用于特異性檢測小麥條銹菌的scar標記及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于特異性檢測小麥條銹菌的SCAR標記及檢測方法，屬于生物技術(shù)和植物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】。所述SCAR標記的核苷酸序列長度為237bp，對小麥條銹菌的檢測具有高度的?；裕跈z測來自我國不同麥區(qū)的小麥條銹菌標樣中，該標記均穩(wěn)定顯現(xiàn)，而在小麥葉銹、稈銹及其它麥類病原真菌上均沒有“污染性”擴增，可用于小麥條銹菌病害的診斷、檢測和測報調(diào)查。本發(fā)明提供的檢測方法，在小麥條銹菌的檢測中具有較高的特異性、靈敏度和可靠性，可以在病害潛育階段進行PCR檢測，根據(jù)條銹菌特異性SCAR標記的出現(xiàn)概率進行病害早期預(yù)警，以提早開展病害流行測報和及時指導(dǎo)病害防治。
【專利說明】用于特異性檢測小麥條銹菌的SCAR標記及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于特異性檢測小麥條銹菌的SCAR標記及檢測方法，屬于生物 技術(shù)和植物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥鎊病包括條鎊?。≒uccinia striiformis West. f. sp. tritici Eriks.)、 葉鎊病（Puccinia recondita Rob. ex Desm. f. sp. tritici Erikss. Et Henn.)和桿鎊病 (Puccinia graminis Pers. f. sp. tritici Erikss. Et Henn.)三種，是一類由鎊菌引致的真 菌性病害。該類病害是中國乃至全世界所有產(chǎn)麥國家的一類重要病害，世界上不同國家或 地區(qū)三種銹病發(fā)生的種類、分布與危害程度等各不相同。
[0003] 由小麥條銹菌Puccinia striiformis f. sp. tritici引起的小麥條銹病是世界性 的禾谷類病害，據(jù)統(tǒng)計，其每年在全世界范圍內(nèi)就可造成約40%的損失（Ullerup，1991)。 我國是世界上最大的小麥條銹病流行區(qū)（萬安民，2000)，發(fā)生范圍涉及16個省市，病 害流行時，面積超過400X 104-500X 104hm2，造成10%-70%的產(chǎn)量損失，年均產(chǎn)量損失 100 X 107kg，嚴重情況甚至絕收（李振岐和曾士邁，2002 ;Chen，2005 ;Chen et al.，2009)。 建國以來，條銹病曾于1950、1964、1990和2002年大流行，分別引起產(chǎn)量損失達60 X ΙΟ8、 30 X 108、26 X 108 和 10 X 108kg (Chen et al.，2009)。近年來由于新的毒性小種 CY32 和 CY33 的發(fā)展，致使我國80%的小麥生產(chǎn)品種喪失抗性。21世紀以來，條銹病在2001年到2009 年在我國西南、西北片區(qū)連年流行，發(fā)生頻率越來越高，已成為制約我國小麥可持續(xù)發(fā)展的 影響因素。
[0004] 小麥條銹病的危害一直嚴重地影響著小麥生產(chǎn)，該類病害使谷物大量減產(chǎn)，品質(zhì) 降低，被條銹菌侵染的種子活力低，萌發(fā)率低，成活率減少。病原菌以無性孢子的形式隨高 空氣流傳播，廣泛分布于我國及世界上其它的小麥種植區(qū)，是危害最重的病害。若條銹菌在 小麥早期侵染，發(fā)生在生長季節(jié)，可造成小麥100%的損失。小麥條銹病曾于1950,1964， 1990和2002年四次大流行，給我國小麥生產(chǎn)造成沉重損失。當前，小麥條銹病仍是威脅我 國西南、華北和淮北等冬麥區(qū)和西北春麥區(qū)的最重要病害之一，由于其流行頻率高、暴發(fā)性 強、發(fā)生范圍廣等特點，容易造成全國大面積流行。同時，近年來新小種和新致病類型的不 斷出現(xiàn)和發(fā)展使此病害流行的可能性更高，潛在威脅更大，涉及范圍更廣，嚴重威脅小麥高 產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，2004年小麥條銹病發(fā)病面積近4000萬畝，2005年發(fā)病面積高達1億畝 次以上，2006年小麥條銹病有所緩和，但發(fā)病面積仍高達7000萬畝，2007年，發(fā)病早，流行 速度快，前期危害嚴重，因及時防治，后期干旱，同比下降23. 5%，發(fā)病面積累計約為5400 萬畝，雖有所緩和，仍為當前病蟲害防治的重點。
[0005] 長期以來，小麥銹病的預(yù)測預(yù)報主要基于定期、大規(guī)模的田間病情調(diào)查和室內(nèi)病 菌小種的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。不僅耗時費工，而且其結(jié)果的準確性和可信度也在很大程 度上取決于調(diào)查測報人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗，難以滿足快速、高通量診斷檢測的實際需求。 葉銹病和條銹病的苗期癥狀區(qū)別不甚明顯，一些基層植物保護人員常常將二者混淆，不能 準確區(qū)分。在小麥葉銹菌的潛育階段，寄主的發(fā)病癥狀不易觀察，難以界定初侵染的時期和 規(guī)模。因此，有必要利用現(xiàn)代生物技術(shù)，研發(fā)簡單易行、靈敏準確的小麥葉銹菌快速診斷和 檢測手段。
