標(biāo)記得到的總存活數(shù)卡普蘭-邁耶曲線。粗實線=AS15組，GS+。粗虛線=AS15組，GS-。細(xì)實線=AS02B組，GS+。細(xì)虛線=AS02B組，GS-。圖7/21顯示了使用100個PS對樣品的分類(不留出一個)?？招膱A圈=非反應(yīng)者，AS02B組。實心圓圈=反應(yīng)者，AS02B組?？招娜切?非反應(yīng)者，AS15組。實心三角形=反應(yīng)者，AS15組。圖8/21顯示了對應(yīng)樣品的留出一個分類，其中使用通過在表5中指出的PCR測得的22個基因。空心圓圈=非反應(yīng)者，AS02B組。實心圓圈=反應(yīng)者，AS02B組?？招娜切?非反應(yīng)者，AS15組。實心三角形=反應(yīng)者，AS15組。圖9/21顯示了使用在表5中指出的22個基因?qū)悠返姆诸?不留出一個)?？招膱A圈=非反應(yīng)者，AS02B組。實心圓圈=反應(yīng)者，AS02B組。空心三角形=非反應(yīng)者，AS15組。實心三角形=反應(yīng)者，AS15組。圖10/21顯示了 NSCLC II期試驗設(shè)計。圖11/21顯示了 NSCLC試驗的無疾病期間的KM曲線。具有圓形的實線=MAGE_A3 ；具有正方形的虛線=安慰劑。圖12/21顯示了在本申請的實施例中使用的Cox-SPCA方法學(xué)。圖13/21顯示了基于L00CV分類的基因譜的存活曲線，其中使用中位值作為截止，使用通過PCR測得的在表6中列出的23個基因。粗實線=MAGE免疫治療，GS+。粗虛線=MAGE免疫治療，GS-。細(xì)實線=安慰劑，GS+。細(xì)虛線=安慰劑，GS-。圖14/21顯示了在1 個NSCLC樣品的安慰劑組(左側(cè)圖)和疫苗組(右側(cè)圖)中的風(fēng)險評分分布，其中使用通過PCR測得的在表6中列出的23個基因，使用L00CV分類。實心菱形=復(fù)發(fā)；空心菱形=不復(fù)發(fā)。圖15/21顯示了基于分類的臨床結(jié)果，其中在分類器中使用通過Q-PCR得到的在表6中列出的23個基因(不留出一個)。粗實線=MAGE免疫治療，GS+。粗虛線=MAGE免疫治療，GS-。細(xì)實線=安慰劑，GS+。細(xì)虛線=安慰劑，GS-。
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圖16/21顯示了在安慰劑組(左側(cè)圖)和疫苗組(右側(cè)圖)中的風(fēng)險評分，這基于在分類器中使用通過Q-PCR得到的在表6中列出的23個基因的分類(不留出一個)。實心菱形=復(fù)發(fā)；空心菱形=不復(fù)發(fā)。圖17/21顯示了 1 個NSCLC樣品基于LOOCV分類的基因譜的存活曲線，其中使用中位值作為截止，使用在表5中列出的22個基因。粗實線=MAGE免疫治療，GS+。粗虛線=MAGE免疫治療，GS-。細(xì)實線=安慰劑，GS+。細(xì)虛線=安慰劑，GS-。圖18/21顯示了在1 個NSCLC樣品的安慰劑組(左側(cè)圖)和疫苗組(右側(cè)圖)中的風(fēng)險評分分布，其中使用通過LOOCV分類測得的在表5中列出的22個基因。實心菱形=復(fù)發(fā)；空心菱形=不復(fù)發(fā)。圖19/21顯示了基于分類的臨床結(jié)果，其中在分類器中使用通過Q-PCR得到的在表5中列出的22個基因(不留出一個)。粗實線=MAGE免疫治療，GS+。粗虛線=MAGE免疫治療，GS-。細(xì)實線=安慰劑，GS+。細(xì)虛線=安慰劑，GS-。圖20/21顯示了基于分類的風(fēng)險評分，其中在分類器中使用通過Q-PCR得到的在表5中列出的22個基因(不留出一個)。實心菱形=復(fù)發(fā)；空心菱形=不復(fù)發(fā)。圖 21/21 顯示了蛋白 D 1/3-MAGE3-HIS 蛋白。序列標(biāo)識符和表在序列表中包括下面的序列標(biāo)識符SEQ ID NO :1-100-表3所示的探針集合靶序列SEQ ID NO :101-蛋白 D-MAGE-A3 融合蛋白SEQ ID NO 102_106_CpG 寡核苷酸序列SEQ ID NO 107-113-MAGE 肽序列表1 :100個PS和對應(yīng)的基因列表。表IA 使用所有樣品選出的100個PS，和在LOOCV中選出的次數(shù)表2 來自表1的27個PS和21個基因的子集。表3 :100個PS靶序列。表4 :100個PS分類器特征的均值、標(biāo)準(zhǔn)差(Sd)和PC1系數(shù)。表5 黑素瘤中的22個基因的合適子集。表6 黑素瘤中的22個基因分類器特征的均值、標(biāo)準(zhǔn)差(Sd)和PCl系數(shù)。表7 =NSCLC中的23個基因的合適子集。表8 =NSCLC中的23個基因分類器特征的均值、標(biāo)準(zhǔn)差(Sd)和PCl系數(shù)。表9 =NSCLC中的22個基因的合適子集。表10 =NSCLC中的22個基因分類器特征的均值、標(biāo)準(zhǔn)差(Sd)和PCl系數(shù)。表11 通過Q-PCR在黑素瘤樣品中測得的單個基因的分類表現(xiàn)。表12 通過Q-PCR在NSCLC樣品中測得的單個基因的分類表現(xiàn)。表13 通過微陣列在黑素瘤樣品中測得的單個基因的分類表現(xiàn)。
