專利名稱：Nk細(xì)胞活化方法、使用該方法的nk細(xì)胞增殖方法及細(xì)胞制備方法以及含nk細(xì)胞的單核細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)活化的NK細(xì)胞活化方法、使用該NK細(xì)胞的NK細(xì)胞增殖方法及細(xì)胞制備方法以及含NK細(xì)胞的單核細(xì)胞。
背景技術(shù)：
例如，專利文獻(xiàn)I中提出了培養(yǎng)利用抗CD3抗體從癌癥患者采集的淋巴細(xì)胞而獲得含大量的Y S T細(xì)胞和NK細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的方法。
專利文獻(xiàn)I :日本專利特開2001-314183號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
為了防止病原體的侵入和惡性腫瘤的發(fā)生等對機(jī)體不利的病態(tài)，機(jī)體通過天然免疫和適應(yīng)性免疫這2類免疫體系來應(yīng)對。天然免疫中，對于侵入的病原體，已經(jīng)存在的NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞或者補(bǔ)體系統(tǒng)等通過非特異性活化通路在數(shù)小時(shí)內(nèi)感知并迅速將其排除。適應(yīng)性免疫中，對于特定的病原體或異常細(xì)胞，抗原特異性的效應(yīng)T細(xì)胞被誘導(dǎo)并伴有增殖，變成具有細(xì)胞殺傷活性的T細(xì)胞，并且促進(jìn)與抗原相對應(yīng)的抗體生成，需要4天以上的時(shí)間來排除侵入的病原體。在天然免疫中起到重要作用的NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的10%左右，進(jìn)行免疫學(xué)監(jiān)視，即迅速察覺機(jī)體的異常并進(jìn)行應(yīng)對。NK細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上是具有特征性細(xì)胞內(nèi)顆粒的大型的淋巴細(xì)胞，是無需像細(xì)胞殺傷性T細(xì)胞那樣經(jīng)過抗原刺激后的分化就可發(fā)揮細(xì)胞殺傷活性的細(xì)胞。因此，不具有像T細(xì)胞那樣的抗原特異性，對主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,以下稱為MHC)消失了的某種病毒感染細(xì)胞或癌細(xì)胞顯示細(xì)胞殺傷活性。另一方面，NK細(xì)胞存在與像正常細(xì)胞那樣表達(dá)有MHC- I類分子的細(xì)胞結(jié)合的抑制性受體，因此對于正常細(xì)胞不發(fā)揮細(xì)胞殺傷活性。除了非特異性的細(xì)胞殺傷活性之外，NK細(xì)胞還可通過特有的機(jī)制殺傷靶細(xì)胞。大多數(shù)NK細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)有針對IgG分子的Fe部分的受體(⑶16)。NK細(xì)胞介以⑶16與結(jié)合于靶細(xì)胞的細(xì)胞表面的IgG的Fe部分結(jié)合而活化，發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)活性。長久以來，人們一直嘗試將使具有這樣的細(xì)胞殺傷活性的NK細(xì)胞在體外增殖并再次植回體內(nèi)的過繼免疫療法(adoptive immunotherapy)用作癌癥或病毒感染癥等的治療方法。此外，最近也進(jìn)行了通過給予他人(異體)的NK細(xì)胞來治療各種惡性腫瘤的嘗試(Igarashi T 等，Blood 2004，104 :170 ;Ruggeri L 等，Curr. Opin. Immunol. 2005，17 :211)。但是，難以通過簡便的方法將NK細(xì)胞培養(yǎng)至多到足以臨床應(yīng)用的細(xì)胞數(shù)。目前為止已報(bào)道的NK細(xì)胞的培養(yǎng)法例舉如下。I)通過IL-2或IL-15刺激外周血淋巴細(xì)胞或以磁珠分離而得的NK細(xì)胞而使其增殖。根據(jù)大量的報(bào)道，所述增殖在10倍左右，因此需要準(zhǔn)備大量的外周血單核細(xì)胞(以下稱為 PBMC) (Dunne J 等，].Immunol. 2001,167 :3129 ；Klingemann HG 等，Cytotherapy 2004,6 15)。2)有報(bào)道稱，通過在IL-2的存在下進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞與作為B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株的K562或Daudi細(xì)胞的混合培養(yǎng)，與單獨(dú)存在IL-2的情況相比增殖更多，增加至數(shù)十倍。 3)向粘附于塑料板的淋巴因子激活的殺傷(LAK, Lymphokine-activa tedkiller)細(xì)胞(實(shí)際為NK細(xì)胞)中添加IL-2和作為飼養(yǎng)(feeder)細(xì)胞的伴刀豆球蛋白A(Con-A)刺激外周血淋巴細(xì)胞或EB病毒感染淋巴母細(xì)胞細(xì)胞株，從而使其增殖(Rabinowich H等,Cell Tmmuno1. 