[0006] 近年來，隨著基因芯片和實時PCR技術(shù)的發(fā)展，基于特定基因序列開發(fā)的特異 PCR引物或探針，已被越來越多地用在病原菌的生物學(xué)、群體結(jié)構(gòu)、流行動態(tài)、基因漂移等 研究中。對病害診斷、病原菌鑒定而言，靶標序列的獲得通常源自保守基因的序列比較或 染色體組的隨機探查。DNA/RNA探針技術(shù)和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)具有強?；?、高靈敏 度以及程序化試驗操作等特點，現(xiàn)已被廣泛用于絲核菌Rhizoctonia solani、R. oryzae、 R. oryzaesativae、炭痕菌 Colletotrichum acutatum、多黏菌 Polymyxa betae、黑粉菌 Tilletia indic、T. walkeri、Ustilago hordei、鎌刀菌 Fusarium oxysporum、F. culmorum、 F. graminearum、F. avenaceum、葉枯菌 Stagonospora nodorum、Septoria tritici 等多種植 物病原真菌的鑒定檢測。鑒于癥狀診斷的局限性以及形態(tài)學(xué)鑒定的復(fù)雜性，已有學(xué)者成功 研發(fā)出基于PCR技術(shù)的三種銹病的診斷檢測技術(shù)。在小麥條銹菌的研究方面，中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院植物保護研究所采用PCR方法，建立了以β -微管蛋白序列為基礎(chǔ)的小麥條銹菌和葉 銹菌特異性分子診斷檢測技術(shù)（曹麗華等，2007 ;Cao et al.，2008)。此外，美國明尼蘇達 大學(xué)的學(xué)者采用RT-PCR的方法，建立了以ITS1序列為區(qū)分標準的小麥三種銹菌的檢測技 術(shù)（Barnes and Szabo, 2007);西北農(nóng)林科技大學(xué)亦采用PCR方法，建立了直接從受感染的 小麥葉片中區(qū)別條銹菌的檢測技術(shù)（Wang et al.，2008)。該類技術(shù)體系均是建立在核酸技 術(shù)基礎(chǔ)上，依靠病原菌基因組中的特異性DNA序列進行檢測，包括樣品提取、PCR擴增以及 擴增產(chǎn)物的分析，用于病害診斷檢測的準確性和可靠性均較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案如下：
[0008] 小麥條銹菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 用于小麥條銹菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標記引物，其核苷酸序列 為：
[0010] PSTF117 :5, -CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3，，
[0011] PSTR363 :5 ' -CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3 '。
[0012] 一種檢測小麥感染條銹菌（Puccinia striiformis)的方法，包括如下步驟：
[0013] (1)以待測小麥為材料，提取樣品DNA ;
[0014] (2)以樣品DNA為模板，采用上述SCAR標記引物進行PCR反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物；
[0015] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，若擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)237bp特征條帶，則所述樣 品DNA中含有小麥條銹菌；若擴增產(chǎn)物的大小不是237bp，則樣品DNA中不含有小麥條銹 菌。
[0016] 所述 PCR 反應(yīng)的體系為：20ng/ μ L 模板 DNA1 μ L，10 μ Μ 引物 PSTF1171 μ L，10 μ Μ $*PSTR3631 yL，2XEasyTaqPCRSuperMixl2.5yL，ddH209.5 yL。
[0017] 所述PCR反應(yīng)的條件為：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、55. 5°C退火30s、72°C延 伸lmin，35個循環(huán)；72°C延伸8min。
[0018] 用于檢測小麥條銹菌的試劑盒，其特征在于：包括液態(tài)的或粉狀的用于小麥條銹 菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標記引物，其核苷酸序列為：
