專利名稱：小麥條銹菌單管一步巢式pcr檢測方法及引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病害流行監(jiān)測領(lǐng)域，尤其涉及一種小麥條銹病單管巢式一步PCR 檢測方法及引物。
背景技術(shù)：
小麥條銹病是我國主要糧食作物小麥上最重要的病害，其發(fā)生危害直接影響小麥產(chǎn)量及質(zhì)量，威脅國家糧食安全。1949年以來，我國小麥條銹病的4次大流行分別造成小麥產(chǎn)量損失6. 0,3. 0,1. 8和1. 3億公斤。小麥條銹病是一種氣傳大區(qū)流行性病害，隴南、隴東被公認(rèn)為我國小麥條銹病越夏基地，該區(qū)域秋苗小麥條銹病的發(fā)生情況對其它流行區(qū)春季病害的發(fā)展至關(guān)重要，因此實現(xiàn)對隴南、隴東小麥條銹病的早期監(jiān)測及其防控是我國小麥條銹病綜合治理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。長期以來，傳統(tǒng)的檢測方法主要是根據(jù)病害癥狀、病原形態(tài)學(xué)、生理學(xué)的特性進行檢測，該方法存在診斷過程繁瑣、時間周期長，而且檢測準(zhǔn)確性低、靈敏度不高的缺點，重要的是無法實現(xiàn)尚未顯癥的病害侵入的監(jiān)測。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是基于核酸擴增(PCR)技術(shù)使得建立準(zhǔn)確、靈敏、高效的早期病害診斷及病原菌檢測成為可能。^iao 等、Wang等利用小麥條銹菌與小麥其它葉部病原菌核糖體ITS序列的差異，設(shè)計特異性引物，實現(xiàn)了對小麥條銹病的分子診斷與檢測，該技術(shù)已經(jīng)申請專利(專利號CN1888886)。 巢式PCRfcested PCR)是為了提高檢測靈敏度，使用兩套引物通過兩輪PCR特異性擴增目標(biāo)DNA片斷，第二對引物的功能是特異性的擴增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷，以提高靈敏度及特異性。2009年Wang等在^iao的工作基礎(chǔ)上，設(shè)計巢式PCR引物對，利用兩管兩步巢式PCR方法，可以在小麥條銹病菌潛育24h后檢測到小麥條銹病菌的侵入。普通的巢式PCR通常是需要兩步反應(yīng)，在兩個PCR管內(nèi)完成，由于巢式PCR的高靈敏性，存在樣品污染、步驟繁瑣等缺點。單管巢式PCR(Single tube nested PCR, stn PCR) 是通過內(nèi)、外兩對引物退火溫度的差異，實現(xiàn)在單個PCR管內(nèi)一步完成巢式PCR反應(yīng)，從而克服普通巢式PCR的不足。目前國內(nèi)外尚未見基于單管巢式PCR方法檢測小麥條銹菌的報道及應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高的小麥條銹菌單管一步巢式PCR引物對。小麥條銹病菌潛伏期的幼苗攜帶的菌量少，與幼苗共同提取的DNA中病菌的DNA 比例極低，進行PCR檢測時對引物的特異性、靈敏性要求非常高，針對小麥條銹病菌潛伏期的幼苗的檢測，本發(fā)明提供了單管一步巢式PCR檢測所用的特異引物對，該特異引物對由正向外引物、反向外引物、正向內(nèi)引物和反向內(nèi)引物組成；正向外引物5，-TATGATGGCCACCTTCTCCGTTGTCC-3，；反向外引物5，-AAGTATCGGCCGTGTCTCGGGTCA GA-3，；
正向內(nèi)引物5，-CCTAAGGTGTCTGATACCGTT-3，；反向內(nèi)引物5，-GGCATCAAACATTTGCGA-3，。本發(fā)明的另一個目的是提供一種特異性好、靈敏度高、操作簡單的小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測方法。本發(fā)明的小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測方法，是以待測小麥葉片或未知病原菌孢子DNA為模板，應(yīng)用上述的特異引物對，在單個PCR反應(yīng)管內(nèi)進行PCR擴增，檢測PCR 產(chǎn)物，獲得372bp PCR產(chǎn)物的待測小麥或未知病原菌孢子為受到小麥條銹病菌的侵染的小麥或條銹菌孢子。上述正向外引物與正向內(nèi)引物的摩爾比為1 150。上述正向外引物和反向外引物的摩爾比為1 1 ；上述正向內(nèi)引物和反向內(nèi)引物的摩爾比為1:1。上述PCR檢測方法中，PCR反應(yīng)體系為常規(guī)PCR反應(yīng)體系，如Ex Taq Mix 12. 5yL,
0.ΙμΜ上述正、反外引物各1.0μ ，10μΜ的正、反向內(nèi)引物各1. 5 μ L，20ng/μ L模板DNA
1.0 μ L，用 ddH20 補足至 25. 0 μ L。上述PCR檢測方法中，PCR反應(yīng)程序為適合引物擴增常規(guī)PCR反應(yīng)程序，如95°C 預(yù)變性5min ；95°C變性30sec，72°C退火延伸60sec，20個循環(huán)；95°C變性30sec，60°C退火 30sec, 72°C延伸 50sec，35 個循環(huán)。本發(fā)明的再一個目的是提供一種特異性好、靈敏度高、操作簡單的小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測試劑盒。本發(fā)明的小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測試劑盒，含有上述的特異引物對。除了上述特異引物對外，該試劑盒還可以含有進行PCR擴增所需要的試劑，該試劑包括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液等。本發(fā)明的特異引物對是根據(jù)已報道的小麥條銹菌微管蛋白基因序列設(shè)計的引物， 能夠?qū)⑵渑c小麥其它病害區(qū)分開來。本發(fā)明利用單管巢式PCR方法，可檢測小麥條銹菌DNA 的最低濃度為20fg/μ L，大大提高了檢測的靈敏度，對處于潛伏期的病原菌也能及時檢測到。本發(fā)明采用單管巢式PCR，不需要兩次擴增，降低檢測成本，方法簡單、省時。本發(fā)明的方法可用于田間小麥條銹病的早期檢測與病害監(jiān)測，對田間小麥條銹病預(yù)防和防治具有重要的有意義。