1991,135 :454)。但是，由于粘附于塑料板的LAK細(xì)胞少， 因此即使增殖也僅限于最初采集的NK細(xì)胞的36倍。4) PBMC48小時(shí)刺激培養(yǎng)上清通過添加PBMC、EB病毒感染淋巴母細(xì)胞細(xì)胞株、PMA及PHA和離子霉素、IL~2,與IL-2單獨(dú)刺激相比，使NK細(xì)胞增加至9倍。但是，工藝復(fù)雜，卻難以大量獲得(RobertsonMJ 等，J Immunol 1993,150:1705)。5)如果在IL-2的存在下培養(yǎng)PBMC和粘附性腫瘤細(xì)胞株HFWT，則NK細(xì)胞在10天 21 天內(nèi)增殖至 58 倍 401 倍(Harada 等，Jpn J Cancer Res 2002,93 :313)。6)將整合有4-1BB基因和IL-15基因的K562和PBMC混合培養(yǎng)3周的情況下，NK細(xì)胞平均增殖至1000倍以上(Imai C等，Blood 2005)。如上所述，為了使NK細(xì)胞大量增殖至至少數(shù)百倍以上，需要與K562或HFWT等人腫瘤細(xì)胞的混合培養(yǎng)以及向這些細(xì)胞株的基因?qū)?。這些細(xì)胞株為腫瘤細(xì)胞、異體的細(xì)胞或者進(jìn)行了基因?qū)氲?，除了醫(yī)學(xué)方面的問題之外，其使用還存在倫理上的問題。例如，使用與腫瘤細(xì)胞株的混合培養(yǎng)的方法中，腫瘤細(xì)胞哪怕有I個(gè)存活，也有可能進(jìn)入機(jī)體。此夕卜，由于導(dǎo)入基因?qū)C(jī)體的影響未知等原因，其臨床應(yīng)用必須慎重。⑶52分子屬于GPI錨定型糖蛋白。作為屬于GPI錨定型糖蛋白的分子，還有⑶48、⑶55、⑶59等。⑶52分子于T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞中有表達(dá)，顆粒細(xì)胞中沒有表達(dá)。對于T細(xì)胞，如果通過單克隆抗體將⑶52分子與⑶3分子一起進(jìn)行刺激，則與⑶3單獨(dú)刺激的情況相比，T細(xì)胞的活化顯著增強(qiáng)，CD52起到共刺激分子的作用(Rowan WC等，Int Immunol 1995，7:69)。NK細(xì)胞由于不表達(dá)⑶3分子，因此未發(fā)現(xiàn)像T細(xì)胞那樣由這些分子介導(dǎo)的共刺激效果。本發(fā)明是鑒于上述各方面而完成的發(fā)明，其目的在于提供可在不與K562等混合的情況下安全且簡單地使對于各種腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等具有非特異性的細(xì)胞殺傷活性或ADCC活性的NK細(xì)胞活化而增殖的NK細(xì)胞活化方法以及使用該方法的NK細(xì)胞增殖方法及細(xì)胞制備方法。此外，本發(fā)明的另一目的在于提供含大量NK細(xì)胞的單核細(xì)胞。本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法中，通過CD52激動劑刺激含T細(xì)胞和NK細(xì)胞的單核細(xì)胞(單核細(xì)胞群)而使NK細(xì)胞活化。該采用CD52激動劑的單核細(xì)胞的刺激可在細(xì)胞因子的存在下、較好是在IL-2的存在下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法，通過CD52激動劑刺激含T細(xì)胞和NK細(xì)胞的單核細(xì)胞，因此與T細(xì)胞相比可更多地活化NK細(xì)胞，可在不與K562等混合的情況下安全且簡單地使NK細(xì)胞活化而增殖，特別是藉由在例如IL-2的存在下通過CD52激動劑刺激含T細(xì)胞和NK細(xì)胞的單核細(xì)胞，與例如IL-2單獨(dú)刺激相比，與T細(xì)胞相比可更多地使NK細(xì)胞增殖。此外，如果使用本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法，可使NK細(xì)胞增殖至1000倍以上。本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法的優(yōu)選例子中，通過所述⑶52激動劑和⑶3激動劑共同刺激單核細(xì)胞，使NK細(xì)胞的增殖優(yōu)先于T細(xì)胞的增殖。還有，關(guān)于因追加CD3激動劑而導(dǎo)致的NK細(xì)胞活化，因?yàn)镹K細(xì)胞不具有CD3分子，所以并不是CD3激動劑直接刺激NK細(xì)胞，可認(rèn)為是經(jīng)由基于⑶3激動劑和⑶52激動劑的T細(xì)胞活化而產(chǎn)生的二次效果。本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法的優(yōu)選例子中，可在⑶3激動劑以0. I u g/ml以下的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激，可在CD3激動劑以0. 001 u g/ml以上、較好是