[0019] PSTF117 :5' -CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3'，
[0020] PSTR363 :5, -CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3，。
[0021] 本研究根據(jù)真菌的保守基因合成引物Bt2a/Bt2b，其核苷酸序列為：
[0022] Bt2a : 5 ' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3 '，
[0023] Bt2b :5, -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3，。
[0024] 以小麥條銹菌、小麥葉銹菌、小麥桿銹菌等病原菌的基因組DNA為模板，進行PCR 比較擴增。擴增及測序結(jié)果顯示，該引物在小麥條銹菌的DNA中擴增出361bp長度的片段， 在小麥葉銹菌、小麥桿銹菌的DNA中都擴增出495bp片段。為了獲得能夠特異地將條銹菌 從葉銹、桿銹菌及其它類似麥類病原真菌中鑒別出來，需要進一步設(shè)計特異引物。
[0025] 本發(fā)明進一步設(shè)計出了?；詸z測引物PSTF117/PSTR363,對條銹菌進行PCR擴 增，獲得了小麥條鎊菌的特異性 SCAR(sequence characterized amplified region)標記， 其核苷酸序列的長度為237bp。所述SCAR標記對小麥條銹菌的檢測具有高度的?；?，在 檢測來自我國不同麥區(qū)的小麥條銹菌標樣中，該標記均穩(wěn)定顯現(xiàn)，而在小麥葉銹、桿銹及其 它麥類病原真菌上均沒有"污染性"擴增。因此，所述SCAR標記可用于小麥條銹菌病害的 診斷、檢測和測報調(diào)查。
[0026] 本發(fā)明還提供一種特異性檢測小麥條銹菌的方法，采用?；颬STF117/ PSTR363,以待測樣品的基因組DNA為模板，按照優(yōu)選的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行PCR 反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的大小，若擴增產(chǎn)物中含有237bp特征條帶，則待測樣 品中含有小麥條銹菌，反之亦然。所述方法在小麥條銹菌的檢測中具有較高的特異性、靈敏 度和可靠性，其靈敏度可達〇. 〇〇〇〇 lng/ μ L模板DNA濃度水平。
[0027] 本發(fā)明還提供用于檢測小麥條銹菌的試劑盒，用于小麥條銹菌的分子診斷，供我 國縣級以上植保植檢部門推廣應(yīng)用。小麥條銹菌成功侵染寄主小麥后，一般需要9?14天 甚至更長時間才能產(chǎn)生新的傳播體（病菌夏孢子）。室內(nèi)接種試驗表明，小麥條銹菌侵入寄 主后9h，即可利用該SCAR標記檢測到小麥條銹菌的特異性DNA片段。因此，在小麥生產(chǎn)實 踐中，可以在病害潛育階段進行PCR檢測，根據(jù)條銹菌特異性SCAR標記的出現(xiàn)概率進行病 害早期預(yù)警，以提早開展病害流行測報和及時指導(dǎo)病害防治。這對于降低小麥條銹病的防 治成本、阻斷病害的擴散蔓延、確保我國小麥安全生產(chǎn)具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1.小麥條銹菌、葉銹菌和桿銹菌的gDNA的PCR比較擴增結(jié)果，
[0029] 其中，點樣孔中的樣品從左至右依次為2個條銹、2個葉銹、2個桿銹;Marker條帶 大小從下往上依次為 l〇〇bp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp。
[0030] 圖2.小麥桿銹菌與葉銹菌的特異性DNA片段比對結(jié)果，
[0031] 其中，6-1片段為小麥桿銹菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉銹菌的特異性 DNA片段，其同源性為100%。
[0032] 圖3.小麥條銹菌與葉銹菌的特異性DNA片段比對結(jié)果，
[0033] 其中，1-5片段為小麥條銹菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉銹菌的特異性 DNA片段，其同源性為31. 23%。
[0034] 圖4.小麥條銹菌SCAR標記的特異性驗證，
[0035] 其中，點樣孔中的樣品從左至右依次為5個小麥條銹菌CY17, CY18, CY19, CY32， CY33 ;3個小麥葉銹菌PHT，THT，PHP ;3個小麥桿銹菌34C1，MFM，MFC ;2個小麥白粉菌；2個 小麥赤霉菌PH-1，PH-2 ;1個光腥黑粉菌TFL ;1個網(wǎng)腥黑粉菌TCT ;滅菌水（對照）；Maker 條帶大小從下往上依次為 l〇〇bp，200bp，300bp，400bp，500bp，750bp，lOOObp。
[0036] 圖5.小麥條銹菌SCAR標記的靈敏度檢測結(jié)果，
[0037] 其中，點樣孔中小麥條銹菌模板DNA的濃度從左至右依次為ZOng/yLUOng/ μ L、lng/y L、0. lng/μ L、0. Olng/μ L、0. OOlng/μ L、0. OOOlng/μ L、0. OOOOlng/μ L、 0· 000001ng/ μ L ;Maker 條帶大小從下往上依次為 100bp，200bp，300bp，400bp，500bp， 750bp,1000bp。
