專利名稱：雙并四氫呋喃類木脂體4位特異性葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及編碼該酶的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自連翹(> > ￥ 3々)的雙并四氫呋喃型木脂體4位特異性葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(7 α 7，>型彡V f > 4位々^ 二一 7転移酵素)、編碼該酶的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體以及使用該載體得到的轉(zhuǎn)化體等。
背景技術(shù)：
木脂體作為植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的一種在植物界中廣泛分布(非專利文獻(xiàn)1 Umezawa, T. (2003) Phytochem. Rev. 2，371-390)，其中具有有用的生物活性的木脂體已被用作藥品或健康食品。例如，已知在胡麻科(pedaliaceae)芝麻(sesamum indicum)中含有的主要的雙并四氫呋喃型木脂體具有抗氧化性、改善脂質(zhì)代謝、保護(hù)肝功能等功效，并且已在市售(非專利文獻(xiàn) 2 :Nakai，M. et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51，1666-1670 ；非專利文獻(xiàn) 3 =Tsuruoka, T. et al. (2005) Biosci. Biotech. Biochem. 69，179—188 ；非專利文獻(xiàn) 4 Sirato-Yasumoto，S. et al. (2001) J. Agri. Food Chem. 49，2647—2651)。另一方面，在小檗科盾葉鬼臼(美洲八角蓮)的根中含有的作為芳基四氫萘內(nèi)酯型(7 U > y卜，u >，々 卜 >型)的抗腫瘤性木脂體的鬼白毒素，因?yàn)槠渚哂屑?xì)胞分裂抑制活性，所以已被用作治癌劑及用于新型治癌劑的開發(fā)(非專利文獻(xiàn)5 :AyreS，D.C.和Loike，J.D. (1990) Lignans Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K.)。此外，認(rèn)為大多數(shù)木脂體在攝取后，在體內(nèi)代謝為具有類似雌性荷爾蒙活性的腸內(nèi)酯，因此木脂體成為近年來(lái)引起關(guān)注的次級(jí)代謝產(chǎn)物(非專利文獻(xiàn)6:Heinonen，S. et al. (2001) J. Agric. Food Chem. 49，3178-3186)。木犀科(oleaceae)連翹(連翹屬(forsythia))是多年生木本植物，因其頑強(qiáng)而易于栽培，因開鮮艷的黃花故多被用作庭院灌木。另一方面，已知在連翹的葉子、種子以及花瓣中蓄積了豐富的具有抗氧化或抗炎癥活性的木脂體類，在亞洲(特別是中國(guó)和日本)將其葉子作為茶飲用。(非專利文獻(xiàn)7 :Guo，H. et al. (2007) Rapid Communications in Mass Spectrometry 21，715—729 ；非專利文獻(xiàn) 8 :Chang，M-J. et al. (2008) Biosci. Biotech. Biochem. 72，2750_2755)。與芝麻或亞麻等一年生草本植物不同，連翹不需要每年播種及育苗，可數(shù)年連續(xù)從葉子中獲取功能性木脂體，因此認(rèn)為連翹是有用的次級(jí)代謝產(chǎn)物的分子育種目標(biāo)。在木犀科連翹中木脂體的生物合成，通過(guò)由結(jié)構(gòu)式(I’)(參照?qǐng)DIA ；以下其它結(jié)構(gòu)式也相同)的單木質(zhì)醇進(jìn)行氧化聚合生成結(jié)構(gòu)式(Ia)的雙并四氫呋喃型木脂體而開始(非專利文獻(xiàn) 9 =Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2，257-288 ；非專利文獻(xiàn) 10:Suzuki，S. and Umezawa, Τ. (2007) J. Wood. Sci. 53, 273-284) 結(jié)構(gòu)式(Ia)的木脂體，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)式(IV)及結(jié)構(gòu)式(V)的木脂體(非專利文獻(xiàn)11 =Dinkova-Kostova, A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271,29473-29482 ；非專利文獻(xiàn) 12 =Nakatsubo, T. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283，15550-1557 ；非專利文獻(xiàn) 13 :Min，Τ. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278，50714-50723 ；非專利文獻(xiàn) 14 :Gang, D. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274，7516-7527)，轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)式(VI)的木脂體(非專利文獻(xiàn)15 :Xia，Z-Q. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 12614-12623 ；非專利文獻(xiàn) 16 =Youn, B. et al (2005) J. Biol. Chem. 280，12917-12926)。其后在轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)式(VII)的木脂體糖苷之前，需要進(jìn)一步經(jīng)過(guò)多個(gè)酶反應(yīng)。這些在連翹中的一系列木脂體生物合成體系中，僅確認(rèn)出幾種酶活性，目前仍未分離出負(fù)責(zé)各反應(yīng)的催化酶、或編碼這些酶的基因。雖然在連翹中含有的所有木脂體均以糖苷的形式穩(wěn)定存在， 但僅檢測(cè)出向結(jié)構(gòu)式(VII)的木脂體的7位轉(zhuǎn)移糖的活性(非專利文獻(xiàn)17 =Berim, A. et al. (2008)Phytochemistry 69，374-381)，還未鑒定出其它的木脂體糖基轉(zhuǎn)移酶。另一方面，在芝麻中雖然大部分木脂體也以糖苷的形式存在，但僅鑒定出對(duì)于結(jié)構(gòu)式(III)表示的木脂體的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT71A9。該酶對(duì)結(jié)構(gòu)式(III)的化合物的2位以外的位置或?qū)ζ渌局w化合物無(wú)活性。對(duì)于除此之外的木脂體的糖基轉(zhuǎn)移酶仍然不明確(非專利文獻(xiàn) 18 :0no, Ε. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103，10116-10121 ；非專利文獻(xiàn) 19 Noguchi，Α.，et al. (2008)Plant J. 54，415-427)。通常情況下，植物中的糖基轉(zhuǎn)移酶的位置選擇性高，在相同或類似化合物的相同位置進(jìn)行反應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶之間的氨基酸序列在不同的種間保守，因此，可利用序列的同源性分離該酶。但是，即使為相同的或類似的化合物，在不同位置添加糖的糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的同源性低，極難于以在其它位置反應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶的序列信息為基礎(chǔ)分離該酶。因此，即使是相同的木脂體化合物，也極難于以在上述結(jié)構(gòu)式(III)化合物的2位添加糖的來(lái)自芝麻的UGT71A9的信息為基礎(chǔ)，類推在其它木脂體化合物、例如結(jié)構(gòu)式(Ia)等的雙并四氫呋喃型木脂體的4位及/或4'位上添加糖的糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)并將其分離?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 =Umezawa, T. (2003) Phytochem. Rev. 2，371-390 ；非專利文獻(xiàn)2 =Nakai, M. et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51，1666-1670 ；非專禾Ij 文獻(xiàn) 3 :Tsuruoka，T. et al. (2005)Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188 ；非專禾Ij 文獻(xiàn) 4 :Sirato-Yasumoto，S. et al. (2001) J. Agri. Food Chem. 49, 2647-2651 ；非專利文獻(xiàn)5 :Ayres,D. C. and Loike, J. D. (1990) Lignans =Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U. K.；非專利文獻(xiàn)6 =Heinonen, S. et al. (2001) J. Agric. Food Chem. 49，3178-3186 ；非專禾Ij 文獻(xiàn) 7:Guo，H. et al. (2007)Rapid Communications in Mass Spectrometry 21,715-729 ；非專禾Ij 文獻(xiàn) 8 :Chang，M-J. et al. (2008)Biosci. Biotech. Biochem. 72, 2750-2755 ；非專利文獻(xiàn) 9 =Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2，257-288 ；非專利文獻(xiàn)10 =Suzuki, S. and Umezawa, Τ. (2007) J. Wood. Sci. 53，273-284 ；非專禾Ij文獻(xiàn) 11 :Dinkova-Kostova，A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 29473-29482 ；
非專利文獻(xiàn)12 =Nakatsubo, T. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283，15550-1557 ；非專利文獻(xiàn)13 :Min, Τ. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278，50714-50723 ；非專利文獻(xiàn)14 :Gang，D. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274，7516-7527 ；非專利文獻(xiàn)15 :Xia, Z-Q. et al (2001) J. Biol. Chem. 276，12614-12623 ；非專利文獻(xiàn)16 =Youn, B. et al (2005) J. Biol. Chem. 280，12917-12926 ；非專利文獻(xiàn)17 =Berim, A. et al. (2008) Phytochemistry 69，374-381 ；非專禾Ij文獻(xiàn) 18:0no，E.et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103， 10116-10121 ；非專利文獻(xiàn)19 =Noguchi, Α.，et al. (2008) Plant J. 54，415-427 ；

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在這種狀況下，期望分離并鑒定出在雙并四氫呋喃型木脂體的4位及/或4'位上添加糖的糖基轉(zhuǎn)移酶。解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)手段本發(fā)明是考慮到上述狀況而做出的發(fā)明，提供以下所示的多核苷酸(編碼雙并四氫呋喃型木脂體4位特異性葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸)、蛋白質(zhì)(雙并四氫呋喃型木脂體 4位特異性葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)、含有該多核苷酸的載體以及導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化體等。(1) 一種多核苷酸，其特征在于，為以下(a) (f)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(a) 一種多核苷酸，其含有由序列號(hào)3或5表示的堿基序列組成的多核苷酸；(b) —種多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c) 一種多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列中1 15個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d) 一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(e) 一種多核苷酸，其含有與序列號(hào)3或5表示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；或者(f) —種多核苷酸，其含有與編碼序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(2)根據(jù)上述⑴所述的多核苷酸，其特征在于，為以下(g)至(j)中任一項(xiàng)(g) 一種多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列中10個(gè)以下的氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(h) 一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列有90%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(i) 一種多核苷酸，其含有與序列號(hào)3或5表示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；或者(j) 一種多核苷酸，其含有與編碼序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。