0.03 u g/ml以上的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激，可在⑶52激動劑以20 u g/ ml以下的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激，可在CD52激動劑以2 ii g/ml以上的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激，還可在CD52激動劑和CD3激動劑以上述各濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激，更好是在存在20 u g/ml的CD52激動劑和0. I u g/ml的CD3激動劑的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。此外，CD52激動劑的濃度可以在20 u g/ml以上。如果采用這樣的優(yōu)選例子，能夠以NK細(xì)胞的增殖優(yōu)先于T細(xì)胞的增殖的方式對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。還有，CD3激動劑的濃度高至誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)行最大限度的DNA合成的程度時(shí)，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的增殖優(yōu)先，NK細(xì)胞的增殖反而受到抑制。本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法的優(yōu)選例子中，對從外周血、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓、腫瘤、胸水、腹水或臍帶血采集的單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。所述單核細(xì)胞更好是由外周血單核細(xì)胞組成。本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法的優(yōu)選例子中，通過IL-2對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。采用IL-2的刺激可與采用CD52激動劑和CD3激動劑的刺激同時(shí)進(jìn)行，也可以在采用CD52激動劑和⑶3激動劑的刺激之后進(jìn)行。采用IL-2的刺激可每隔2天 3天進(jìn)行I次。如果采用本發(fā)明的NK細(xì)胞活化方法，則可制備大量的NK細(xì)胞，能夠制備以50%以上的比例包含NK細(xì)胞的單核細(xì)胞、以70% 95%的比例包含NK細(xì)胞的單核細(xì)胞。此外，本發(fā)明的單核細(xì)胞是含T細(xì)胞和NK細(xì)胞的單核細(xì)胞，以50%以上的比例包含通過⑶52激動劑給予刺激而二次增殖得到的NK細(xì)胞。如果采用本發(fā)明，則能夠提供可在不與K562等混合的情況下安全且簡單地使對于各種腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等具有非特異性的細(xì)胞殺傷活性或ADCC活性的NK細(xì)胞活化而增殖的NK細(xì)胞活化方法以及使用該方法的NK細(xì)胞增殖方法及細(xì)胞制備方法。此外，如果采用本發(fā)明，則能夠提供含大量的NK細(xì)胞的單核細(xì)胞。


圖I是關(guān)于實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說明圖。圖2是關(guān)于實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說明圖。
具體實(shí)施例方式下面，基于附圖所示的例子對本發(fā)明的實(shí)施方式的例子進(jìn)行更詳細(xì)的說明。還有，本發(fā)明并不受到這些例子的任何限定。[實(shí)施例I]
實(shí)施例I中，進(jìn)行了考察于存在CD52激動劑的條件下和不存在CD52激動劑的條件下改變⑶3激動劑的濃度時(shí)的⑶16+NK細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞的比例的變化的實(shí)驗(yàn)。首先，通過使用Ficoll-Paque Plus (安法瑪西亞公司(Amershan Phar macia))的密度梯度離心法自健康人分離了外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將500 U I 用磷酸緩沖液(PBS)分別稀釋至 Oii g/ml、0. 01 U g/ml、0. I U g/ml 和Iu g/ml的作為⑶3激動劑的人⑶3抗體(ORTHO CLONE 0KT3，奧多生物技術(shù)公司(OrthoBiotech))分別加入24孔板(Falcon)的各孔中，在4°C處理一晚，由此將人⑶3抗體固相化于24孔板。24孔板的各孔在固相化后用PBS清洗2次。與上述同樣地將500 ill人⑶3抗體分別加入另一 24孔板(Falcon)的各孔中，再 向所述各孔中以20 ii g/ml添加作為⑶52激動劑的人⑶52抗體，在這里添加以PBS稀釋至lmg/ml的濃度的阿侖單抗(Alemtuzumab),在4°C處理一晚，由此將人⑶3抗體和人⑶52抗體固相化于另一 24孔板。另一 24孔板的各孔在固相化后用PBS清洗2次。接著，使分離得到的PBMC以I X 107ml的濃度懸浮于含IL_2 (175U/ml)的KBM540培養(yǎng)基(孝仁生物有限公司(Kohjin Bio))，在24孔板的各孔和另一 24孔板的各孔中分別添加Iml所得的培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)器內(nèi)于37°C培養(yǎng)3天。