[0038] 圖6.感病小麥葉片內(nèi)條銹菌的檢測結(jié)果，
[0039] 其中，點樣孔中的樣品從左至右依次為接種小麥條鎊囷后9h ; 12h ;20h ;24h ;48h ; 72h ;96h ;120h ;健康葉片；Maker 條帶從下往上依次為 100bp，200bp，300bp，400bp，500bp， 750bp,1000bp。

【具體實施方式】
[0040] 以下參考具體實施例對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅作為解釋 和說明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0041] 生物材料：
[0042] 小麥品種：
[0043] 銘賢169、鄭麥5389,已知品種，均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所。
[0044] 小麥病原真菌菌種及來源：
[0045] 小麥條銹菌菌種：CY33, CY32, CY17, CY18, CY19,均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保 護研究所；
[0046] 小麥葉銹菌菌種：PHT，THT，THD，PHK，PHP，PHJ，均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護 研究所；
[0047] 小麥桿銹菌菌種：34C1，MFM，MFC，21C3, 34C2均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護 研究所；
[0048] 小麥白粉菌菌種：1，10,均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所；
[0049] 小麥赤霉菌菌種：PH-1，PH-2,均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所；
[0050] 光腥黑粉菌菌種：TFL，來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所；
[0051] 網(wǎng)腥黑粉菌菌種：TCT，來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所。
[0052] 上述生物材料本實驗室亦有保存，可自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗證實 驗。
[0053] 供試小麥病原真菌的繁殖與保藏：
[0054] 供試小麥條銹菌真菌在銘賢169 (已知小麥品種）上進行；
[0055] 小麥葉銹菌、小麥桿銹菌的夏孢子以及小麥白粉菌的菌絲、分生孢子均在鄭麥 5389上繁殖；
[0056] 其它小麥病原真菌在鋪墊有賽璐玢膜的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
[0057] 備用菌種在4°C冰箱內(nèi)暫存，或真空封存后于液氮內(nèi)長期保存。
[0058] 試劑耗材：深圳依諾金生物有限公司Catcher Sp in GEK2050凝膠回收試劑盒。
[0059] 儀器設(shè)備：M J Research, Inc.的 PTC2220 型 PCR 儀、ULTRA-URLET PRODUCTS 凝膠 成像系統(tǒng)。
[0060] 本發(fā)明未特別說明的實驗試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，或采用本領(lǐng)域常規(guī)方法配制 而得，可商購獲得，規(guī)格為實驗室純級即可。
[0061] 實施例1.小麥病原真菌基因組DNA(gDNA)的提取 [0062] 采用Villar0a丨等的方法。
[0063] 小麥3種銹菌和白粉菌gDNA分別提取自潛育期的感病小麥葉片和病原菌夏孢子 或分生孢子，其它小麥病原真菌的gDNA則來源于營養(yǎng)體菌絲。感病小麥葉片或營養(yǎng)體菌絲 直接用液氮冷凍研磨至粉狀，銹菌、白粉菌孢子則采用玻璃珠震蕩法破壁，其余DNA提取操 作按照常規(guī)方法進行。以適量RNase消化RNA后，采用紫外分光光度法測定gDNA的質(zhì)量與 濃度。
[0064] 實施例2. PCR比較分析及小麥條銹菌特異性核酸序列的克隆、測序
[0065] 參照"Glass and Donaldson, 1995. "在真菌的保守基因的報道，合成引 物 Bt2a/Bt2b，其核苷酸序列為：Bt2a :5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'，Bt2b : 5' -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。
[0066] PCR 分析均在 M J Research, Inc.的 PTC2220 型 PCR 儀上進行。
