專利名稱：一種環(huán)境中雄激素的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及環(huán)境生物技術領域，具體涉及一種環(huán)境中雄激素的檢測方法。
背景技術：
環(huán)境激素是環(huán)境中存在的能夠像激素一樣影響人體內分泌功能的化學物質的總稱。環(huán)境性類固醇激素由于在自然界食物鏈中可富集，難以降解和失活等特點，會嚴重破壞生物體正常的激素生理活動。環(huán)境雄激素可與雄激素受體(AR)結合，從而模擬雄激素活性， 發(fā)揮雄激素作用。環(huán)境性類固醇激素對人類生殖健康的影響已經引起人們的廣泛關注，建立一套快速、有效、準確的篩檢測試環(huán)境性類固醇激素的方法已經成為當務之急。目前有關環(huán)境雄激素污染的監(jiān)測已有研究，測評環(huán)境雄激素的方法有 Hershberger試驗、青春期雄鼠試驗等、雄激素受體結合試驗、雄激素依賴細胞增殖篩選試驗、雄激素依賴基因轉錄試驗等(張國軍.環(huán)境抗雄激素檢測方法.國外醫(yī)學.衛(wèi)生學分冊；Foreign Medical Sciences-hygine，2003年02期)。國內有學者應用雄激素配體-受體結合特性，開發(fā)了一種環(huán)境類雄激素的ELISA定量檢測方法(專利編號200910191914. X)。但這些方法都比較繁瑣，特別是基于雄激素受體_配體結合的方法不能準確反應激素的生物學活性，難以可靠地對環(huán)境中雄激素進行檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于根據現(xiàn)有技術中的不足，提供一種環(huán)境中雄激素的檢測方法。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的
本發(fā)明的技術方案是利用黃鱔腦芳香化酶基因垂體中特異啟動子受雄激素上調的特點，建立一種通過檢測雄激素對上述啟動子的激活情況，實現(xiàn)對環(huán)境雄激素進行檢測的方法。一種環(huán)境中雄激素的檢測方法，是用黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子(該啟動子僅在黃鱔垂體中起作用)連接熒光素酶報告基因載體，構建報告質粒，將報告質粒、黃鱔雄激素受體表達質粒和內參質粒共轉染LbetaT2細胞(小鼠垂體促性腺激素細胞)，用待測樣品刺激轉染后的LbetaT2細胞，通過檢測熒光素酶的活性來檢測樣品中的雄激素。所述黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子序列如SEQ ID NO: 1所示。所述熒光素酶報告基因載體為pGL3-BasiC。所述內參質粒為pRL-TK (海腎熒光素酶對照報告質粒)，作為轉染實驗的內參照， 可以避免因轉染效率的差異對結果的影響。所述共轉染LbetaT2細胞所用試劑為Lipofectamine 2000 (該試劑轉染效率較高)，且轉染后在無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6小時后，更換新的培養(yǎng)基再培養(yǎng)22-26 小時。所述用待測樣品刺激轉染后的LbetaT2細胞，通過檢測熒光素酶的活性來檢測樣品中雄激素，是在樣品刺激后22-26小時再檢測熒光素酶活性。
所述樣品中的雄激素為二氫睪酮，其他雄激素的作用機制與二氫睪酮相同，本發(fā)明的方法也可以用于檢測其他種類的雄激素。pGL3-BasiC螢火蟲熒光素酶報告基因載體是本領域技術人員經常使用的一種熒光酶檢測系統(tǒng)，pGL3-Basic載體不含啟動子及增強子，將可能的啟動子序列克隆到熒光素酶基因的上游，就可以測定其是否具有啟動熒光素酶基因表達的活性。黃鱔雄激素受體表達質粒是黃鱔本身的受體，更適合于黃鱔基因啟動子活性分析。本發(fā)明將黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子序列亞克隆至pGL3-BasiC載體螢火蟲熒光素酶基因上游，從而構建一個報告質粒。因為黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子序列上含雄激素反應元件(ARE，雄激素反應元件核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示)，因此能特異地對雄激素刺激產生反應。將上述構建好的報告質粒、黃鱔雄激素受體表達質粒以及內參質粒(pRL-TK)共轉染LbetaT2細胞，在無酚紅高糖DMEM (Gibco，含10%無激素胎牛血清)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4_6 小時后，更換新的培養(yǎng)基再培養(yǎng)22-26小時后，用待測樣品對轉染后的LbetaT2細胞進行刺激，刺激后22-26小時檢測熒光素酶活性。根據熒光素酶活性是否明顯升高可以檢測待測環(huán)境樣品的雄激素活性物質的存在。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明利用黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子受雄激素上調的特殊性，通過檢測雄激素對這種啟動子的激活情況而檢測環(huán)境性激素的存在。采用的技術方案基于檢測雄激素的生物學活性，結果可靠，重復性好，靈敏度高，且操作簡單方便。