具體實施例方式預(yù)示性基因譜在具有惡性黑素瘤的、進(jìn)行了外科手術(shù)切除的患者的治療前腫瘤組織上的分析，鑒定出在更可能對治療有反應(yīng)的患者(反應(yīng)者)中與在更少可能有反應(yīng)的那些患者(非反應(yīng)者)中差別地表達(dá)的某些基因。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了預(yù)示患者對治療的反應(yīng)的可能性的基因譜?！盎蜃V”是指這樣的基因或基因集合其表達(dá)與患者對治療的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，因為所述基因或基因集合在具有對治療的有利反應(yīng)的患者中和具有對治療的不利反應(yīng)的患者中表現(xiàn)出差別表達(dá)。在本發(fā)明的一個實施方案中，術(shù)語“基因譜”表示在表1中列出的基因或在本文中描述的表1的基因的任何選擇。本文使用的對例如抗癌治療的“有利反應(yīng)”(或“有利的臨床反應(yīng)”)是指，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到的生物反應(yīng)或身體反應(yīng)，所述反應(yīng)指示與用替代治療或不存在任何治療的條件下發(fā)生的腫瘤生長相比，腫瘤生長速度降低。對治療的有利臨床反應(yīng)可以包括受試者經(jīng)歷的癥狀減輕、預(yù)期或?qū)崿F(xiàn)的存活時間增加、腫瘤生長速度降低、腫瘤生長停止(穩(wěn)定的疾病)、轉(zhuǎn)移性病灶的數(shù)目或團塊的消減和/或總體腫瘤團塊的消減(每一項都是與不存在治療或響應(yīng)于替代治療時發(fā)生的情況相比較)。在輔助癌癥治療的情況下，有利的臨床反應(yīng)可以包括沒有復(fù)發(fā)、或復(fù)發(fā)率延遲、或無病存活時間或間隔時間增加。在本發(fā)明的上下文中，“差別表達(dá)”是指，與它的正常表達(dá)相比，基因被增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)。本文別處討論了用于計算基因的差別表達(dá)的統(tǒng)計方法。在某些方面，本發(fā)明提供了用于將患者表征為治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的基因譜，其中所述譜包含表1的至少一個基因的差別表達(dá)，或其中所述譜包含在表1中列出的基因或由其組成。譜可以指示反應(yīng)者或非反應(yīng)者。在一個實施方案中，本文所述的基因譜指示反應(yīng)者。在表3中，列出了被表1的探針集合識別或靶向的基因序列?！氨?的基因”是指，在表1、2、5、7或9的“基因名稱”下列出的基因。“基因產(chǎn)物”是指，基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的任何產(chǎn)物，無論是通過天然的還是人工的方式生成。在本發(fā)明的一個實施方案中，在本文中提及的基因是在表1、2、5、7或9中列出的那些，如在指示“基因名稱”的列中所定義。在另一個實施方案中，在本文中提及的基因是這樣的基因所述基因的產(chǎn)物能夠被在表1中列出的探針集合識別。雖然不希望受到理論的限制，推定在表1中鑒定的基因標(biāo)記實際上指示指定為反應(yīng)者的患者中的免疫/炎癥，如T細(xì)胞浸潤/激活反應(yīng)，例如，該標(biāo)記可能代表T細(xì)胞激活標(biāo)志物。所述標(biāo)記也可能代表Thl標(biāo)志物，包括干擾素途徑的成員，所述成員傾向于偏愛細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。認(rèn)為該反應(yīng)的存在會在施用免疫治療以后輔助患者的身體抵抗疾病，如癌癥，使得患者對所述免疫治療更有反應(yīng)。因此，本發(fā)明的標(biāo)記通常不集中在與相關(guān)疾病(例如癌癥)的診斷和/或預(yù)后特異性相關(guān)的標(biāo)志物/基因，如癌基因，而是預(yù)示患者是否將對合適的免疫治療(如癌癥免疫治療)有反應(yīng)。認(rèn)為本文鑒定的基因譜會指示腫瘤的微環(huán)境。