圖1小麥條銹菌內(nèi)引物Pst-InF/Pst-InR特異性檢測圖。圖2小麥條銹菌內(nèi)引物Pst-InF/Pst-InR靈敏性檢測圖。圖3單管巢式PCR (stn PCR)靈敏性檢測圖。圖4潛育期小麥葉片的stn PCR檢測圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的實驗材料小麥條銹菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici, Pst)共 8 個生理小種或菌系，源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植病流行學(xué)實驗室單孢繁殖；小麥葉銹菌(P. recondite f. sp. tritici, Prt) > 小麥稈繡菌(P. graminis f. sp. tritici，Pgt)、小麥白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt)分別為2個菌系，來源于中國農(nóng)科院植保所、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，均由中國農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)大學(xué)植病流行學(xué)實驗室保存收存；小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacereals)、赤霉病菌(Fusarium graminearum)、葉枯病菌 (Alternariatriticina)禾口小麥*艮腐病菌(Cochliobolus sativus)各 1 個菌系，i羊見表 1。
表1.本實驗所使用的菌系材料
權(quán)利要求
1.單管一步巢式PCR檢測的特異引物對，該特異引物對由正向外引物、反向外引物、正向內(nèi)引物和反向內(nèi)引物組成；正向外引物5’ -TATGATGGCCACCTTCTCCGTTGTCC-3，；反向外引物5，-AAGTATCGGCCGTGTCTCGGGTCAGA-3，；正向內(nèi)引物5’ -CCTAAGGTGTCTGATACCGTT-3，；反向內(nèi)引物5，-GGCATCAAACAT TTGCGA-3，。
2.權(quán)利要求1所述的特異引物對在檢測小麥條銹菌中的應(yīng)用。
3.小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測方法，是以待測小麥基因組DNA或未知病原菌孢子DNA為模板，應(yīng)用權(quán)利要求1所述的特異引物對，在單個PCR反應(yīng)體管內(nèi)進行PCR擴增， 檢測PCR產(chǎn)物，獲得372bp的PCR產(chǎn)物的待測小麥或未知病原菌孢子為受到小麥條銹病菌的侵染的小麥或條銹菌孢子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的特異引物對，其特征在于所述外引物與所述內(nèi)引物的濃度比為 1 150。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的特異引物對，其特征在于所述正向外引物和所述反向外引物的摩爾比為1 1 ；所述正向內(nèi)引物和所述反向內(nèi)引物的摩爾比為1 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異引物對，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系為ExTaq Mix 12. 5yL，0. 1 μ M所述正向外引物、反向外引物各1. 0 μ L，10 μ M的所述正向內(nèi)引物、反向內(nèi)引物各 1. 5μ L，20ng/y L 模板 DNA 1. 0μ L，用 ddH20 補足至 25. 0 μ L0
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異引物對，其特征在于所述PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min ；95°C變性 30sec，72°C退火延伸 60sec，20 個循環(huán)；95°C變性 30sec，60°C退火 30sec, 72°C延伸50sec, 35個循環(huán)。
8.含有權(quán)利要求1所述特異引物對的小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測試劑盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測試劑盒，其特征在于還含有進行PCR擴增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP和/或PCR緩沖液試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測方法及引物。該方法通過在單個PCR反應(yīng)管內(nèi)，利用內(nèi)、外兩對小麥條銹病菌特異性引物，一次性完成巢式PCR擴增，通過目標(biāo)片段判定待測小麥或未知病原菌孢子為受小麥條銹病菌侵染的小麥或小麥條銹菌，內(nèi)、外兩對小麥條銹病菌特異性引物的核苷酸殘基的序列如SEQ ID No.1、2、3和4所示。本發(fā)明的方法檢測靈敏度達20fg，特異性好，簡單易行，可用于田間小麥條銹病的早期檢測與病害監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/68GK102154485SQ20111004313
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者孫振宇, 王海光, 馬占鴻, 黃沖 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)