專利名稱：青枯菌2號小種的特異性pcr檢測方法
技術領域：
本發(fā)明“青枯菌2號小種的特異性PCR檢測方法”，專用于檢測弓I起香蕉青枯病的青枯菌2號小種，屬于植物檢疫技術領域，與分子檢測技術有關。
背景技術：
植物細菌性青枯病是由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種世界性重大病害。青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染50多個科的450余種植物。特別是造成香蕉產業(yè)毀滅性損失的青枯菌2號小種，在2007年被列為《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》的第316號檢疫對象。由青枯菌2號小種引起的香蕉青枯病是一種嚴重危害香蕉生產的細菌性病害。該病于19世紀90年代在特立尼達島上的大蕉品種“Moko”上爆發(fā)，給其帶來了毀滅性的損失，幾乎使島上感病大蕉品種“Moko”瀕臨滅絕，該病由此得名為“Moko disease”。直至 1911年Rorer才確定了引起香蕉青枯病的病原菌為Bacillus musae。1960年Budenhagen 和kqueira等將香蕉青枯病菌劃歸假單胞菌屬(I^seudomonas)的2號生理小種。1995年 Yabuuchi正式將青枯菌更名為Ralstonia solanacearum。在分類學地位上，香蕉青枯病菌被定義為青枯菌2號生理小種和生化變種I (race 2/biovar I)，歸屬于青枯菌演化型II型的序列變種3、4和6。自然條件下，香蕉青枯病菌的寄主范圍僅限于芭蕉科芭蕉屬的香蕉、大蕉和海里康屬的海里康。該病是典型的維管束病害，侵染后造成植株萎蔫，受侵染的果實內部呈褐色干腐狀。在中、南美地區(qū)，該病是其香蕉產業(yè)發(fā)展的重要限制因子。根據(jù)Wielps的報道香蕉細菌性枯萎病造成圭亞那香蕉產量上的損失高達74%。上世紀60年代，該病的再次大爆發(fā)幾乎徹底摧毀了特立尼達的香蕉出口產業(yè)。半數(shù)以上位于秘魯亞馬遜盆地的香蕉種植園受到香蕉細菌性枯萎病的影響；在墨西和哥倫比亞，香蕉細菌性枯萎病所造成香蕉的產量損失問題迄今為止一直未能得到有效解決。目前用于檢測青枯菌的檢測技術主要包括分子檢測(單一 PCR檢測、復合PCR檢測及實時熒光定量PCR檢測)，血清學鑒定(熒光原位雜交、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附劑檢測、雙抗夾心間接酶聯(lián)免疫吸收劑檢測)及生物測定等。其中分子檢測體系有EPPO推薦的^^1(1993)和I^astrik(2000)分別基于病原菌的16sRNA編碼基因建立的檢測體系，可以分別從青枯菌中擴增出288bp和55;3bp的片段。但這兩對引物都僅能在種的水平上特異性鑒定出青枯菌。此外，實時熒光定量PCR技術也被應用于青枯菌種水平的快速分子檢測。 Prior等000 采用細菌基因組DNA抑制性差減雜交技術，獲得了青枯菌2號小種不同于其它小種的差異性片段。并從中篩選出4個片段作為檢測靶標，根據(jù)其設計了 4對特異性引物，建立了香蕉序列變種特異性復合PCR(Moko-specific multiplex PCR, Mmx)檢測體系，用于快速檢測香蕉菌株序列變種3、4和6。但迄今為止，國內外尚未見采用單一擴增片段于種以下水平鑒定青枯菌2號小種的報道。
發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的是設計獲得能夠特異性鑒定青枯菌2號小種的單一分子檢測靶標，達到快速、準確、低成本檢測香蕉青枯病菌的目的。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的通過對GenBank中登錄的青枯菌1號小種GMI1000、2號小種M0LK2以及3號小種IP01609的全基因序列進行比對，根據(jù)2號小種特異性序列設計檢測引物，后經PCR篩選后獲得了 1對青枯菌2號小種特異性檢測引物3577F/R。經過PCR反應后，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)產物大小可直接鑒定出是否為青枯菌2號小種。技術方案用于檢測青枯菌2號小種的PCR方法，包括1)用于檢測青枯菌2號小種的樣品制備使用天根公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品的DNA。2)用于檢測青枯菌2號小種的特異性引物引物對序列為3577F 5' -CGCCAGCGCGGTTTCACCTA-3，3577R 5，-CCCCATGCACTATTCCTGGTTCCC-3，3577F/R引物對可從青枯菌2號小種菌株中特異性擴增出片段大小為481bp的單
一產物。3) PCR擴增的反應體系在25 μ 1 反應液中，包含 0. 4 μ M 3577F, 0. 4 μ M 3577R, 12. 5 μ 1 2 X TaqMix (包含 0. IU Taq Polymerase/μ 1,400 μ M dNTP,20mM Tris-HCl,IOOmM KCl,3mM MgCl2)，1 μ 1 DNA 做模板。4) PCR擴增程序94°C預變性5min，94°C變性20s，60°C退火20s，72°C延伸30s，25個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。4) PCR產物的鑒定取2 μ 1 PCR產物用1. 5 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離30分鐘，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴增產物的大小判定結果。有益效果本發(fā)明通過序列比對技術，并根據(jù)篩選獲得的差異序列設計了 1對引物，僅通過單一 PCR反應，即可簡單、快速、可靠地鑒定出青枯菌2號小種。與國內外同類方法相比，本發(fā)明具有以下的技術優(yōu)勢1)操作簡便快捷。整個過程簡單、快速、高效。2)特異性強，應用范圍廣。3)成本低。本方法所用DNA提取技術和PCR過程均為常規(guī)試劑，價格低廉。因此本方法實用性強，可滿足植物檢疫的需要。