在上述(1)及O)的多核苷酸中，對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移活性，包括例如對(duì)雙并四氫呋喃型木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，更加具體地說(shuō)，對(duì)雙并四氫呋喃型木脂體的4 位及/或4'位的羥基的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在此，所述雙并四氫呋喃型木脂體包括，例如下述結(jié)構(gòu)式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂體。
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，其特征在于，為以下(a) (f)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(a)一種多核苷酸，其含有由序列號(hào)3或5表示的堿基序列組成的多核苷酸；(b)一種多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c)一種多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列中1 15個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d)一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(e)一種多核苷酸，其含有與序列號(hào)3或5表示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；或者(f)一種多核苷酸，其含有與編碼序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，為以下(g) (j)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(g)一種多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列中10個(gè)以下的氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(h)一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列有90%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(i)一種多核苷酸，其含有與序列號(hào)3或5表示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；或者(j) 一種多核苷酸，其含有與編碼序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述針對(duì)木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性為針對(duì)雙并四氫呋喃型木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述針對(duì)雙并四氫呋喃型木脂體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性為針對(duì)雙并四氫呋喃型木脂體的4位及/或4'位的羥基的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，其特征在于，所述雙并四氫呋喃型木脂體為下述結(jié)構(gòu)式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂體
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有由序列號(hào)3或5表示的堿基序列組成的多核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有編碼由序列號(hào)4或 6表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為DNA。
9.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)由權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
10.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
11.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
12.—種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求10所述的載體。
13.—種制造權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求11或12所述的轉(zhuǎn)化體。
14.一種制造葡萄糖糖苷的方法，其特征在于，所述方法包括以權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)為催化劑，由UDP-葡萄糖和糖基受體底物生成葡萄糖苷。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述糖基受體底物為雙并四氫呋喃型木脂體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述雙并四氫呋喃型木脂體為下述結(jié)構(gòu)式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂體
全文摘要
本發(fā)明提供編碼雙并四氫呋喃型木脂體4位特異性葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸等。所述多核苷酸含有包含序列號(hào)3或5表示的堿基序列的多核苷酸或編碼包含序列號(hào)4或6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102428181SQ20108002199
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者佐竹炎, 小野榮一郎, 金賢仲 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社