[0067] 小麥條銹菌、葉銹菌和桿銹菌gDNA的PCR比較擴增體系為25yL，其中包 括 10XPCR Buffer(Mg2+Plus)2yL，dNTP Mixture (各 2.5mmol/L)0.3yL，Bt2a/ Bt2b(10ymol/L)ly L,模板 DNA (20ng/μ L) 1. 0 μ L，TaKaRa Taq (5U/μ L) 0· 3 μ L， ddH2016. 9μ L。
[0068] ?0?反應(yīng)條件為：941：21^11，1個循環(huán)；941：158,551：3〇8,721：9〇8,30個循環(huán) ； 72°C lOmin，1 個循環(huán)。
[0069] 擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1. 5的瓊脂糖凝膠、0. 5XTBE電泳緩沖液電泳分離，以 ULTRA-URLET PRODUCTS凝膠成像系統(tǒng)記錄分析電泳譜型。在紫外燈下快速切取小麥條銹菌 的特異性PCR條帶，以深圳依諾金生物有限公司Catcher Sp in GEK2050凝膠回收試劑盒回 收純化，交上海生工技術(shù)公司雙向測序。測序結(jié)果以NCBI的BasicLocalAlignment Search Tool進行序列拼接，得到特異性PCR片段的序列全長，繼而以BLASTN程序與Gen2Bank、 EMBL、DDBJ、PDB中的序列進行同源性比對。
[0070] 實驗結(jié)果：用引物Bt2a和Bt2b組合對小麥條銹菌、葉銹菌和桿銹菌的gDNA進行 PCR比較擴增。結(jié)果表明，小麥條銹菌具有長度為361bp的特異性DNA片段，而小麥葉銹菌 和小麥桿銹菌具有長度為495bp的特異性DNA片段（圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，小麥葉銹菌和小麥 桿銹菌的特異性DNA片段同源性為100% (圖2)，而小麥條銹菌與其同源性為31. 23% (圖 3)。
[0071] 實施例3.小麥條銹菌SCAR標記的獲得及其特異性驗證
[0072] 根據(jù)PCR比較擴增獲得的小麥條銹菌特異性DNA片段序列，設(shè)計并篩選獲得特異 性引物PSTF117/PSTR363,其核苷酸序列為：
[0073] PSTF117 :5, -CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3，，
[0074] PSTR363 :5' -CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3'，
[0075] 交北京賽百盛基因技術(shù)有限公司進行化學(xué)合成。通過進一步優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及 循環(huán)條件，獲得了長度為237bp的小麥條銹菌特異性SCAR標記。
[0076] PCR 反應(yīng)體系為：20ng/ μ L 模板 DNA1 μ L，10 μ Μ 引物 PSTF1171 μ L，10 μ Μ 引物 PSTR3631 μ L,2XEasyTaq PCR SuperMixl2. 5 μ L, ddH209. 5 yL〇
[0077] PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、55. 5°C退火30s、72°C延伸 lmin，35 個循環(huán)；72°C延伸 8min。
[0078] 以小麥主要病原真菌即小麥條銹菌Puccinia striiformis、桿銹菌Puccinia graminis、赤霉菌 Fusarium gram inearum、白粉菌 Erysiphe graminis、光月星黑粉菌 Tilletia foetida(Wallr.) Liro、網(wǎng)腥黑粉菌Tilletia caries為對照，檢測小麥條銹菌標 樣。結(jié)果表明，該SCAR標記對小麥條銹菌的檢測具有高度的專化性，在所有參檢的5個小 麥條銹菌標樣中均呈現(xiàn)陽性擴增，而在對照的3個小麥葉銹菌菌株、3個小麥桿銹菌株及其 它檢測的小麥病原真菌（赤霉菌Fusarium gram inearum、白粉菌Erysiphe graminis、光 腥黑粉菌Tilletia foetida(Wallr.)Liro、網(wǎng)腥黑粉菌Tilletia caries)中則沒有擴增到 該標記（圖4)。
[0079] 實施例4.小麥條銹菌SCAR標記的靈敏度檢測
[0080] 梯度稀釋小麥條銹菌模板DNA濃度為20ng/ μ L、10ng/ μ L、lng/ μ L、0. lng/ μ L、 0· Olng/ μ L、0. OOlng/ μ L、0. OOOlng/ μ L、0. OOOOlng/ μ L、0. OOOOOlng/ μ L。以稀釋的小麥 條銹菌gDNA為模板，采用特異性引物PSTF117/PSTR363,按照實施例3中優(yōu)化的PCR反應(yīng)體 系及循環(huán)條件進行擴增。
[0081] 結(jié)果表明，從0· OOOOlng/ μ L的模板DNA中還能檢測到長度為237bp的SCAR標記 (圖 5)。
[0082] 實施例5.感病小麥葉片內(nèi)條銹菌的檢測
