專利名稱：可以增殖的動物細胞的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及將在基板上培養(yǎng)的動物細胞在培養(yǎng)后由基板以可以増殖的狀態(tài)剝離而制備可以增殖的動物細胞的方法，以及利用該方法的動物細胞片的制備方法。特別地，本發(fā)明涉及利用該剝離方法的皮膚細胞片的制備方法。
背景技術：
再生醫(yī)療中的主要治療原材料為由患者或捐贈者提供的人細胞，為了移植治療，通過細胞培養(yǎng)使該人細胞增殖而確保充分的細胞數(shù)是不可欠缺的。很多細胞為經過對培養(yǎng)面的粘接、細胞延長、和通過分裂進行的増殖的一系列過程而増殖的貼壁依賴性細胞，通過多次傳代培養(yǎng)，可以增大細胞數(shù)。此時必要的要素技術為細胞可以粘接、延長、増殖的培養(yǎng)面，以及從培養(yǎng)面的脫離控制。不僅細胞可以粘接、増殖方面是重要的，而且不對所増殖的細胞造成損傷、以可以增殖的狀態(tài)脫離也是重要的。以往已知的細胞脫離的方法有酶法、電刺激法和親水度控制法等。酶法為通過利用胰蛋白酶等蛋白酶將細胞表層的蛋白質溶解而剝離的方法。電刺激法為通過在培養(yǎng)面流通電流、溶解細胞表層的蛋白質而剝離的方法。親水度控制法為通過提高培養(yǎng)面的親水性而剝離的方法。這些方法中，酶法為一般的方法。但是，由于酶法將全部細胞表層溶解，其對細胞的損傷大，因此存在再粘接、増殖的效率差的問題。電刺激法為在細胞與培養(yǎng)面的接點局部地進行反應而可以進行迅速的應答的方法。例如專利文獻I中記載了，通過調整附著了培養(yǎng)細胞的電極的電位使細胞自發(fā)地剝離，可以得到損傷少的培養(yǎng)細胞。此外，專利文獻2中記載了對于與電極粘接的細胞，對該電極施加恒電位來進行剝離?，F(xiàn)有技術文獻 專利文獻
專利文獻I日本特開2005-312343號公報
專利文獻2日本特開平10-42857號公報
專利文獻I 2的全部記載特別地合并于此作為公開。

發(fā)明內容
但是，專利文獻I和2中記載的方法中，附著在電極上的動物細胞有時不剝離，即使在剝離的情況下，所剝離的細胞也受到損傷，增殖率低，存在增殖カ差的問題。例如在作為專利文獻2中記載的條件的-1. 2V (相對于Ag/AgCl(VsAg/AgCl))的恒電位下細胞剝離，但是由于易產生氫而細胞受到損傷，可以增殖的動物細胞的比率低。
因此，本發(fā)明的目的在于提供可以增殖的動物細胞的制備方法，其中細胞的粘接、増殖性優(yōu)異，同時增殖后可以對細胞不造成損傷地脫離培養(yǎng)細胞。進一歩地，本發(fā)明的目的在于提供可以增殖的皮膚細胞等動物細胞片的制備方法。本發(fā)明人進行了各種研究后發(fā)現(xiàn)，通過在從電極表面剝離培養(yǎng)細胞中使用高頻變動電位，可以解決上述課題，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明如下所述。[I]可以增殖的動物細胞的制備方法，其包括(I)在至少一部分為電極的基板表面上培養(yǎng)動物細胞的步驟,和(2)對上述電極施加高頻變動電位、將通過培養(yǎng)而附著在上述基板表面上的細胞剝離的步驟，其特征在于，上述高頻變動電位的頻率為IKHz IOMHz的范圍，且形成±1. OV(相對于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度，以及剝離時的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)液。[2] [I]中記載的制備方法，其中，上述剝離時的培養(yǎng)液為磷酸緩沖液(不含 Ca2'Mg2 + )。[3] [I]或[2]中記載的制備方法，其中，上述高頻變動電位為矩形波、正弦波或三角波。[4] [I] [3]中任意一項記載的制備方法，其中，上述基板表面全部為電扱。[5] [I] [3]中任意一項記載的制備方法，其中，上述基板表面的一部分為電極，在步驟(2)中剝離電極表面上及電極附近的非電極表面上的細胞。[6] [I] [5]中任意一項記載的制備方法，其含有將所剝離的可以增殖的動物細胞進一步傳代而維持可以增殖的動物細胞的步驟。[7] [I] [6]中任意一項記載的制備方法，其中，進行培養(yǎng)使細胞形成片狀，將片狀細胞以可以增殖的狀態(tài)剝離，并得到可以增殖的動物細胞片。[8] [I] [7]中任意一項記載的制備方法，其中，動物細胞為皮膚細胞。根據本發(fā)明，通過施加高頻變動電位，可以良好地剝離附著在電極上的動物細胞，且所剝離的細胞的増殖率高，得到増殖カ優(yōu)異的動物細胞。根據本發(fā)明，對于利用化學上的傳代法時存在伴有變異等危險性的干細胞、iPS細胞等也可以傳代。


