一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞upr水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用，質(zhì)粒為pUST-08質(zhì)粒，利用基因克隆技術(shù)，依次將Gal10p、Rluc-Hac1p、Hac1i、Fluc克隆到質(zhì)粒YCplac33中，組成Gal10p-Rluc-Hac1p-Fluc-Hac1i?UPR檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告元件。該系統(tǒng)可用于檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平。本發(fā)明檢測(cè)周期短、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)操作簡便、成本低。
【專利說明】—種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于用于細(xì)胞UPR檢測(cè)質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)大量未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上過度積累時(shí)，在真核生物酵母乃至高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都廣泛存在一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫應(yīng)激機(jī)制，其中最顯著的就是未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)，UPR通過激發(fā)IREl在內(nèi)的多種調(diào)節(jié)因子，并利用IREl的核酸內(nèi)切酶活性識(shí)別并剪切HAC13’末端的內(nèi)含子序列，使Hacli喪失對(duì)HACl翻譯抑制作用提高HACl的表達(dá)水平，進(jìn)而提高下游蛋白折疊相關(guān)的分子伴侶的表達(dá)，以此降低未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的過度積累應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫。
[0003]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫及未折疊蛋白響應(yīng)與重組蛋白的異源表達(dá)產(chǎn)率密切相關(guān)(appliedmicrob1logy and b1technology46, 365,1996)，也與人類的神經(jīng)性病變、心血管疾病、糖尿病等多種疾病有直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系(Science Translat1nal Medicine5,138, 2013 ；Nature Reviews Drug Discoveryl2, 703, 2013),針對(duì)UPR進(jìn)行的檢測(cè)和研究是探索相關(guān)工業(yè)和醫(yī)療蛋白質(zhì)生產(chǎn)、疾病發(fā)病機(jī)制的重要技術(shù)手段(Methods Enzymol.490,31,2011),同時(shí)也是相關(guān)疾病治療及診斷的重要突破口(Science Translat1nal Medicine5,138,2013)。
[0004]利用信使HACl選擇性剪接對(duì)UPR的響應(yīng)機(jī)制(celll07，103，2001)，將HACl啟動(dòng)子及內(nèi)含子移植到表達(dá)質(zhì)粒中研究UPR產(chǎn)生后IREl對(duì)質(zhì)粒HACl的調(diào)控機(jī)制。證實(shí)了 HACl在表達(dá)質(zhì)粒中同樣具有靈敏的UPR響應(yīng)調(diào)控機(jī)制。
[0005]現(xiàn)有檢測(cè)UPR水平的方法主要有(I) RT-PCR或northern-blot檢測(cè)HACl表達(dá)水平及HACl內(nèi)含子剪接率；(2)利用未折疊蛋白響應(yīng)元件UPRE來檢測(cè)UPR水平；(3)利用免疫共沉淀(IP)分析UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)量來檢測(cè)UPR水平；(4)通過生化指標(biāo)，如Ca2+含量等，來檢測(cè)細(xì)胞UPR水平。但都存在無法克服的缺點(diǎn)，如:
[0006]1.RT-PCR或Northern-blot實(shí)驗(yàn)周期長、靈敏度低；
[0007]2.檢測(cè)UPRE或IP時(shí)難以避免蛋白折置受抑制后對(duì)標(biāo)記蛋白折置的干擾；
[0008]3.現(xiàn)有的Ca2+等離子測(cè)定精度不高，且實(shí)驗(yàn)成本高、實(shí)驗(yàn)周期長；
[0009]4.需要借助內(nèi)參進(jìn)行定量，無法對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行高通量檢測(cè)；


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用，該發(fā)明檢測(cè)周期短、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)操作簡便、成本低。