[0083] 以小麥條銹菌菌株室內(nèi)苗期接種銘賢169,接種菌量為5mg每盆，對照處理噴滑石 粉。接種小麥葉片樣品，以無菌水清洗葉面后，液氮速凍，儲存于_8〇°C冰箱中，用于小麥銹 病顯癥前條銹菌的檢測。分別提取小麥條銹菌接種后9h、12h、20h、24h、48h、72h、96h、120h 及健康的小麥葉片gDNA，采用特異性引物PSTF117/PSTR363,按照實施例3中優(yōu)化的PCR反 應(yīng)體系及循環(huán)條件進行擴增。結(jié)果表明，在銹病顯癥前的小麥葉片中均成功地檢測到相應(yīng) 的小麥條銹菌SCAR標記，并且最早于接種后9h可檢測出相應(yīng)的小麥條銹菌SCAR標記（圖 6)。
[0001] SEQUENCE LISTING <110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 <120>用于特異性檢測小麥條銹菌的SCAR標記及撿測方法 <I30> P140589/ZWB <160> 8 <170> Patcnlln version 3.5 <210> 1 <211> 237 <212> DNA <213> Arlificial Sequence <220〉 <223> 小麥條銹菌（Pucciniastriiformis)特異性SCAR標記 <400> i cacgcgggac glacttattg tcagaggcct gcgatggtgt agactcagta tgtgcgccta 60 ggaagigcgt glgcggaigc cicgaagggl lalacctcal igaaalagac gllcalgcgc 120 tccagctgga ggtcagalgt gccallgtai ciagcagatg uagaglgci gltclgcagg 180 ailcglccaa cacgaacala cacgccggaa gcgicgailc calgllcgcc agaaalg 237 <210〉 2 <211> 22 <212> DNA <213〉 Artificial Sequence <220> <223>用于小麥條銹菌（Pucciniastriiformis)檢測的SCAR標記引物PSTF117 <400〉 2 cacgcgggac glacttattg tc 22 <210〉 3 <21 Γ> 22
[0002] <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>用于小麥條銹菌（Pucciniastniformis)檢測的SCAR標記引物PSTR363 <400> 3 callictggc gaacalggaa tc 22 <210 4 <2il> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>用于擴增特異性DNA片段的引物Bt2a <400> 4 gglaaccaaa tcgglgclgc Uic 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <2I3> ArLidcial Sequence <220> <223>用于擴增特異性DNA片段的引物Bt2b <400> 5 accclcaglg tagtgacccl tgge 24 <210> 6 <211> 361 <212> DNA <213> Artillcial Sequence <220> <223>小麥條銹菌（Pucciniastriiformis)的特異性DNA片段 <4〇〇> 6 igagatgUg ccggcgccag aclggccgga lacgaaglcg tcgggacgga agagclgacc 60
[0003] gaaggggcct gcacgaacgg cgtctalggc accgggcicc aaatcgacga ggacggcacg 120 cgggacgtac tlallgtcag aggcclgcga iggtgtagac tcagtatgtg cgcciaggaa 180 g^-gcgtgtgc ggatgcctcg aagggttala cclcattgaa atagacgttc algcgclcca 240 gctggagglc agalgtgcca Uglalclag cagatgitag aglgclgUc Igcaggaitc 300 glccaac aacatacacg ccggaagcgl cgaltccatg tlcgccagaa alggtclgcc 360 a 361 <210> 7 <211〉 495 <212> 13NA <213> Artificial Sequence <220> <223>小麥葉銹菌CPuccinia tritidnia)的特異性DNA片段 <400> 7 iggLatgltt icggcaaltg ggagaalcag ggegetaegg ggttcagiag aaaaLacigg 60 acltllgggg gtcgcLctgt Ualigcggt glgacaigct gacaalgltl acaggcagac 120 calclctggt gagcacggcc Ugaeggege cgglgtglaa gtgcaagccg ccaitcgacl 180 allcgcialt cgagaglgaa attagaaacg aaagaalcga llglclgalg ggattgcagt 240 tacaatggct cctccgacct ccagctggag cggalgaacg Ictactltaa cgaggtlcgt 300 gtcltigccc tgggatataa accgtiaccg tgaltclgac ctcltcatta ggetagegge 360 cagaaglacg ttccccgtgc cglcclggtt gaccligagc ctggiaccal ggalgccgic 420 cglgccggtc cattcggtca gclcttccgl cccgacaact tcglcltcgg ccaglctggl 480 gctggtaaca actgg 495 <210> 8 <211〉 495