[圖I]表示步驟(I) ⑵的說明圖。[圖2]表示參考例I中的電極制造順序的說明圖。[圖3]表不實施例I得到的電壓施加時間為O分鐘、30分鐘、60分鐘的電極表面的圖像。[圖4]表示實施例I中得到的電剝離后、將細胞在培養(yǎng)瓶中傳代后的電極表面的圖像。[圖5]表示比較例I中得到的電壓施加時間為O分鐘、60分鐘的圖像。[圖6]表示比較例2中得到的對培養(yǎng)基中的人皮膚成纖維細胞施加±1. 0V、3MHz的電位后的電極表面的圖像。[圖7]表示比較例3中得到的施加-I.OV (相對于Ag/AgCl)的恒電位O分鐘、60分鐘后的電極表面的圖像。
[圖8]表示比較例3中得到的電剝離后、將細胞在培養(yǎng)瓶中傳代后的電極表面的圖像。[圖9]表不實施例2中得到的電壓施加時間為O分鐘、30分鐘、60分鐘的電極表面的圖像。[圖10]表示參考例2中的ITO電極的表面對于水的接觸角的測定結果。
具體實施例方式本發(fā)明涉及可以增殖的動物細胞的制備方法。本發(fā)明的方法含有以下的步驟⑴和(2)。步驟(I)
步驟(I)為在至少一部分為電極的基板表面上培養(yǎng)動物細胞的步驟。作為培養(yǎng)動物細胞的至少一部分為電極的基板，不特別限定。上述基板表面可以全部為電極，或一部分為電極、一部分為非電極(基板)。進ー步地，至少一部分為電極的基板例如可以在電極以外的基板上設置電極層，也可以如碳電極等那樣全部為電扱。在電極以外的基板上設置電極層時，基板可以在絕緣性基板的表面的一部分或全部上具有電極。具有這種電極的基板例如可以為在載玻片(slide glass)上涂布氧化銦(ITO)而成的。但是，絕緣性基板并非意圖限于載玻片，為非導電性的固體即可，不作特別限定，可以為由非導電性的有機材料、無機材料組成的絕緣性基板。作為非導電性的有機材料、無機材料，除了玻璃之外，還可以舉出例如塑料、陶瓷等。電極并非意圖限于氧化銦(ITO)，可以適當利用由公知的電極材料組成的電極。在基板上設置電極層時，可以為在基板全部表面上設置電極層、或在電極基板的表面一部分設置電極層中的任ー種，在電極基板的表面的一部分設置電極層時，電極層例如可以為陣列狀，也可以為條紋狀。對于本發(fā)明的方法、特別是培養(yǎng)的結果，可以將形成片狀的動物細胞容易地剝離，而不會對動物細胞造成損傷，電極層可以考慮到動物細胞片的所需大小(面積、尺寸)來適當決定。例如，電極的面積例如可以為I 900cm2的范圍。此外，陣列狀例如指的是縱列和橫列分別以多個微小區(qū)域配置電極層。對縱列和橫列各自的微小區(qū)域數(shù)目不特別限定，可以根據動物細胞的種類(尺寸)、以陣列狀配置動物細胞的基板的利用目的等適當決定，例如可以為縱10 IO5X橫10 IO5的范圍。但是，并非意圖限定于該范圍。陣列狀電極層表面的形狀為矩形(三角形、正方形、長方形、多邊形等)、圓形、橢圓形等，可以適當決定。陣列狀的各電極表面的尺寸可以為在I個電極表面上可以附著I個動物細胞的尺寸。動物細胞的尺寸根據細胞而多種多祥，因此可以根據所附著的動物細胞的尺寸適當決定電極表面的尺寸。但是，例如動物細胞為HeLa時，電極表面的尺寸例如可以為25 100 μ m的范圍。此外，陣列狀的各電極表面的尺寸也可以為在I個電極表面上可以附著2個以上動物細胞的尺寸。進ー步地，各電極的間隔例如可以為25 100 μ m的范圍。此外，條紋狀的電極層例如可以為以等間隔或不同的間隔設置多個相同寬度的帶狀的電極層、以等間隔或不同的間隔設置多個不同寬度的帯狀的電極層中的任ー種。對帯狀的電極層的寬度和帯狀的電極層之間的間隔不特別限定，例如都可以獨立地為25 100 μ m的范圍。