[0011]本發(fā)明的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為pUST-08質(zhì)粒；具體為GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR雙熒光素酶報(bào)告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0012]本發(fā)明的一種監(jiān)測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的構(gòu)建，包括:
[0013](I)設(shè)計(jì)用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴(kuò)增的上下游引物；
[0014](2)利用PCR技術(shù)，以含Gal 1p序列的質(zhì)粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的質(zhì)粒PJD375和含Hacli序列的酵母基因組作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列；
[0015](3)利用基因克隆技術(shù)，依次將GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到質(zhì)粒YCplac33中，組成Gal1p-Rluc-Haclp-Fluc-HacIi UPR雙熒光素酶報(bào)告元件，即為pUST-08 質(zhì)粒。
[0016]所述步驟(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴(kuò)增的上下游引物為:
[0017]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ;如 SEQ ID NO:1 所示
[0018]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ;如 SEQ ID NO:2 所示
[0019]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ;如 SEQ ID NO:3 所示
[0020]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；如SEQ ID NO:4 所示
[0021]Hacl1-F:GGGGTAC CTATAGCGGGAAACAGTCTAC ;如 SEQ ID NO:5 所示
[0022]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ;如 SEQ ID NO:6 所示
[0023]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ;如 SEQ ID NO:7 所示
[0024]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC? 如 SEQ ID NO:8 所示
[0025]所述PUST-08是一種能夠在大腸桿菌及釀酒酵母中穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)的低拷貝穿梭型重組質(zhì)粒。所述pUST-08能夠通過其雙熒光素酶報(bào)告元件中的HACl內(nèi)含子序列響應(yīng)UPR，調(diào)控其上游的Fluc報(bào)告基因的表達(dá)。
[0026]所述pUST-08能夠通過其雙熒光素酶報(bào)告元件中的GallO啟動(dòng)子，控制雙熒光素酶報(bào)告元件的轉(zhuǎn)錄的開啟與關(guān)閉，提高UPR監(jiān)測(cè)的操作性。
[0027]所述雙熒光素酶報(bào)告元件中的Rluc可作為UPR檢測(cè)時(shí)螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因Fluc的內(nèi)對(duì)照，消除單一報(bào)告基因在UPR檢測(cè)過程中，因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫后的蛋白折疊效率改變，對(duì)單一熒光素酶活性造成的干擾。
[0028]本發(fā)明的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，包括:
[0029](I)將pUST-08轉(zhuǎn)入釀酒酵母BY4741a中，于SC-URA培養(yǎng)基中篩選；
[0030](2)將上述攜帶有pUST-08的酵母BY4741a進(jìn)行復(fù)蘇，次日進(jìn)行活化，離心，洗滌，配制酵母菌懸液；
[0031](3)取上述酵母菌懸液，并分成兩等份，分別轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中，靜置誘導(dǎo)，然后向一份中加入D-突光素鉀檸檬酸鈉溶液,另一份加入腔腸素溶液，避光晃動(dòng)20-30s,然后在Imin內(nèi)檢測(cè)熒光素酶熒光值。
[0032]所述步驟⑵中活化為0.60D_的初始菌濃活化4hr。
[0033]所述步驟⑵中洗滌為用無菌水懸洗。
[0034]所述步驟⑵配制酵母菌懸液為:用2%葡萄糖為碳源的SC_URA、2%半乳糖作為碳源的SC-URA或2%半乳糖作為碳源并添加藥物的SC-URA懸起來，即得。
[0035]所述藥物衣霉素Tm和/或二硫蘇糖醇DTT ;優(yōu)選濃度為0.5mg/ml或2mg/ml的衣霉素(Tm)，0.1mM或0.5mM的二硫蘇糖醇(DTT)。
[0036]所述步驟(3)中靜置誘導(dǎo)為30°C靜置誘導(dǎo)3hr。