第4天，向24孔板的各孔和另一 24孔板的各孔中追加Iml培養(yǎng)液，添加2 00U/ml的IL-2。第6天，將24孔板的各孔的細(xì)胞移至6孔板，并將另一 24孔板的各孔的細(xì)胞移至另一 6孔板，以2天 3天的間隔添加200U/ml的IL-2的同時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)第13天，從6孔板的各孔和另一 6孔板的各孔取3 X IO5個(gè)細(xì)胞至微量離心管(eppendorf tube),向其中加入FITC標(biāo)記抗人⑶8抗體、PE標(biāo)記抗人⑶4抗體和PC5標(biāo)記抗人CD16抗體各3i!g/ml，通過常規(guī)方法對細(xì)胞進(jìn)行了染色。染色后的細(xì)胞立即用FACSCalibur進(jìn)行分析，求出⑶8+T細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞和⑶16+NK細(xì)胞的比例。如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為，未用人⑶52抗體處理而僅用人⑶3抗體處理的由6孔板得到的細(xì)胞數(shù)的比例如下。不論人CD3抗體刺激的強(qiáng)度如何，CD8+T細(xì)胞、CD16+NK細(xì)胞分別都在49% 56%、24% 34%的較窄范圍內(nèi)變化。此外，⑶4+T細(xì)胞隨著人⑶3抗體刺激增強(qiáng)而增加至20%。用人⑶52抗體處理的由另一 6孔板得到的細(xì)胞數(shù)的比例如下。用人⑶52抗體20 ii g/ml和人⑶3抗體Oii g/ml處理(僅用人⑶52抗體處理)的細(xì)胞數(shù)的比例為，⑶16+NK細(xì)胞在66%左右，⑶4+T細(xì)胞低于1%，⑶8+T細(xì)胞在27%左右。用人⑶52抗體20 y g/ml和人⑶3抗體0. 01 u g/ml處理的細(xì)胞數(shù)的比例為，⑶16+NK細(xì)胞在95%左右，⑶4+T細(xì)胞在1%左右，⑶8+T細(xì)胞在10%左右。用人⑶52抗體20 ii g/ml和人⑶3抗體0. I u g/ml處理的細(xì)胞數(shù)的比例為，⑶16+NK細(xì)胞在66%左右，⑶4+T細(xì)胞在3%左右，⑶8+T細(xì)胞在29%左右。用人⑶52抗體20 u g/ml和人⑶3抗體I y g/ml處理的細(xì)胞數(shù)的比例為，⑶16+NK細(xì)胞在35%左右，⑶4+T細(xì)胞在5%左右，⑶8+T細(xì)胞在55%左右。與僅用人⑶3抗體處理而得的⑶16+NK細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞的比例的變化相比，用人⑶52抗體和人⑶3抗體處理(包括僅用人⑶52抗體處理的情況)而得的⑶16+NK細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)較大的比例的變化。即使在僅用人⑶52抗體處理的情況下，⑶16+NK細(xì)胞也在50%以上，高達(dá)66%，⑶8+T細(xì)胞% 27%, CD4+T細(xì)胞低于I %。如上所述，用人CD52抗體20 u g/ml和人CD3抗體0. 01 u g/ml處理而得的⑶16+NK細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞的比例的差異顯著，⑶16+NK細(xì)胞在90%以上，為95%左右。⑶8+T細(xì)胞的比例隨著人⑶3抗體的濃度從0. 01 u g/ml提高至I y g/ml而上升，人CD3抗體的濃度為I U g/ml時(shí)超過了 CD16+NK細(xì)胞的比例。不論人CD3抗體的濃度如何，CD4+T細(xì)胞的增殖都較少。由上述結(jié)果可知，實(shí)施例I中，通過僅用⑶52抗體或用⑶52抗體和⑶3抗體來刺激單核細(xì)胞，誘導(dǎo)了 NK細(xì)胞的活化、增殖。還有，NK細(xì)胞不具有CD3分子，所以認(rèn)為通過采用CD52抗體的刺激或采用CD52抗體和CD3抗體的刺激而活化的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等的存在間接地參與了 NK細(xì)胞的增殖。[實(shí)施例2] 實(shí)施例2中，進(jìn)行了關(guān)于小規(guī)模的細(xì)胞增殖的抗體濃度依賴性的實(shí)驗(yàn)。通過與實(shí)施例I同樣的步驟，準(zhǔn)備各孔用0 U g/ml、0. 001 U g/ml、0. 01 U g/ml、