圖1 引物對3577F/R對參試菌株的PCR擴增鑒定結果M 分子量標準Markl ；1_19，香蕉青枯病菌株；20-36，來自其他14種不同寄主的青枯菌株。
具體實施例方式19株香蕉青枯病菌株及來自其他14種不同寄主的17株青枯菌株的檢測鑒定。1)參試菌株DNA的提取參試的19 株香蕉青枯病菌株(RUN74, RUN264, RUN450, RUN457, RUN462, RUN92, RUN465, RUNl7, RUN291, RUN286, RUN276, RUN292, RUN9, RUN96, RUN394, RUN419, RUN428, RUN454, RUN301)皆由港口截獲，其他來自14種不同寄主的17株青枯菌株(GMI1000，P01， P041, P045, P9, Tml, Cl, Tb23, Zl, M13, El, 01，B2, Bdll, Pel, Snl, Sspl)皆為本實驗室保存的菌株。將各參試菌株在NA培養(yǎng)基(葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉汁3g，酵母0.5g，瓊脂 18g，蒸餾水1000ml)上，28°C，培養(yǎng)3天。使用天根公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品的DNA。2)特異性引物的合成3577F 5' -CGCCAGCGCGGTTTCACCTA-3，3577R 5' -CCCCATGCACTATTCCTGGTTCCC-3，759F 5' -GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3，760R 5' -GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3，由上海生工公司合成。3) PCR擴增反應在25μ 1 反應液中，包含 0. 4μΜ 3577F,0. 4μΜ 3577R,0. 4μΜ 759F,0. 4μΜ 760R，12. 5 μ 12 X iTaciMix (包含 0. IU Taq Polymerase/μ 1,400 μ M dNTP,20mM Tris-HCl, IOOmM KCl,3mM MgCl2)，1 μ 1 DNA 做模板。4) PCR擴增程序94°C預變性5min，94°C變性20s，60°C退火20s，72°C延伸30s，25個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。5) PCR產物的鑒定取2 μ 1 PCR產物用1. 5 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離30分鐘，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴增產物的大小判定結果。實施結果利用本發(fā)明設計的引物3577F/R，以19株香蕉青枯病菌株及來自其他14種不同寄主的17株青枯菌株為模板，進行PCR擴增。結果如圖2所示，在第1-19泳道擴增出青枯菌 2號小種特異性條帶481bp ；20-36泳道未擴增出這條特異性片段。兩圖中^Obp的條帶為青枯菌種特異性擴增引物759F/760R擴增出的青枯菌特異性條帶，以在種水平上證明參試菌株皆為青枯菌。
權利要求
1.用于檢測青枯菌2號小種的特異性引物3577F/R，其引物序列為 3577F :5’ -CGCCAGCGCGGTTTCACCTA-3’3577R :5’ -CCCCATGCACTATTCCTGGTTCCC-3，3577F/R引物對在青枯菌2號小種中特異性擴增出481bp的產物。
2.使用青枯菌2號小種特異性分子檢測靶標對病原菌進行快速分子檢測的方法，其步驟包括1)抽提被測菌的DNA，制備DNA樣品；2)用權利要求1中的所示的引物對步驟1)中的DNA樣品進行PCR擴增，得到權利要求 1中的特異性大小的DNA片段。3)根據(jù)步驟2)得到的DNA片段，確定被測菌是否為青枯菌2號小種。
3.根據(jù)權利要求2所述的青枯菌2號小種的特異性PCR檢測方法，其中的PCR步驟包括1)擴增反應體系在25μ1反應液中，包含50ng模板DNA，0. 4μΜ 3577F,0. 4μΜ 3577R,12.5 μ 1 2XTaqMix(包含 0· IU Taq Polymerase/μ 1,400 μ M dNTP，20mM Tris-HCl,IOOmM KCl,3mM MgCl2)。2)PCR擴增程序為94°C預變性5min，94°C變性20s，60°C退火20s，72°C延伸30s，25個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。3)電泳檢測反應完成后，取2μ 1 PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈下照相，根據(jù)擴增產物大小判定結果。
4.青枯菌2號小種特異性分子檢測靶標在檢測青枯菌2號小種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明專用于檢測青枯菌2號小種，屬于植物檢疫技術領域。該方法根據(jù)基因序列比對獲得的青枯菌2號小種與其它小種間的差異序列，自主設計了1對特異性引物，可特異性地從青枯菌2號小種菌株中擴增出片段長度為481bp的單一目的條帶。本發(fā)明采用1對特異性引物，進行一次PCR擴增反應，利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，即可直接根據(jù)產物片斷的長度檢測出青枯菌2號小種。
文檔編號C12Q1/68GK102465173SQ20101053445
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權日2010年11月8日
發(fā)明者馮潔, 張麗勍, 張昊, 徐進, 潘哲超, 田茜, 許景升 申請人:中國農業(yè)科學院植物保護研究所