[0037]所述步驟(3)中D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液的濃度為ImM，腔腸素溶液的濃度為20 μ M ；D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液或腔腸素溶液于酵母菌懸液的體積比為1:1。
[0038]本發(fā)明設(shè)計(jì)并構(gòu)建一種能夠檢測(cè)活體細(xì)胞內(nèi)UPR的質(zhì)粒及利用該質(zhì)粒檢測(cè)不同UPR激活劑處理后活體細(xì)胞中的UPR水平。更具體的說，將HACl啟動(dòng)子5’UTR序列Haclp、HACl內(nèi)含子Hacli及其3’UTR序列完整移植到低拷貝穿梭質(zhì)粒YCplac33中，借助HACl在UPR激活后的特殊剪接機(jī)制，利用該質(zhì)粒搭載的雙熒光素酶報(bào)告基因，監(jiān)測(cè)活體細(xì)胞內(nèi)UPR的情況。
[0039]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫及未折疊蛋白響應(yīng)與重組蛋白的異源表達(dá)產(chǎn)率，以及人類的神經(jīng)性病變、心血管疾病、糖尿病等多種疾病密切相關(guān)，以HACl剪切為基礎(chǔ)的UPR檢測(cè)技術(shù)是研究蛋白藥物生產(chǎn)、相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物篩選的重要技術(shù)手段。但現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)存在操作繁瑣、靈敏度低等缺陷，難以滿足相關(guān)疾病研究及藥物篩選的高靈敏度、高通量的要求。依照本發(fā)明構(gòu)建的UPR監(jiān)測(cè)質(zhì)粒能夠方便、快捷、高通量的監(jiān)測(cè)活體細(xì)胞的UPR情況。
[0040]有益.效果
[0041](I)檢測(cè)周期短:利用pUST-08質(zhì)粒對(duì)酵母UPR水平進(jìn)行檢測(cè)周期短，僅需要3h的誘導(dǎo)、處理時(shí)間及Imin的檢測(cè)時(shí)間即可完成對(duì)酵母UPR水平的檢測(cè)，而傳統(tǒng)RT-PCR檢測(cè)方法，則需要3h的藥物處理、5h的總RNA提取、2h的cDNA合成、3h的PCR檢測(cè)、30min的凝膠電泳檢測(cè)。本檢測(cè)系統(tǒng)可以大大縮短檢測(cè)周期；
[0042](2)靈敏度高:傳統(tǒng)RT-PCR法檢測(cè)HACl剪切率，僅能檢測(cè)高濃度UPR誘導(dǎo)劑的UPR水平，對(duì)于低濃度UPR誘導(dǎo)劑的UPR水平則難以檢測(cè)。而本檢測(cè)系統(tǒng)，在檢測(cè)低濃度的UPR誘導(dǎo)劑，如0.5 μ g/mL的衣霉素(Tm)、0.1mM的二硫蘇糖醇(DTT)，依然可以檢測(cè)出UPR水平；
[0043](3)實(shí)驗(yàn)操作簡便、成本低:常規(guī)RT-PCR操作繁瑣、成本高昂，RT-PCR檢測(cè)主要包括總RNA的提取，cDNA的合成，PCR檢測(cè)，凝膠電泳檢測(cè)等內(nèi)容，總RNA提取及cDNA的合成需要使用價(jià)格較為昂貴的試劑盒。而本檢測(cè)系統(tǒng)，僅需要將待測(cè)樣品放置在30°C恒溫箱中靜置3h，加入熒光底物，直接可以通過多功能熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，相比較傳統(tǒng)RT-PCR檢測(cè)法，本法操作更為簡便、成本更低；
[0044](4)不需要額外設(shè)置內(nèi)參:對(duì)比與UPRE-LacZ通過檢測(cè)淀粉酶活性的辦法，往往需要額外設(shè)置內(nèi)參，且使用檢測(cè)精確度不高。而UPR檢測(cè)質(zhì)粒中GallOp啟動(dòng)子和Rluc海腎熒光素酶基因的加入，為本檢測(cè)系統(tǒng)提供了檢測(cè)所需的本底和內(nèi)參。檢測(cè)過程中，將不進(jìn)行半乳糖誘導(dǎo)的熒光值作為本底，將RLU作為內(nèi)參，可以方便的通過減去本底，對(duì)比RLU熒光強(qiáng)度計(jì)算出實(shí)際的FLU表達(dá)水平；
[0045] (5)本檢測(cè)系統(tǒng)具有傳統(tǒng)RT-PCR、Northern-blot、UPRE_Lacz不具備的優(yōu)勢(shì)，如周期短、靈敏度高、操作簡便、不需要額外設(shè)置內(nèi)參等特點(diǎn)，此外本檢測(cè)系統(tǒng)還可以利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行聞通量檢測(cè)，本檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫、UPR應(yīng)激等相關(guān)疾病及基礎(chǔ)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為UPR檢測(cè)質(zhì)粒pUST-08的工作原理圖；
[0047]圖2為UPR檢測(cè)質(zhì)粒pUST-08的構(gòu)建示意圖；
[0048]圖3為常規(guī)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT 處理后 HAClmRNA 的剪接率，圖中 HAClu 為 unspliced HACl,即代表未發(fā)生剪接的HACl ;圖中HACls為spliced HACl，即代表剪接后的HACl ；ACT1為內(nèi)參；
圖4為hac I Λ、ire I Λ衣霉素、DTT敏感度測(cè)試，SC+Tm為SC培養(yǎng)基中額外添加0.5 μ g/mL的衣霉素，SC+DTT為SC培養(yǎng)基中額外添加0.5mM DTT ；