0.I ii g/ml和I ii g/ml的濃度的0)3抗體分別處理后用0 y g/ml、2 y g/ml和20 y g/ml的濃度的CD52抗體分別處理而得的24孔板，向該24孔板的各孔中添加I X IO6個(gè)的PBMC進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)施例2的培養(yǎng)第19天的細(xì)胞數(shù)示于圖I。圖I中顯示，關(guān)于培養(yǎng)的PBMC的細(xì)胞數(shù)，用⑶52抗體0 ii g/ml和⑶3抗體0 ii g/ml處理時(shí)為18 X IO6個(gè)左右，用CD52抗體0 u g/ml和CD3抗體0. OOlu g/ml處理時(shí)為32 X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體0 ii g/ml和⑶3抗體0. 01 ii g/ml處理時(shí)為33 X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體0 ii g/ml和CD3抗體0. I u g/ml處理時(shí)為28 X IO6個(gè)左右，用CD52抗體0 u g/ml和CD3抗體I U g/ml處理時(shí)為40 X IO6個(gè)左右。圖I中顯示，關(guān)于培養(yǎng)的PBMC的細(xì)胞數(shù)，用⑶52抗體2 U g/ml和⑶3抗體0 ii g/ml處理時(shí)為18 X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體2 u g/ml和⑶3抗體0. 001 y g/ml處理時(shí)為26 X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體2 u g/ml和⑶3抗體0. 01 y g/ml處理時(shí)為38 X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體2 ii g/ml和CD3抗體0. I u g/ml處理時(shí)為44 X IO6個(gè)左右，用CD52抗體2 u g/ml和CD3抗體I U g/ml處理時(shí)為40 X IO6個(gè)左右。圖I中顯示，關(guān)于培養(yǎng)的PBMC的細(xì)胞數(shù)，用⑶52抗體20 U g/ml和⑶3抗體0 ii g/ml處理時(shí)為20X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體20 u g/ml和⑶3抗體0. 001 u g/ml處理時(shí)為34 X IO6個(gè)左右，用CD52抗體20 u g/ml和CD3抗體0. 01 y g/ml處理時(shí)為40 X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體20 u g/ml和⑶3抗體0. I u g/ml處理時(shí)為49 X IO6個(gè)左右，用⑶52抗體20 u g/ml和⑶3抗體I ii g/ml處理時(shí)為43 X IO6個(gè)左右。圖I中，用CD3抗體0. I u g/ml和CD52抗體20 u g/ml處理PBMC時(shí)細(xì)胞數(shù)最多。[實(shí)施例3]實(shí)施例3中，進(jìn)行了使用如上所述固相化有CD3激動劑和CD52激動劑的燒瓶在IL-2的存在下由PBMC大量增殖NK細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。雖然僅用⑶52抗體就可誘導(dǎo)NK細(xì)胞，但實(shí)施例2中發(fā)現(xiàn)⑶3抗體0. Iii g/ml、⑶52抗體20 u g/ml時(shí)達(dá)到最高的增殖率，所以在該條件下對PBMC進(jìn)行刺激培養(yǎng)?？贵w向燒瓶的固相化如下進(jìn)行在20ml的PBS中添加抗體，使最終濃度達(dá)到抗CD3抗體(ORTHO CLONE 0KT3) 0. I u g/ml和抗CD52抗體(阿侖單抗)20 u g/ml，將其加入燒瓶中，在4°C靜置一晚。臨使用燒瓶前，用IOml PBS清洗該燒瓶2次，清洗后添加90ml的KBM540。
使IX IO8個(gè)分離得到的PBMC懸浮于KBM540 (IOml)中，添加至加入有培養(yǎng)液的燒瓶。在CO2培養(yǎng)器內(nèi)于37°C培養(yǎng)3天，第4天添加200U/ml的IL-2。第6天，將上述燒瓶內(nèi)的細(xì)胞懸浮液直接移入加入有KBM540 (IOOOml)的CO2透過性袋，每隔2天 3天追加給予IL-2 (100U/ml)。如上所述，求出培養(yǎng)后的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，用流式細(xì)胞儀考察CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD16+NK細(xì)胞各自的比例，計(jì)算各細(xì)胞群的細(xì)胞數(shù)。圖2是以時(shí)間序列表示實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞增殖的圖。圖2中顯示，培養(yǎng)7天后的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為，⑶16+NK細(xì)胞在0.8X IO9個(gè)左右，⑶4+T細(xì)胞在I. 2X IO9個(gè)左右，⑶8+T細(xì)胞在I X IO9個(gè)左右；培養(yǎng)11天后的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為，⑶16+NK細(xì)胞在2. I X IO9個(gè)左右，⑶4+T細(xì)胞在I. 2 X IO9個(gè)左右，⑶8+T細(xì)胞在2. IX IO9個(gè)左右；培養(yǎng)13天后的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為，⑶16+NK細(xì)胞在3. 7X10 9個(gè)左右，⑶4+T細(xì)胞在I. 8X IO9個(gè)左右，⑶8+T細(xì)胞在2. 