至少在該方面，腫瘤的正確微環(huán)境看起來對于患者是否對合適的癌癥免疫治療有反應(yīng)是關(guān)鍵的。所述標(biāo)記的生物學(xué)與ASCI作用模式有關(guān)，因為它含有這樣的基因所述基因提示特定腫瘤微環(huán)境(趨化因子)的存在，所述微環(huán)境有利于免疫效應(yīng)細(xì)胞在反應(yīng)者患者的腫瘤中的存在，所述患者表現(xiàn)出T-細(xì)胞標(biāo)志物和Thl標(biāo)志物(包括干擾素途徑的成員)的增量調(diào)節(jié)。最近在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的基因表達(dá)繪譜研究揭示，基于T-細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的存在與否，可以分開腫瘤(Harlin，2009)。淋巴細(xì)胞在腫瘤中的存在，與6種趨化因子子集(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、Q(CL9、C)(CL10)的表達(dá)相關(guān)聯(lián)，這 6 個基因中的 3 個(CCL5、CXCL9、CXCL10)存在于表1的100個PS中。在一個實施方案中，本發(fā)明采用在表1中列出的一個或多個(諸如基本上所有的)基因。適當(dāng)?shù)兀景l(fā)明采用在表1中列出的至少63個基因或74個探針集合。適當(dāng)?shù)兀?的一個或多個基因是在表1中列出的至少63個、至少64個、至少65個、至少66個、至少67個、至少68個、至少69個、至少70個、至少71個、至少72個、至少73個、至少74個、至少75個、至少76個、至少77個、至少78個、至少79個、至少80個或基本上所有的基因和/或它們的任意組合。適當(dāng)?shù)?，?的一個或多個探針集合是在表1中列出的至少74個、至少75個、至少76個、至少77個、至少78個、至少79個、至少80個、至少81個、至少82個、至少83個、至少84個、至少85個、至少86個、至少87個、至少88個、至少89個、至少90個或基本上
所有的探針集合和/或它們的任意組合。在基因列表的背景下，“基本上所有的”是給出的列表的基因的至少90%、諸如95%、特別是96%、97%、98%或99%。在一個方面，本發(fā)明用于轉(zhuǎn)移場合。如果基因在認(rèn)為是反應(yīng)者(或非反應(yīng)者)的患者中總是上調(diào)或總是下調(diào)，則一旦建立閾值并且如果兩組的分離程度足夠，該單個基因可以用于確定患者是反應(yīng)者還是非反應(yīng)者。在一個方面，本發(fā)明提供了用于鑒定反應(yīng)者的基因譜，其包含一個或多個所述基因，其中50、60、70、75、80、85、90、95、99或100%的基因被上調(diào)。與此相比，在非反應(yīng)者中，所述一個或多個基因沒有被上調(diào)或下調(diào)。在本發(fā)明的上下文中，樣品可以是源自可能需要治療的患者的任何生物組織或液體的樣品。樣品可以源自痰、血液、尿或來自實體組織，如來自原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤的活檢物，或來自以前切除的組織的切片。樣品可以包含例如針活檢中心、手術(shù)切除樣品或淋巴結(jié)組織，或由它們組成。這些方法包括獲得活檢物，所述活檢物任選通過低溫恒溫器切片進(jìn)行分級分離，從而使腫瘤細(xì)胞富集到總細(xì)胞群的大約80%。在某些實施方案中，可以用本領(lǐng)域公知的技術(shù)擴增從這些樣品提取的核酸。可以檢測選擇的標(biāo)志物的水平，并且可以與統(tǒng)計學(xué)有效組(例如，Mage陽性的非反應(yīng)者患者組)比較。對于與癌癥有關(guān)的分析，將采集生物樣品，使得所述樣品含有癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的機會最大化，并且可以例如源自癌癥或腫瘤，如新鮮樣品(包括冷凍樣品)或在石蠟中保存的樣品。如此，保存在石蠟中的樣品可能會降解，觀察到的譜可能會改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠通過再校準(zhǔn)譜的參數(shù)而補償這些改變。在一個方面，所述生物樣品是活組織檢查樣品，例如來自腫瘤或癌性組織。在一個方面，所述癌癥免疫治療是用于治療黑素瘤、肺癌例如NSCLC、膀胱癌、頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、食管癌和/或前列腺癌，諸如肺癌和/或黑素瘤，尤其是黑素瘤。在本發(fā)明的上下文中，“反應(yīng)者”包括其中癌癥/腫瘤被根除、減少或改善(完全反應(yīng)者或部分反應(yīng)者；混合反應(yīng)者)或僅僅被穩(wěn)定化使得疾病不再進(jìn)展(“穩(wěn)定的疾病”)的人。關(guān)于癌癥的“完全臨床反應(yīng)者”是，其中所有靶病灶消失。關(guān)于癌癥的“部分臨床反應(yīng)者”或“部分反應(yīng)者”是，其中所有腫瘤/癌癥在某種程度上對治療有反應(yīng)，例如其中所述癌癥減少了 30、40、50、60%或更多。“漸進(jìn)性疾病”是指，靶病灶的大小增加了 20%，或出現(xiàn)了一個或多個新病灶，或這