[0049]圖5為通過多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)到pUST-08質(zhì)粒在野生型與HACl缺陷型酵母中誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生的相對(duì)Fluc/Rluc熒光強(qiáng)度比值；
[0050]圖6為通過多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)到pUST-09質(zhì)粒在野生型酵母中誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生的相對(duì)Fluc/Rluc熒光強(qiáng)度比值；
[0051]圖7為通過多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)到pUST-08質(zhì)粒在IREl缺陷型酵母中誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生的相對(duì)Fluc/Rluc熒光強(qiáng)度比值。

【具體實(shí)施方式】
[0052]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0053]實(shí)施例1
[0054]UPR檢測(cè)質(zhì)粒pUST-08的構(gòu)建
[0055]利用常規(guī)基因克隆技術(shù)依次將可操縱啟動(dòng)子GallOp、熒光素酶報(bào)告基因Rluc、HACl啟動(dòng)子5’ UTR序列Haclp、HACl內(nèi)含子Hacli及其3’ UTR序列、熒光素酶報(bào)告基因Fluc克隆到酵母低拷貝穿梭型質(zhì)粒YCplac33中(如圖2所示)。
[0056]1、設(shè)計(jì)引物
[0057]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
[0058]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
[0059]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
[0060]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
[0061]Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
[0062]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
[0063]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
[0064]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
[0065]2、以質(zhì)粒 YEP51-LIPIN1 為模板、GallOp - F 和 GallOp - R 作為擴(kuò)增引物(GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；)，使用常規(guī)PCR體系反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)熱3min ；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72°C延伸
2.5min ;最后72°C延伸lOmin。獲得GallOp的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。
[0066]3、將純化后的Gal 1p的PCR產(chǎn)物及YCplac33進(jìn)行Hindi 11,XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行純化回收。
[0067]4、將純化后的酶切產(chǎn)物GallOp及YCplac33經(jīng)T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質(zhì)粒，所獲質(zhì)粒為YCplac33-Gall0p。
[0068]5、以質(zhì)粒PJD375為模板、Rluc - Haclp - F和Rluc - Haclp _ R作為擴(kuò)增引物(Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG)，使用常規(guī)PCR體系反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)熱3min ;35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72°C延伸Imin ;最后72°C延伸lOmin，獲得Rluc-Haclp的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。
[0069]6、將純化后的 Rluc-Haclp 的 PCR 產(chǎn)物及 YCplac33_Gall0p 進(jìn)行 Xba1、BamHI 雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行純化回收。
[0070]7、將純化后的酶切產(chǎn)物Rluc-Haclp及YCplac33_經(jīng)T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質(zhì)粒，所獲質(zhì)粒為YCplac33_Gal1p-Rluc-HacIp。