如后所述，步驟(2)中，不僅可以將電極表面上的細胞剝離，還可以將電極附近的非電極表面上的細胞剝離，對于可以在非電極表面上剝離的細胞，與電極的距離取決于高頻變動電位的頻率和電位，但是為約IOOym以內。因此，在陣列狀和條紋狀中的任意ー種情況下，只要電極的間隔在上述25 100 μ m的范圍內，則也可以剝離非電極表面上的細胞。在基板表面上形成陣列狀或條紋狀電極層可以如下進行，例如，在基板表面上涂布電極層，將陣列狀或條紋狀電極表面用掩模形成在電極層表面上，然后通過掩模將電極層表面蝕刻，除去掩模?；蛘撸诨灞砻嫔闲纬申嚵袪罨驐l紋狀電極表面可以如下進行，在基板表面上通過陣列狀或條紋狀電極表面用掩模涂布電極層，然后除去掩模。電極層的形成、電極層表面的蝕刻等可以使用常規(guī)方法適當實施。本發(fā)明中，對于成為制備可以增殖的動物細胞的對照的動物細胞不特別限定，例如可以為皮膚細胞、干細胞、iPS細胞等。至少一部分為電極的基板表面上的動物細胞的培養(yǎng)條件可以根據動物細胞的種類適當采用公知的培養(yǎng)條件。若向至少一部分為電極的基板的表面供給含有動物細胞的培養(yǎng)液，在對應于動物細胞的種類的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，則在存在電極表面和非電極表面時，在非電極表面上也附著動物細胞。至少一部分為電極的基板表面上的動物細胞的培養(yǎng)可以在動物細胞個別存在的條件下實施、在動物細胞形成塊的條件下實施、進ー步在動物細胞以片狀形成塊的條件下實施。本發(fā)明中，步驟(2)中，形成塊的動物細胞、以片狀形成塊的動物細胞都可以以可以增殖的狀態(tài)剝離細胞。步驟(2)
步驟(2)為對培養(yǎng)而附著細胞的至少一部分為電極的基板的電極施加高頻變動電位，將細胞剝離的步驟。將附著在電極上的細胞以及電極附近的非電極表面上的細胞通過施加高頻變動電位來剝離。具體地說，高頻變動電位頻率為IKHz IOMHz范圍，優(yōu)選為I 5MHz范圍，電位例如成為±1. OV(相對于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度，例如可以為±0.9V(相對于Ag/AgCl)、0.8V(相對于Ag/AgCl)等。高頻變動電位的波形例如可以為矩形波、正弦波、三角波等。進ー步地，施加高頻變動電位時，剝離時的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)基是適當?shù)?。這是由于，在含有鈣或鎂的培養(yǎng)液中即使施加高頻變動電位，也不能將細胞電剝離。施加高頻變動電位時，剝離時的培養(yǎng)液例如可以為磷酸緩沖液(不含Ca2 +、Mg2 + )[PBS (-) ]、Hanks緩沖鹽(不含Ca2 +、Mg2 + )等，其中優(yōu)選為PBS (-)。步驟⑵中，不僅可以將電極表面上的細胞剝離，還可以將電極附近的非電極表面上的細胞剝離，對于可以在非電極表面上剝離的細胞，與電極的距離取決于高頻變動電位的頻率和電位，但是為約IOOym以內。施加高頻變動電位時，對電極上的細胞直接性地施加電位，對非電極表面上的細胞間接性地施加電位。因此，通過電位施加對細胞造成的應カ對于非電極表面上的細胞來說相對小，即使在由于電位的施加而產生細胞的損傷時(這種高頻變動電位的條件)，非電極表面上的細胞也存在損傷相對少或無損傷的趨勢。采用由于電位的施加而產生細胞損傷的程度的強的高頻變動電位是細胞的附著牢固、難以剝離的 情況，因此在這種情況下，也可以進行電極的形狀或配置、進而非電極表面的選擇，積極地進行非電極表面上的細胞的剝離，以優(yōu)先進行非電極表面上的細胞的剝離。
本發(fā)明的方法中，如圖I所示，步驟(I)中，在基板的電極表面或電極及非電極表面上培養(yǎng)、附著動物細胞。(A)為基板的全部為電極表面的情況，(B)和(C)為基板的一部分為電極、一部分為非電極表面的情況。任意一種情況下，步驟(I)中，通過施加高頻變動電位，都可以將附著在電極表面或電極及非電極表面上的動物細胞剝離。本發(fā)明的方法可以含有將所剝離的可以增殖的動物細胞進ー步傳代而維持可以増殖的動物細胞的步驟。維持動物細胞的方法可以根據動物細胞的種類適當采用。步驟(I)中，可以以片狀的塊的方式在電極表面上培養(yǎng)、附著動物細胞，將該片狀的動物細胞以可以增殖的狀態(tài)剝離。因此，在再生醫(yī)療等領域中非常有用。實施例