二者兼有?？梢詫⒕哂袧u進(jìn)性疾病(PD)的患者進(jìn)一步分類為具有非混合反應(yīng)的PD或漸進(jìn)性疾病，關(guān)于癌癥的I或II型“混合的臨床反應(yīng)者”或“混合反應(yīng)者”被定義為，其中有些腫瘤/癌癥對治療有反應(yīng)，其它腫瘤/癌癥保持不變或進(jìn)展。非反應(yīng)者(NR)被定義為，沒有混合反應(yīng)的漸進(jìn)性疾病的患者和具有II型混合反應(yīng)的漸進(jìn)性疾病的患者，其沒有表現(xiàn)出至少一種靶病灶的消失。在癌癥穩(wěn)定化的反應(yīng)者中，在穩(wěn)定階段中與不接受治療的患者相比，患者的生活質(zhì)量和/或預(yù)期壽命增加(例如，穩(wěn)定疾病超過6個月)。在有些實施方案中，術(shù)語“反應(yīng)者”可能不包括“混合反應(yīng)者”。通過參照“標(biāo)準(zhǔn)”或訓(xùn)練集，或通過使用從訓(xùn)練集得到其參數(shù)的數(shù)學(xué)模型/算法(分類器)，可以將新患者預(yù)測表征為反應(yīng)者(基因標(biāo)記陽性的)或非反應(yīng)者(基因標(biāo)記陰性的)。標(biāo)準(zhǔn)可以是已知是反應(yīng)者或非反應(yīng)者的人/患者的譜，或者替代地可以是數(shù)值。這樣的預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)可以用任何合適的形式提供，如打印的列表或圖、計算機軟件程序或其它介質(zhì)。所述標(biāo)準(zhǔn)適當(dāng)?shù)厥蔷哂幸阎磻?yīng)者或非反應(yīng)者狀態(tài)的一位或多位患者中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達(dá)的值或函數(shù)，所以標(biāo)準(zhǔn)信息與關(guān)于患者來源的樣品中相同基因的表達(dá)的信息的對比，允許得出關(guān)于患者中的反應(yīng)者或非反應(yīng)者狀態(tài)的結(jié)論。使用表1的一個或多個基因，和通過分析已知為反應(yīng)者或非反應(yīng)者的一個或多個個體，可以得到標(biāo)準(zhǔn)。從訓(xùn)練集得到的訓(xùn)練數(shù)據(jù)或參數(shù)的非限制性實例是如下面在實施例1中討論的用于樣品標(biāo)準(zhǔn)化的參照數(shù)據(jù)集、參照分位數(shù)、探針效應(yīng)或R對象格式數(shù)據(jù)。這些具體實例在將患者分類為反應(yīng)者或非反應(yīng)者中的用途，形成本發(fā)明的一個具體方面。在一個方面，通過參照標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過在對比中使用訓(xùn)練集中的患者的臨床結(jié)果(反應(yīng)者和非反應(yīng)者)作為組，計算每個探針集合的信噪比，從而產(chǎn)生在表1中的基因列表。然后將源自訓(xùn)練集的分類器參數(shù)用于預(yù)測新樣品的分類。在本說明書上下文中的訓(xùn)練集意欲表示一組樣品，其臨床結(jié)果可以與基因譜關(guān)聯(lián)，并且可以用于針對新樣品訓(xùn)練合適的統(tǒng)計學(xué)模型/程序，雖然不希望受到理論的限制，認(rèn)為表1的100個基因中的至少68個可耐受訓(xùn)練集中的變化。這些基因形成本發(fā)明的一個具體方面。這些基因可以從表IA的第5列中鑒定
出ο在一個方面，采用數(shù)學(xué)模型/算法/統(tǒng)計方法來將患者表征為反應(yīng)者或非反應(yīng)者。所述表征算法使用來自任一個基因和任一個已知反應(yīng)者或非反應(yīng)者的基因表達(dá)信息，且適當(dāng)?shù)鼗谟斜O(jiān)督的主成分分析，盡管可以使用任意合適的表征算法，例如實施例1-7的任意算法。具體地，所述算法可以產(chǎn)生來自具有已知臨床結(jié)果的個體或訓(xùn)練集的標(biāo)準(zhǔn)，其中