[0071]8、以質(zhì)粒PJD375為模板、Hacl1- F和Hacli _ R作為擴(kuò)增引物(Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；Hacli _ R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；)，使用常規(guī) PCR 體系反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)熱3min ;35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72。。延伸30s ;最后72°C延伸lOmin，獲得Hacli的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。
[0072]9、將純化后的 Hacli 的 PCR 產(chǎn)物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp 進(jìn)行 ΚρηΙ、EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行純化回收。
[0073]10、將純化后的酶切產(chǎn)物Hacli及YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp經(jīng)T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質(zhì)粒，所獲質(zhì)粒為 YCplac33-Gal 1p-Rluc-HacIp-HacIi。
[0074]11、以質(zhì)粒PJD375為模板、Fluc - F和Fluc _ R作為擴(kuò)增引物(Flue - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC)，使用常規(guī) PCR 體系反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)熱3min ;35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:94°C變性20秒，55°C退火30s, 72°C延伸lmin30s ;最后72°C延伸1min,獲得Fluc的PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。
[0075]12、將純化后的 Fluc 的 PCR 產(chǎn)物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 進(jìn)行BamH1.Kpnl雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行純化回收。
[0076]13、將純化后的酶切產(chǎn)物 Hacli 及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 經(jīng) T4 連接酶的作用下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質(zhì)粒，所獲質(zhì)粒 YCp Iac33-Gal 1p-Rluc-Hac lp-Fluc-Hac I i，并命名為 pUST-08。
[0077]14、對(duì)所構(gòu)建的pUST-08質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與釀酒酵母基因文庫(SOT)中的HACl序列、YEP51-LIPIN1質(zhì)粒、PJD375質(zhì)粒序列分別進(jìn)行比對(duì)，證明所構(gòu)建的質(zhì)粒序列完全正確。
[0078]實(shí)施例2
[0079]利用UPR常規(guī)檢測(cè)技術(shù)RT-PCR來檢測(cè)HAClmRNA的選擇性剪接規(guī)律
[0080]利用常規(guī)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT 處理后 HAClmRNA 的剪接率
[0081]1、優(yōu)選地使用引物
[0082]ACT1-F:GCTTTGTTCCATCCTTCTG，如 SEQ ID NO: 9 所示；
[0083]ACT 1-R: GAAACACTTGTGGTGAACGjn SEQ ID NO: 10 所示；
[0084]HAC1-F:AGGAAAAGGAACAGCGAAGGjn SEQ ID NO: 11 所示；
[0085]HAC1-R:GAATTCAAACCTGACTGCGC，如 SEQ ID NO: 12 所示。
[0086]2、按照常規(guī)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HACl剪接率其步驟為:(I)將野生型酵母BY4741a克隆，挑入3mL SC-URA液體培養(yǎng)基中作為種子菌，30°C，180rpm，過夜培養(yǎng)；(2)次日，將上述種子菌分別轉(zhuǎn)接到新鮮6mL SC-URA液體培養(yǎng)基，保證初始菌濃在0.40D_左右，30°C，180rpm，額外添加0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT進(jìn)行處理3h，同時(shí)以不添加任何藥物的組作為對(duì)照組，同樣步驟處理3h ； (3)按照takara公司的酵母總RNA提取試劑盒(yeast RNAiso kit, code:D300)的步驟提取野生型酵母總RNA ; (4)按照 takara 公司的 cDNA 合成試劑盒(PrimeScript?IIlst Strand cDNA Synthesis Kit,6210A)操作方法合成cDNA ； (5)按照常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)HACl進(jìn)行PCR檢測(cè)，通過凝膠電泳及凝膠成像儀進(jìn)行光密度分析，并根據(jù)分析結(jié)果計(jì)算不同藥物處理后酵母HACl的剪接率。