以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明。 參考例I
(I)電極的制造
根據以下的順序制造電極和3電極培養(yǎng)系統(tǒng)。圖2表示電極制造的順序的說明圖。I)在載玻片(圖2左上)上的中央部以6. 3 7.5 Ω/cm2涂布氧化銦(ITO)制造圖案電極(IcmXlcm)(圖2左下)。圖案電極如左下所示，分為4個區(qū)域制造，各區(qū)域的圖案A D如圖2的中央所示。黒色部分為玻璃表面，白色部分為ITO電極表面。實施例中，使用該方式的圖案電扱。2)將該載玻片的端部部分用金鋼鉆開孔，用導電性樹脂(Dotite、D-550、藤倉化成(株))連接導線和ITO電極。3)卸除ラブテック腔室玻片(Lab-tek chamber slide、177410、NalgeNunc)的腔室部分，用水槽修復用硅粘合劑(東芝シリコーン、TSE382-Cクリア)粘接在ITO圖案電極上。4)在ラブテック腔室玻片的蓋部分的2個部位用金鋼鉆開孔，連接鉬電極和銀/氯化銀電極。5)組合蓋和腔室，完成3電極培養(yǎng)系統(tǒng)(右上照片)。實施例I
使用參考例I中制造的3電極培養(yǎng)系統(tǒng)，按照以下的順序實施動物細胞的電傳代法。I)將懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中的動物細胞(正常人皮膚成纖維細胞)接種到3電極培養(yǎng)系統(tǒng)的ITO圖案電極腔室內，培養(yǎng)數(shù)天。2)確認細胞附著在電極基板上，將ITO圖案電極腔室內置換為PBS(_)。3)利用連接了函數(shù)產生器(AD8624A、A&D company、Tokyo, Japan)的恒電位儀(PS_14、Toho technical research),將 3MHz、± I. OV (相對于 Ag/AgCl)的矩形波變動電位施加到3電極培養(yǎng)系統(tǒng)中的ITO圖案電極。4)回收從電極剝離的細胞，轉移到新的培養(yǎng)瓶后，用相差顯微鏡(CKX-41、Olympus)觀察細胞附著率及細胞増殖的有無。結果如圖3所示，表示電壓施加時間O分鐘、30分鐘、60分鐘的圖像。在3MHz、-I. OV +1. 0(相對于Ag/AgCl)的電壓施加條件下，施加30分鐘以上時，成功剝離細胞。此時，未檢出電流(無電化學反應)。電剝離后，若將細胞在培養(yǎng)瓶中傳代，則如圖4所示，4小時后確認88%的細胞(99個/112個)正常附著、増殖。
比較例I
除了將電壓施加條件改為3MHz、-O. 4V +0. 4(相對于Ag/AgCl)之外，在與實施例I相同的條件下，嘗試從電極剝離細胞。結果如圖5所示，表示電壓施加時間O分鐘、60分鐘的圖像。該電壓施加條件下，即使施加60分鐘，細胞也幾乎未剝離。比較例2
即使對培養(yǎng)基中的人皮膚成纖維細胞施加±1. 0V,3MHz的電位48hr，如圖6所示，由于培養(yǎng)基中的鈣或鎂的影響而細胞未剝離。比較例3 使用參考例I中制造的3電極培養(yǎng)系統(tǒng)，按照以下的順序通過對動物細胞施加恒電位來實施剝離。I)將懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中的動物細胞(正常人皮膚成纖維細胞)接種到ITO圖案電極腔室內，培養(yǎng)數(shù)天。2)確認細胞附著在電極基板上，將ITO圖案電極腔室內置換為PBS(_)。3)利用恒電位儀(PS-14、Toho technical research),將-I. OV (相對于 Ag/AgCl)的恒電位施加到3電極培養(yǎng)系統(tǒng)中的ITO圖案電極。4)用相差顯微鏡(CKX-41、Olympus)進行觀察。5)利用含有O. 45%錐蟲藍的PBS (-)溶液(ICN Biomedicals,Aurora,Ohio,USA)，判別施加電位60分鐘后的動物細胞的生死。結果如圖7所示，表示電壓施加時間O分鐘、60分鐘的圖像。該電壓施加條件下，細胞僅球形化，而幾乎未從電極基板上剝離。錐蟲藍判別的結果如圖8所示。透明發(fā)亮的細胞為活細胞。染成藍色的細胞為死細胞。細胞的存活率為11%(23/217個)。實施例2