[0004] <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>小麥桿銹菌（Pucciciniagraminis)的特異性DNA片段 <400> 8 Igglatgltl Icggcaaltg ggagaalcag ggegetaegg ggltcaglag aaaataclgg 60 acltllgggg gtcgclctgl llallgcggt glgacalgci gacaalgtll acaggcagac 120 catctctggt gagcacggcc ttgaeggege cggtgtglaa glgcaagccg ccaltcgact 180 allcgctall cgagaglgaa allagaaacg aaagaatega tlgtclgatg ggallgcagl 240 lacaalggcl cctccgaccl ccagctggag cggalgaacg tclaclltaa cgaggltcgl jOO glctllgccc Igggalalaa accgUaccg Igallctgac ctcltcatla ggetagegge j6〇 cagaagtacg ttccccgtgc cgtcctggtt gaccltgagc ctggtaccal ggatgccgtc 420 cgtgccgglc caUcggtca gclcUccgl cccgacaacl tcgtcltcgg ccagtclggl 480 gctggtaaca actgg 495
【權(quán)利要求】
1. 小麥條銹菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 用于小麥條銹菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標記引物，其核苷酸序列 為： PSTF117 :5' -CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3'， PSTR363 :5' -CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3'。
3. -種檢測小麥感染條銹菌（Puccinia striiformis)的方法，包括如下步驟： (1) 以待測小麥為材料，提取樣品DNA ; (2) 以樣品DNA為模板，采用權(quán)利要求2所述的SCAR標記引物進行PCR反應(yīng)，得到擴增 產(chǎn)物； (3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，若擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)237bp特征條帶，則所述樣品 DNA中含有小麥條銹菌；若擴增產(chǎn)物的大小不是237bp，則樣品DNA中不含有小麥條銹菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述PCR反應(yīng)的體系為：20ng/ μ L模板DNA1 μ L， ΙΟμΜ 引物 PSTF1171yL，10yM 引物 PSTR3631 yL，2XEasyTaq PCR SuperMixl2. 5 μ L, ddH209. 5 μ L〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，所述PCR反應(yīng)的條件為：94°C預(yù)變性4min;94°C變 性 30s、55. 5°C退火 30s、72°C延伸 lmin，35 個循環(huán)；72°C延伸 8min。
6. 用于檢測小麥條銹菌的試劑盒，其特征在于：包括液態(tài)的或粉狀的用于小麥條銹菌 (Puccinia striiformis)檢測的SCAR標記引物，其核苷酸序列為： PSTF117 :5' -CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3'， PSTR363 :5' -CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3'。
【文檔編號】C12R1/645GK104120124SQ201410334101
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】高利, 陳萬權(quán), 劉太國, 劉博
申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所