[0087]3、結(jié)果，采集各處理組的樣品(n = 2)進(jìn)行HACl剪接率分析，不進(jìn)行藥物處理的對(duì)照組HACl剪接率7.5 %，0.5 μ g/mL衣霉素處理的酵母HACl剪接率為8.9 %，2 μ g/mL衣霉素處理的酵母HACl剪接率為24.9%，0.1mM的DTT處理的酵母HACl剪接率為9.1%，
0.5mM的DTT處理的酵母HACl剪接率為11.5%。對(duì)各組的酵母HACl剪接率進(jìn)行顯著性方差分析，設(shè)定α為0.05，發(fā)現(xiàn)僅2 μ g/mL衣霉素處理后的酵母HACl剪接率與對(duì)照組的HACl剪接率有顯著性差異(如附圖3所示)。
[0088]實(shí)施例3
[0089]had Δ、irel Δ為UPR超敏感菌株的證實(shí)
[0090]IREl介導(dǎo)的HAClmRNA剪切激活是UPR的重要途徑之一，合成的HACl能夠通過激活下游UPR相關(guān)基因的表達(dá)提聞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折置能力，以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫。HACl或IREl的缺陷將導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫下的IRE1/HAC1為的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫解救機(jī)制失效，加劇細(xì)胞內(nèi)的未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的積累。為了證實(shí)該論點(diǎn)，對(duì)HACl和IREl缺失突變體進(jìn)行UPR誘導(dǎo)藥物的敏感性試驗(yàn)。
[0091]1、將待測(cè)菌株(BY4741a，hacl Λ、irel Λ)挑入3mL SC液體培養(yǎng)基中作為種子菌，30°C，180rpm，過夜培養(yǎng)。
[0092] 2、取約I X 17的酵母細(xì)胞(0D_~I)，10倍比進(jìn)行梯度稀釋后(稀釋5個(gè)梯度)，每個(gè)濃度梯度取5ul稀釋后的菌液，滴在含有待測(cè)藥物(0.5 μ g/mL的衣霉素、0.5mM DTT)的SC固體培養(yǎng)基中，以不含的待測(cè)藥物的SC固體培養(yǎng)基作為對(duì)照，30°C培養(yǎng)2~5d后觀察。
[0093]3、通過藥物敏感性試驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)HACl和IREl的缺陷菌株表現(xiàn)出對(duì)UPR誘導(dǎo)藥物高度敏感(如圖4所示)，證實(shí)了 haclA、irelA為UPR超敏感菌株。
[0094]實(shí)施例4
[0095]pUST-08質(zhì)粒檢測(cè)UPR可靠性、靈敏度的證實(shí)為了驗(yàn)證所構(gòu)建的pUST_08UPR檢測(cè)質(zhì)粒的可靠性，將所構(gòu)建的pUST-08質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入野生型和HACl缺陷型酵母中，檢測(cè)衣霉素、DTT等藥物處理后UPR水平。利用藥物、濃度及菌株間的藥物敏感度不同所產(chǎn)生的UPR水平差異，來檢測(cè)本檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性，并對(duì)比實(shí)施例2的RT-PCR結(jié)果，進(jìn)一步論證本檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。
[0096]1、利用常規(guī)酵母電轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建好的pUST-08分別轉(zhuǎn)入野生型和HACl缺陷型釀酒酵母BY4741a中，經(jīng)SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0097]2、將上述攜帶有pUST-08質(zhì)粒的BY4741a陽性克隆，挑入3mL SC-URA液體培養(yǎng)基中作為種子菌，300C，180rpm,過夜培養(yǎng)。
[0098]3、次日，將上述種子菌分別轉(zhuǎn)接到新鮮6mL SC-URA液體培養(yǎng)基，保證初始菌濃在0.60D_左右，30°C，180rpm，培養(yǎng)約4hr后菌濃達(dá)到1.40D6(I(I，從中各取ImL分成1、2、3、4、5、6共6組轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管中，6000g/min，3min收集。收集后各組菌沉淀用ImL的無菌水懸洗一次，以同樣轉(zhuǎn)速離心收集后，組I用ImL等體積的2%葡萄糖為碳源的SC-URA懸起來、組2用等體積的2%半乳糖作為碳源的SC-URA懸起來、組3~6分別等體積的2%半乳糖作為碳源并額外添加不同藥物(0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT>0.5mM DTT)的 SC-URA 中懸起來。
[0099]4、各組設(shè)立2~4個(gè)平行各200 μ L，每個(gè)平行等分成兩份各100 μ L轉(zhuǎn)移到黑色96孔培養(yǎng)板中，封蓋后30°C恒溫靜置3hr。