除了使用相當于圖I的(C)的電極基板之外，與實施例I同樣地進行細胞的培養(yǎng)及剝離。圖9表示電壓施加時間O分鐘、30分鐘、60分鐘的圖像。在3MHz、-I. OV +1. 0(相對于Ag/AgCl)的電壓施加條件下，施加30分鐘以上時，成功剝離細胞。此時，未檢出電流(無電化學反應)。電剝離后，若將細胞在培養(yǎng)瓶中傳代，則確認直至24小時后細胞正常附著、增殖。參考例2
測定對ITO電極施加恒電位或高頻變動電位時的ITO電極的表面對于水的接觸角。測定如下進行，在充滿環(huán)辛烷的電解槽中的ITO電極的表面上載置水滴，對施加恒電位(-0. 4V或+O. 4V(相對于Ag/AgCl)) (24小吋)前后的接觸角或施加高頻變動電位(±1. 0V、3MHz、矩形波變動電位)30分鐘或60分鐘前后的接觸角進行測定。結果如圖10所示。通過施加-O. 4V和+0. 4V的恒電位(相對于Ag/AgCl) 24小時，對于水的接觸角降低約20 30%，與此相對地，施加高頻變動電位30分鐘或60分鐘時降低約20 40%，可知電極的親水性在更短時間內増加。由該結果推測，本發(fā)明中的通過對動物細胞施加高頻變動電位進行的剝離的原因之ー為，電極表面的親水性增加。エ業(yè)實用性
本發(fā)明對于再生醫(yī)療等必需可以增殖的動物細胞的領域來說是有用的。
權利要求
1.可以增殖的動物細胞的制備方法，其包括(I)在至少一部分為電極的基板表面上培養(yǎng)動物細胞的步驟，和 (2)對所述電極施加高頻變動電位、將通過培養(yǎng)而附著在所述基板表面上的細胞剝離的步驟， 其特征在于，所述高頻變動電位的頻率為IKHz IOMHz的范圍，且形成±1. OV(相對于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度，以及剝離時的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)液。
2.如權利要求I所述的制備方法，其中，所述剝離時的培養(yǎng)液為磷酸緩沖液(不含Ca2'Mg2 + )。
3.如權利要求I或2所述的制備方法，其中，所述高頻變動電位為矩形波、正弦波或三角波。
4.如權利要求I 3中任意一項所述的制備方法，其中，所述基板表面全部為電扱。
5.如權利要求I 3中任意一項所述的制備方法,其中，所述基板表面的一部分為電極，在步驟(2)中剝離電極表面上及電極附近的非電極表面上的細胞。
6.如權利要求I 5中任意一項所述的制備方法，其含有將所剝離的可以增殖的動物細胞進一步傳代而維持可以增殖的動物細胞的步驟。
7.如權利要求I 6中任意一項所述的制備方法，其中，進行培養(yǎng)使細胞形成片狀，將片狀細胞以可以增殖的狀態(tài)剝離，并得到可以增殖的動物細胞片。
8.如權利要求I 7中任意一項所述的制備方法，其中，動物細胞為皮膚細胞。
全文摘要
提供細胞的粘接、增殖性優(yōu)異，同時增殖后可以對細胞不造成損傷地脫離培養(yǎng)細胞的可以增殖的動物細胞的制備方法，以及可以增殖的皮膚細胞等動物細胞片的制備方法。其為含有下列步驟的可以增殖的動物細胞的制備方法(1)在至少一部分為電極的基板上培養(yǎng)動物細胞的步驟，和(2)對電極施加高頻變動電位、將通過培養(yǎng)而附著在上述基板表面上的細胞剝離的步驟。上述高頻變動電位的頻率為1KHz～10MHz的范圍，且形成±1.0V(相對于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度。剝離時的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)液。
文檔編號C12N5/07GK102695789SQ20108004911
公開日2012年9月26日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者小山純弘 申請人:獨立行政法人海洋研究開發(fā)機構