6 X IO9個(gè)左右；培養(yǎng)15天后的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為，⑶16+NK細(xì)胞在6. 3 X IO9個(gè)左右，⑶4+T細(xì)胞在I X IO9個(gè)左右，⑶8+T細(xì)胞在2. 3 X IO9個(gè)左右；培養(yǎng)18天后的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為，⑶16+NK細(xì)胞在6. 8 X IO9個(gè)左右，⑶4+T細(xì)胞在0. 8 X IO9個(gè)左右，⑶8+T細(xì)胞在2. 2 X IO9個(gè)左右；培養(yǎng)21天后的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為，⑶16+NK細(xì)胞在11 X IO9個(gè)左右，⑶4+T細(xì)胞在I X IO9個(gè)左右，CD8+T細(xì)胞在2. 8 X IO9個(gè)左右。實(shí)施例3中，CD16+NK細(xì)胞經(jīng)21天的培養(yǎng)而增殖至2100倍，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在培養(yǎng)第11天后增殖基本停滯。
對于上述的用各抗體進(jìn)行處理的載體，可例舉培養(yǎng)塑料容器，但不局限于此，也可以是珠或其他抗體可附著的載體。
權(quán)利要求
1.一種NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，通過CD52激動劑刺激含T細(xì)胞和NK細(xì)胞的單核細(xì)胞而使NK細(xì)胞活化。
2.如權(quán)利要求I所述的NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，通過所述CD52激動劑和CD3激動劑共同刺激單核細(xì)胞，使NK細(xì)胞的增殖優(yōu)先于T細(xì)胞的增殖。
3.如權(quán)利要求2所述的NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，在CD3激動劑以0.I u g/ml以下的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。
4.如權(quán)利要求2或3所述的NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，在CD3激動劑以0.001 u g/ml以上的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。
5.如權(quán)利要求I 4中的任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，在CD52激動劑以20 ii g/ml以下的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。
6.如權(quán)利要求I 5中的任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，在CD52激動劑以2 ii g/ml以上的濃度存在的培養(yǎng)基中對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。
7.如權(quán)利要求I 6中的任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，對從外周血、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓、腫瘤、胸水、腹水或臍帶血采集的單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。
8.如權(quán)利要求I 7中的任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞活化方法，其特征在于，通過IL-2對單核細(xì)胞進(jìn)行刺激。
9.一種NK細(xì)胞增殖方法，其特征在于，使用權(quán)利要求I 8中的任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞活化方法使NK細(xì)胞增殖。
10.一種細(xì)胞制備方法，其特征在于，使用權(quán)利要求I 8中的任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞活化方法制備含NK細(xì)胞的單核細(xì)胞。
11.一種單核細(xì)胞，其中包含T細(xì)胞和NK細(xì)胞，其特征在于，以50%以上的比例包含通過CD52激動劑給予刺激而二次增殖得到的NK細(xì)胞。
全文摘要
NK細(xì)胞活化方法中，通過CD52激動劑刺激含T細(xì)胞和NK細(xì)胞的單核細(xì)胞而使NK細(xì)胞活化。采用CD52激動劑的單核細(xì)胞的刺激在細(xì)胞因子的存在下進(jìn)行。
文檔編號C12N5/078GK102634484SQ20111004323
公開日2012年8月15日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月15日
發(fā)明者益山純一 申請人:株式會社賽萊克斯, 益山純一