[0100]5、避光條件下，向其中一份中加入100 μ L的熒光蟲熒光底物ImM D-1uciferin檸檬酸溶液(ImM D-luciferin0.1M檸檬酸鈉，PH = 5.0溶劑)，向另一份加入100 μ L的腔腸素溶液(ImM腔腸素0.1M檸檬酸鈉，PH = 5.0溶劑)，立即避光輕輕晃動(dòng)30s，使底物與熒光素酶充分混勻。
[0101]6、立即在Imin內(nèi)根據(jù)常規(guī)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)規(guī)程各樣品的熒光值，檢測(cè)模式為luminescence模式,檢測(cè)類型為endpoint,積分時(shí)間Is,其他均為系統(tǒng)默認(rèn)值。
7、實(shí)驗(yàn)過程中以同樣攜帶pUST-08的hacl缺陷菌株作為對(duì)照，按本實(shí)施例步驟中的2~6步的方法對(duì)攜帶有pUST-08質(zhì)粒的hacl缺陷菌株進(jìn)行相同的操作及檢測(cè)。
[0102]8、在野生型酵母進(jìn)行的檢測(cè)中，對(duì)比0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT處理后的Fluc/Rluc比值，發(fā)現(xiàn)野生型酵母經(jīng)不同濃度不同藥物處理后，F(xiàn)luc/Rluc比值與不進(jìn)行處理的對(duì)照有顯著差異，且其比值與藥物種類、處理濃度相對(duì)應(yīng)(如附圖5所示);通過與實(shí)施例2的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本檢測(cè)系統(tǒng)且能檢測(cè)出常規(guī)RT-PCR技術(shù)難以檢測(cè)的低濃度的衣霉素和DTT所引起的UPR，證實(shí)該檢測(cè)系統(tǒng)較常規(guī)UPR檢測(cè)技術(shù)靈敏度更高；在1^(31突變菌株的檢測(cè)中，進(jìn)行相同藥物及濃度的處理后，所檢測(cè)到的UPR水平較野生型要高。但對(duì)于2 μ g/mL的衣霉素處理后UPR水平，兩者無明顯差異(如附圖5所示)?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以證實(shí)pUST-08質(zhì)粒檢測(cè)UPR可靠性高、靈敏度高。
[0103]實(shí)施例5
[0104]pUST-08質(zhì)粒中的Haclintron剪接調(diào)節(jié)機(jī)制的證實(shí)
[0105]為了驗(yàn)證pUST-08質(zhì)粒中的Haclintron剪接調(diào)節(jié)機(jī)制與內(nèi)源Haclintron調(diào)節(jié)機(jī)制的一致性，分別針對(duì)Haclintron轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及IREl介導(dǎo)的Haclintron剪接進(jìn)行了驗(yàn)證。
[0106]1、在構(gòu)建好的pUST-08基礎(chǔ)上，在Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl終止序列CYClt,即 Fluc-CYClt-Hacli，將該質(zhì)粒命名為 pUST-09 (PUST-09 型 Gal 10p-Rluc-Haclp-Fluc-CYCIt-HacIi UPR檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 14所示)。通過在Fluc下游引入CYCl終止序列，阻礙質(zhì)粒中Hacli的轉(zhuǎn)錄,使質(zhì)粒中的Hacli喪失翻譯調(diào)控功能，以此驗(yàn)證pUST-08質(zhì)粒中Haclintron對(duì)Fluc的調(diào)控作用。
[0107]2、按照實(shí)施例1的方法，在pUST-08中的Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl終止序列CYClt，將純化后的pUST-08及PJD375進(jìn)行BamH1、KpnI雙酶切，酶切后進(jìn)行凝膠電泳，將pUST-08酶切所得的約8.0kbp的pUST-08載體及PJD375酶切后所得的約1.9kbp的Fluc-CYClt片段進(jìn)行割膠回收并純化。
[0108]3、將純化后的酶切產(chǎn)物pUST-08載體及Fluc-CYClt經(jīng)T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α后，經(jīng)含氨芐青霉素篩LB平板篩選，后經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證獲得正確質(zhì)粒，所獲質(zhì)粒即為pUST-09。
[0109]4、按照實(shí)施例4的方法，將質(zhì)粒pUST-09轉(zhuǎn)入野生型釀酒酵母中，經(jīng)SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0110]5、按照實(shí)施例4的方法，利用pUST-09質(zhì)粒檢測(cè)衣霉素、DTT處理后野生型酵母的UPR水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶pUST-09的野生型酵母在不同濃度不同藥物處理后，F(xiàn)luc/Rluc比值與不進(jìn)行處理的對(duì)照同樣沒有顯著差異(如附圖6所示)，pUST-08中Haclintron的正常轉(zhuǎn)錄是保證pUST-08具有UPR檢測(cè)功能的重要前提。