13使用如實施例1所示的具有判別分析算法的有監(jiān)督的主成分分析或如實施例3所示的具有cox決策規(guī)則的有監(jiān)督的主成分分析。因此，在一個方面，本發(fā)明也涉及用于將新患者表征為反應(yīng)者或非反應(yīng)者的分類器的開發(fā)，所述分類器的參數(shù)從具有已知臨床結(jié)果(反應(yīng)者和非反應(yīng)者)的訓(xùn)練集得到。使用信噪比、Baldi分析(經(jīng)典T檢驗的一種變體)和/或皮爾遜相關(guān)系數(shù)和/或線性判別分析，可以產(chǎn)生基因列表。參見例如Golub T，Slonim D，Tamayo P等Molecular classification of cancer :class discovery and class prediction by geneexpression monitoring. Science 1999 ；286 :531-536. Van' t Veer LJ, Dai H, van deVijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, WitteveenAT, et al. (2002)Gene expression profiling predicts clinical outcome of breastcancer. Nature，415(6871)，530-556。所述分類器可能使用有監(jiān)督的主成分、判別分析、最接近形心、NN、支持向量機器或適合分類的其它算法；包括使用時間(例如存活時間、無病期間時間)進(jìn)行分類的算法?；蛘?，使用本領(lǐng)域眾所周知的其它數(shù)學(xué)方法，可以實現(xiàn)分類。所述分類器可以包含在實施例1和/或2中例證的具有DA的SPCA決策規(guī)則或在實施例3和/或4中例證的SPCA-Cox決策規(guī)則。在有些實施方案中，公開的方法正確地預(yù)測反應(yīng)者和非反應(yīng)者的準(zhǔn)確度大于50^^60%或70%，諸如約70%準(zhǔn)確度。在一個實施方案中，通過參照治療失敗時間(TTF)/總存活數(shù)(OS)(它是一個連續(xù)變量，且可以例如在數(shù)月內(nèi)測量)，定義反應(yīng)者和非反應(yīng)者。在治療失敗時間變量較大的情況下，則認(rèn)為該患者是反應(yīng)者。在治療失敗時間變量較小的情況下，則認(rèn)為該患者是非反應(yīng)者。通常，使用該方案，將混合反應(yīng)者也歸入反應(yīng)者中。治療失敗是這樣的情況所述患者沒有歸入本文定義的反應(yīng)者、部分反應(yīng)者、混合反應(yīng)者或穩(wěn)定的疾病的定義中。在一個方面，可以將非反應(yīng)者定義為具有6個月或更少的TTF的那些。在一個方面，可以將反應(yīng)者定義為具有超過6個月(例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或更多月)的 TTF 的那些。在本發(fā)明的一個方面，患者對治療的反應(yīng)是無病期間(DFI)或無病存活(DFS)，它們是連續(xù)變量，且可以例如在數(shù)月內(nèi)測量。DFI和DFS被用于例如輔助治療中；所述輔助治療是這樣的情況腫瘤已經(jīng)被切除，提供所述治療來避免或延遲復(fù)發(fā)，或等效地延長無病期間或存活。DFI和DFS可以與患者臨床信息或測量的患者參數(shù)(諸如生物標(biāo)志物或基因表達(dá)譜)相關(guān)聯(lián)，且可以用于構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，以預(yù)測新患者的反應(yīng)。在一個方面，本發(fā)明的方法包括測定所述基因的表達(dá)水平，或測量在表1中列出的探針集合的基因產(chǎn)物。在一個方面，本發(fā)明包括在表1中列出的一個或多個(諸如基本上所有的)基因或探針集合用于預(yù)測或鑒定患者為針對肺癌和黑素瘤的免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的用途，適當(dāng)?shù)?，所述免疫治療基于癌睪丸抗原諸如Mage。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明采用在表1中列出的至少63個基因或至少74個探針集合?？?br> 權(quán)利要求
1.一種將患者表征為治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法，所述方法包括下述步驟(a)分析患者來源的樣品中表1的一個或多個基因的基因產(chǎn)物的差別表達(dá)，和(b)基于步驟(a)的結(jié)果，將樣品的來源患者表征為反應(yīng)者或非反應(yīng)者，其中通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到其參數(shù)的算法，進(jìn)行表征步驟。
