專利名稱：利用工程微生物提高草坪草抗旱抗病性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因根際微生物來提高草坪草的抗旱性。轉(zhuǎn)入的iaaM基因編碼色氨酸單加氧酶增加了植物激素吲哚乙酸的積累，促進(jìn)植物根系的生長，從而有效提高了草坪草的抗旱性，同時(shí)也增加了草坪草的抗病性。
本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之點(diǎn)在于(1)采用從土壤中分離得到的一些根際微生物做為外來基因的受體。這些微生物已被證明對(duì)鐮孢菌和青枯菌這樣一些嚴(yán)重侵害植物的致病菌有很強(qiáng)抑制作用。詳細(xì)研究的有一種細(xì)菌(熒光假單孢菌)和一種真菌(彩色豆馬勃)；(2)分別采用細(xì)菌高效表達(dá)的RDR啟動(dòng)子和真菌高效表達(dá)的GDP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)iaaM基因轉(zhuǎn)化細(xì)菌和真菌，大大提高了iaaM基因的表達(dá)，(3)通過轉(zhuǎn)入iaaM基因產(chǎn)生吲哚乙酸，有促進(jìn)植物根系生長的作用。
根際微生物與植物根系的互惠共生對(duì)于植物的抗旱與耐病性具有雙重作用。加入轉(zhuǎn)iaaM基因的熒光假單孢菌和彩色豆馬勃的草坪草比對(duì)照具有明顯的抗旱作用。對(duì)轉(zhuǎn)iaaM基因的熒光假單孢菌和彩色豆馬勃進(jìn)行了拮抗性試驗(yàn)，顯示對(duì)鐮孢菌和青枯菌有很強(qiáng)的抑制作用。
本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之一是分離草坪草根際有益微生物，選擇那些對(duì)病原菌有拮抗作用的菌株如熒光假單孢菌和彩色豆馬勃。上述菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下接種于幾種草坪植物根部未見對(duì)植物有毒害作用。以青枯菌和鐮刀菌為致病菌通過平板試驗(yàn)研究上述分離菌株對(duì)青枯菌和鐮刀菌有不同程度抑制作用。
本項(xiàng)發(fā)明的要點(diǎn)之二是iaaM基因的克隆。根癌農(nóng)桿菌所攜Ti質(zhì)粒上T-DNA區(qū)段的基因4編碼色氨酸單加氧酶。該酶是吲哚乙酸生物合成中的關(guān)鍵酶。利用PCR從Ti質(zhì)粒上擴(kuò)增出2.3kb左右片段，PCR引物5’引物為5’-AGGATCCATGGACCTGCATCTAATTTT-3’，3’引物為5’-TAGAGCCTAATACATTCCGAACGGATG-3’。
本項(xiàng)發(fā)明的要點(diǎn)之三是細(xì)菌高效RDR啟動(dòng)子的克隆。利用PCR從E.coli中擴(kuò)增出370bp大小片段，PCR引物5’引物為5’-TTTGGGCCCGTAGTCAGCGTGCAATTTCAC-3’3’引物為5’-TTTCCATGGTGCCTCTCACCTTTGATTAATT-3’。
本項(xiàng)發(fā)明的要點(diǎn)之四是真菌高效GDP啟動(dòng)子的克隆。利用PCR從香菇中擴(kuò)增出1.4kb大小片段，PCR引物5’引物為5’-GTAAGCTTGTACTTGGTGGCATATCACAG-3’3’引物為5’-AACTGCAGGGAGGGTATTTAGAATCGAAGG-3’。
本項(xiàng)發(fā)明的要點(diǎn)之五是外源基因?qū)氲姆椒?。采用電擊法，技術(shù)參數(shù)為2.5kV，300Ω，25μF，電擊兩次。
其余技術(shù)要領(lǐng)包括微生物的劑量、混合比例等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，iaaM基因置于細(xì)菌高效RDR啟動(dòng)子的調(diào)控之下，再轉(zhuǎn)入穿梭載體中。(見

圖1大腸桿菌和假單孢菌穿梭質(zhì)粒pRiaaM構(gòu)建流程)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，iaaM基因置于真菌高效GDP啟動(dòng)子的調(diào)控之下，再轉(zhuǎn)入穿梭載體中。(見圖2大腸桿菌和豆馬勃穿梭質(zhì)粒pGiaaM構(gòu)建流程)。
此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關(guān)村，該微生物分類名稱為熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)，保藏代號(hào)為pRiaaM，保藏編號(hào)為CGMCCNO.0654，保藏日期為2001年11月28日。
權(quán)利要求
1.利用轉(zhuǎn)基因微生物提高植物抗旱性的方法。其中用于轉(zhuǎn)化的微生物除熒光假單孢菌和彩色豆馬勃外，還應(yīng)包括其它細(xì)菌、真菌和放線菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。植物抗旱性的提高除草坪草外，還包括用于環(huán)境美化的各種植物，含其它單子葉植物及雙子葉植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。其中提到的轉(zhuǎn)基因除了RDR啟動(dòng)子和GDP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的iaaM基因，還包括其它啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的有助于植物與微生物共生的、對(duì)植物生長有作用的其它基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。其中外源基因?qū)氲姆椒ǔ穗姄舴ǎ€包括其它外源基因的導(dǎo)入方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。所提到的轉(zhuǎn)基因微生物除提高共生植物的抗旱性，還包括提高與此相關(guān)的植物的抗寒性及抗病、抗鹽堿、耐熱性等其它抗逆性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。該方法還包括轉(zhuǎn)基因微生物或其它修飾的微生物與其它非轉(zhuǎn)基因微生物混用有助于建立根系與微生物的穩(wěn)定關(guān)系，從而提高植物的抗逆性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用工程微生物提高草坪草抗旱抗病性的方法。將細(xì)菌RDR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的iaaM(色氨酸單加氧酶)基因和真菌GPD啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的iaaM基因分別轉(zhuǎn)化熒光假單孢菌和彩色豆馬勃等根際微生物,iaaM基因表達(dá)的產(chǎn)物促進(jìn)草坪草根部的生長,使植物根系更深更發(fā)達(dá),增強(qiáng)植物的吸水能力,也使根系－土壤－微生物形成一種保護(hù)性的結(jié)構(gòu),在嚴(yán)重干旱的條件下,保護(hù)根系不受損傷,從而有效提高了草坪草的抗旱性。這些根際微生物同時(shí)有抑制植物病原菌的作用。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1366060SQ01140438
公開日2002年8月28日 申請日期2001年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月7日
發(fā)明者林忠平, 毛自朝, 倪挺, 胡鳶雷, 高音 申請人:林忠平