[0111]6、按照實(shí)施例4的方法，將質(zhì)粒pUST-08轉(zhuǎn)入IREl缺陷型酵母中，經(jīng)SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0112]7、按照實(shí)施例4 的方法，利用pUST-08質(zhì)粒檢測(cè)衣霉素、DTT處理后IREl缺陷型酵母的UPR水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶pUST-08的IREl缺陷型酵母在不同濃度不同藥物處理后，F(xiàn)luc/Rluc比值與不進(jìn)行處理的對(duì)照同樣沒有顯著差異(如附圖7所示)，pUST-08中Haclintron剪接機(jī)制與內(nèi)源Haclintron —樣，是依賴于IREl的剪接調(diào)節(jié)機(jī)制。
[0113]8、基于本實(shí)例中第5條和第7條的結(jié)果，證實(shí)了 pUST-08質(zhì)粒中的Haclintron剪接調(diào)節(jié)機(jī)制與內(nèi)源Haclintron調(diào)節(jié)機(jī)制是一致的。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒，其特征在于:所述質(zhì)粒為pUST-08質(zhì)粒；具體為GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的構(gòu)建，包括: (1)設(shè)計(jì)用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴(kuò)增的上下游引物； (2)利用PCR技術(shù)，以含Gal1p序列的質(zhì)粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的質(zhì)粒PJD375和含HACi序列的酵母基因組作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列； (3)利用基因克隆技術(shù)，依次將GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到質(zhì)粒YCplac33中，組成GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR雙熒光素酶報(bào)告元件，即為pUST_08質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于:所述步驟(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴(kuò)增的上下游引物為:
GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
Rluc - Haclp - F :GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
Rluc - Haclp _ R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
4.一種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，包括: (1)將pUST-08轉(zhuǎn)入釀酒酵母BY4741a中，于SC-URA培養(yǎng)基中篩選； (2)將上述攜帶有pUST-08的酵母BY4741a進(jìn)行復(fù)蘇，次日進(jìn)行活化，離心，洗滌，配制酵母菌懸液； (3)取上述酵母菌懸液，并分成兩等份，分別轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中，靜置誘導(dǎo)，然后向一份中加入D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液,另一份加入腔腸素溶液,避光晃動(dòng)20-30s,然后在Imin內(nèi)檢測(cè)熒光素酶熒光值。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(2)中活化為0.60D_的初始菌濃活化4hr。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(2)中洗滌為用無菌水懸洗。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(2)配制酵母菌懸液為:用2%葡萄糖為碳源的SC-URA、2%半乳糖作為碳源的SC-URA或2%半乳糖作為碳源并添加藥物的SC-URA懸起來，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于:所述藥物為衣霉素Tm和/或二硫蘇糖醇DTT。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(3)中靜置誘導(dǎo)為30°C靜置誘導(dǎo)3hr。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)活體酵母細(xì)胞UPR水平的雙熒光素酶監(jiān)測(cè)質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(3)中D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液的濃度為ImM，腔腸素溶液的濃度為20 μ M ；D-熒光 素鉀檸檬酸鈉溶液或腔腸素溶液于酵母菌懸液的體積比為1:1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104164443SQ201410333939
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】黃志偉, 房志家, 匡鑫, 杜秀秀, 劉偉偉, 肖君華 申請(qǐng)人:東華大學(xué)