2.一種治療患者的方法，所述方法包括下述步驟(a)得到患者來源的樣品中表1的一個或多個基因的基因產(chǎn)物的差別表達(dá)的分析結(jié)果，其中所述結(jié)果將患者表征為免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者，且其中通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到其參數(shù)的算法，進(jìn)行表征步驟；和(b)如果所述患者被表征為免疫治療的反應(yīng)者，則選擇所述患者進(jìn)行適當(dāng)免疫治療的至少一種施用。
3.一種測定患者是否是免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法，所述方法包括下述步驟(a)得到患者來源的樣品；和(b)分析患者來源的樣品中表1的一個或多個基因的基因產(chǎn)物的差別表達(dá)，其中所得結(jié)果確定所述患者是否被表征為免疫治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者，且通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到其參數(shù)的算法，進(jìn)行表征步驟。
4.在根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項中要求保護的方法，其中表1的一個或多個基因是在表1中列出的至少63個基因或在表2、5或7中指出的基本上所有的基因。
5.一種將患者表征為治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法，所述方法包括分析患者來源的樣品中被表1中列出的一個或多個探針集合識別的基因產(chǎn)物，所述探針集合的靶序列顯示在表3中，其中通過參照或?qū)Ρ葮?biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集，或使用從標(biāo)準(zhǔn)或訓(xùn)練集得到其參數(shù)的算法，進(jìn)行表征步驟。
6.在權(quán)利要求5中要求保護的方法，其中表1的一個或多個探針集合是在表1中列出的探針集合中的至少74個，或表2、5或7中的基因的所有探針集合。
7.在權(quán)利要求1或3-6中任一項所定義的方法，所述方法包括下述額外步驟鑒定患者為反應(yīng)者，并選擇所述患者進(jìn)行治療。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)是來自一位或多位患者的患者來源的一份或多份樣品，其各自具有已知的臨床結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述療法或治療是癌癥免疫治療，優(yōu)選針對黑素瘤和/或肺癌的癌癥免疫治療。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述癌癥免疫治療是MAGE。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述MAGE免疫治療是MAGEA3免疫治療。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中表1的一個或多個基因是在表1中列出的至少63個、至少68個、至少70個、至少75個、至少80個或基本上所有的基因和/或它們的任意組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求5-11中任一項所述的方法，其中表1的一個或多個探針集合是在表1中列出的至少74個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個或所有的探針集合和/或它們的任意組合。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述一個或多個基因與它們的正常表達(dá)相比被增量調(diào)節(jié)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法，其中至少80%的所述基因與它們的正常表達(dá)相比被增量調(diào)節(jié)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，所述方法另外包括下述步驟測定所述基因產(chǎn)物是否被增量調(diào)節(jié)和/或減量調(diào)節(jié)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物被增量調(diào)節(jié)和/或減量調(diào)節(jié)的測定指示反應(yīng)者。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其中所述基因是免疫相關(guān)基因。