圖1為實施例1中黃鱔腦芳香化酶垂體特異啟動子活性對雄激素二氫睪酮DHT的劑量反應曲線。EBAPII為黃鱔腦芳香化酶垂體特異啟動子報告質粒；AREtk為陽性對照質粒。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1
黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，為申請人自己克隆，已經在網上公布。本實施例采用Promega公司的pGL3-BasiC螢火蟲熒光素酶報告基因載體。本發(fā)明將上述黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子序列亞克隆至pGL3-BasiC載體螢火蟲熒光素酶基因上游，常規(guī)方法構建一個報告質粒，命名為EBAPI。將LbetaT2細胞(本實施例由美國加州大學圣地亞哥分校的Pamela Mellon 博士贈予，市面上可以購買)轉移至24孔板(每孔IO5細胞)，然后采用Invitrogen的 Lipofectamine 2000 (Ιμ 7孔)把報告質粒(380 ng)、黃鱔雄激素受體表達質粒(50 ng，自己構建，將黃鱔雄激素受體cDNA編碼區(qū)克隆到Invitrogen公司的pcDNA3. 0表達載體中)、以及Promega公司的內參質粒pRL-TK (20 ng)共轉染到LbetaT2細胞中，在無酚紅高糖 DMEM (Gibco，含10%無激素胎牛血清)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時后，更換新的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 小時后，用待測樣品(本實施例中為環(huán)境水樣，經過除菌處理)對轉染細胞進行刺激，刺激后 24小時裂解細胞，采用雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Promega)測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性是否升高就可以檢測待測環(huán)境樣品的雄激素活性物質的存在。
權利要求
1.一種環(huán)境中雄激素的檢測方法，是用黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子連接熒光素酶報告基因載體，構建報告質粒，將報告質粒、黃鱔雄激素受體表達質粒和內參質粒共轉染LbetaT2細胞，用待測樣品刺激轉染后的LbetaT2細胞，通過檢測熒光素酶的活性來檢測樣品中的雄激素。
2.根據權利要求1所述環(huán)境中雄激素的檢測方法，其特征在于所述黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.根據權利要求1所述環(huán)境中雄激素的檢測方法，其特征在于所述熒光素酶報告基因載體為 pGL3_Basic。
4.根據權利要求1所述環(huán)境中雄激素的檢測方法，其特征在于所述內參質粒為 pRL-TK。
5.根據權利要求1所述環(huán)境中雄激素的檢測方法，其特征在于所述共轉染LbetaT2細胞所用試劑為Lipofectamine 2000，且轉染后在無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)4_6小時后，更換新的培養(yǎng)基再培養(yǎng)22-26小時。
6.根據權利要求1所述環(huán)境中雄激素的檢測方法，其特征在于所述用待測樣品刺激轉染后的LbetaT2細胞，通過檢測熒光素酶的活性來檢測樣品中雄激素，是在樣品刺激后 22-26小時再檢測熒光素酶活性。
7.根據權利要求1所述環(huán)境中雄激素的檢測方法，其特征在于所述雄激素為二氫睪酮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種環(huán)境中雄激素的檢測方法，是用黃鱔腦芳香化酶基因垂體特異啟動子連接熒光素酶報告基因載體，構建報告質粒，將報告質粒、黃鱔雄激素受體表達質粒和內參質粒共轉染LbetaT2細胞，用待測樣品刺激轉染后的LbetaT2細胞，通過檢測熒光素酶的活性來檢測樣品中的雄激素。本發(fā)明的檢測方法重復性好、靈敏度高，檢測結果可靠，且操作簡單方便，可廣泛應用于環(huán)境中的雄激素檢測。
文檔編號C12Q1/66GK102168138SQ20111004321
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權日2011年2月23日
發(fā)明者張為民, 張利紅, 張揚, 張燊 申請人:中山大學