19.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，所述方法包括探針用于鑒定一種或多種基因產(chǎn)物的用途。
20.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的方法，所述方法包括微陣列試劑盒或PCR用于分析基因表達(dá)的用途。
21.表1中的至少63個基因的基因列表或由其產(chǎn)生的數(shù)據(jù)或表1中的至少74個探針集合或由其產(chǎn)生的數(shù)據(jù)用于分析患者是否可能是諸如癌癥免疫治療等治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的用途。
22.根據(jù)在權(quán)利要求20中要求保護的用途，其中所述基因列表包含表1中的基本上所有的基因或探針集合或由其組成。
23. 一種包含多核苷酸探針的微陣列，所述多核苷酸探針與至少一個基因的基因產(chǎn)物的序列互補且可雜交，所述基因選自在表1中列出的基因，其中與表1的基因互補且可雜交的多核苷酸探針或探針集合構(gòu)成在所述微陣列上的至少50%的探針或探針集合。
24.一種包含多核苷酸探針的微陣列，所述多核苷酸探針與至少一個基因的基因產(chǎn)物的序列互補且可雜交，所述基因選自在表1中列出的基因。
25.根據(jù)在權(quán)利要求23或權(quán)利要求M中要求保護的微陣列，所述微陣列包含多核苷酸探針，所述多核苷酸探針與在表2中列出的基因的基因產(chǎn)物的序列互補且可雜交。
26.—種診斷試劑盒，其包含用于測量在表1中列出的一個或多個基因或在表1中列出的基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)的裝置，例如與mRNA或cDNA基因產(chǎn)物雜交的探針，用于執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法。
27.一種治療根據(jù)權(quán)利要求1-20所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求23-25所述的微陣列或根據(jù)權(quán)利要求26所述的診斷試劑盒的用途表征為反應(yīng)者的患者的方法，其包括給所述患者施用包含腫瘤相關(guān)抗原的組合物。
28.一種用于治療根據(jù)權(quán)利要求1-20所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求23-25所述的微陣列或根據(jù)權(quán)利要求26所述的診斷試劑盒的用途確定為或表征為反應(yīng)者的患者的包含腫瘤相關(guān)抗原的組合物。
29.包含腫瘤相關(guān)抗原的組合物在制備藥劑中的用途，所述藥劑用于治療根據(jù)權(quán)利要求1-20所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求23-25所述的微陣列或根據(jù)權(quán)利要求沈所述的診斷試劑盒的用途確定為或表征為反應(yīng)者的患者。
30.根據(jù)權(quán)利要求27-29中任一項所述的方法、組合物或用途，其中所述腫瘤相關(guān)抗原是MAGE抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求27-30中任一項所述的方法、組合物或用途，其中所述組合物另外包含佐劑。
32.一種固體表面，與其連接了在表1中列出的至少63個基因的多種檢測劑，所述檢測劑能夠檢測所述基因的表達(dá)或由所述基因編碼的多肽。
全文摘要
提供了基于一個或多個基因的差別表達(dá)而將患者表征為治療的反應(yīng)者或非反應(yīng)者的方法。也提供了基因表達(dá)譜、包含代表基因表達(dá)譜的核酸序列的微陣列和新的診斷試劑盒和治療方法。所述試劑盒和方法與(例如，癌癥患者中的)特定群體的治療有關(guān)，所述群體通過他們的基因表達(dá)譜被表征為遭受表達(dá)MAGE的腫瘤。
文檔編號C12Q1/68GK102597269SQ201080049449
公開日2012年7月18日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者B·G·E·L·G·迪奇爾, F·烏羅亞-蒙托亞, J·羅亞赫德, O·格魯塞勒, V·布里查德 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司