專利名稱：用于癌癥治療的卡那霉素反義核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有與卡那霉素抗性蛋白的編碼序列的片段互補(bǔ)的序列的核酸。該核酸可用作DNA疫苗的佐劑，例如可以用于治療癌癥，比如與諸如全反式維甲酸(ATRA)的腫瘤細(xì)胞凋亡的非免疫抑制性誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用。
背景技術(shù)：
在美國(guó)，癌癥是導(dǎo)致死亡的第二原因，僅次于心血管疾病。約10%的這些癌癥死亡是由于血癌，例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。僅在歐洲和美國(guó)，據(jù)估計(jì)有190萬人患有血癌。其中一些血癌是罕見疾病，例如急性髓系白血病(AML)。急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL， M3型AML)的特點(diǎn)是t(15;17)的相互易位，將早幼粒細(xì)胞白血病基因(PML)與維甲酸受體 α基因(RARa)融合，并在早幼粒階段被髓樣分化所捕獲。全反式維甲酸(ATRA)介導(dǎo)的分化治療是目前APL患者標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)。然而，盡管目前與ATRA相結(jié)合的化療的嘗試能夠延長(zhǎng)存活，但約10%的患者由于缺少對(duì)當(dāng)前維持治療的順應(yīng)性而復(fù)發(fā)。因此，需要新的治療策略來根除剩余的疾病以及改善生命的質(zhì)量。迄今為止，已經(jīng)確定了許多與腫瘤相關(guān)的抗原，并已開發(fā)出疫苗的接種策略以誘發(fā)對(duì)這些腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。天然的和重組的癌癥蛋白抗原包括標(biāo)準(zhǔn)化級(jí)別所定義的免疫原性的抗原，其療效取決于找到合適的佐劑和傳遞系統(tǒng)。DNA傳遞是新型的疫苗和免疫治療方法，例如直接將基因表達(dá)盒注射到活的宿主中。所傳遞的基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致宿主的免疫防御系統(tǒng)對(duì)抗所表達(dá)的抗原而產(chǎn)生特定的免疫激活。疫苗策略的有效性依賴于免疫應(yīng)答的獲得，可以是體液的和細(xì)胞毒性的。DNA疫苗已經(jīng)被證明能夠滿足這些需求，其導(dǎo)致對(duì)質(zhì)粒編碼的抗原產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)大而持久的細(xì)胞介導(dǎo)的(生成CD8+細(xì)胞毒性和CD4+輔助T細(xì)胞)和體液的免疫應(yīng)答。該類型的癌癥疫苗接種首次用在B-非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)上，使用表面免疫球蛋白的獨(dú)特型(idiotype) 作為抗原，從而誘發(fā)抗腫瘤應(yīng)答(Stevenson et al.，1995，Immunological Reviews 145 211-28 ；Syrengelas et al. ,1996, Nature Medicine 2 :1038_41，Rice et al. ,2008, Nature Reviews 8 108-20)。在其他的淋巴瘤和骨髓瘤的小鼠模型中也觀察到該保護(hù)性免疫。然而，在一些癌癥患者中細(xì)胞免疫系統(tǒng)的全身性惡化被報(bào)道了。因此，這些患者， 特別是APL患者的較差的免疫狀態(tài)，被視為是單靠接種策略進(jìn)行免疫治療的方法的主要障礙。Padua 等(2003，Nature Medicine 9 1413-1417)使用 APL 動(dòng)物模型(Brown 等· 1997,Proc Natl Acad Sci U S A. 94 :2551_6)測(cè)試了含有核酸的DNA疫苗效果的體內(nèi)效力，其中，PML-RARα腫瘤抗原與破傷風(fēng)毒素片段C(FrC)序列連接。他們的結(jié)果證實(shí)ATRA 作為輔料與PML-RAR α -FrC DNA接種一起延長(zhǎng)APL小鼠的存活。這伴隨著⑶4+和⑶8+Τ 細(xì)胞、RARa抗體以及Y干擾素(IFNy)產(chǎn)物的增加，證明了相關(guān)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。WO 03/090778進(jìn)一步教導(dǎo)了含有(i)腫瘤細(xì)胞凋亡的非免疫抑制性誘導(dǎo)劑，例如全反式維甲酸，和(ii)含有免疫原性多肽，例如PML-RARa FrC、PML-RARa AS-FrC或 ScFvBCLl-FrC的編碼序列的核酸的疫苗組合物從舊病復(fù)發(fā)和死亡中挽救APL小鼠。因此，DNA接種與ATRA給藥的聯(lián)合療法有望治療白血病(Padua和Chomienne， 2004，Discovery Medicine 4 :41_44)。在本領(lǐng)域有開發(fā)有助于增加癌癥患者 免疫應(yīng)答的 DNA輔料的需求。

發(fā)明內(nèi)容
已出人意料地發(fā)現(xiàn)，與卡那霉素抗性蛋白的編碼序列的片段互補(bǔ)的KanAS序列 SEQ ID NO 1是一種高效的DNA接種輔料。更具體地，發(fā)明人已經(jīng)證明單獨(dú)含有KanAS序列SEQ ID NO 1或與PML-RAR α月中瘤抗原融合的質(zhì)粒在與ATRA聯(lián)合給藥時(shí)可以延長(zhǎng)APL小鼠的壽命。此外，單獨(dú)的KanAS會(huì)延長(zhǎng)MDS小鼠的壽命。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)使用KanAS單獨(dú)治療的MDS小鼠相比于確認(rèn)的野生型FVB/N小鼠，其記憶性T細(xì)胞增加了 3倍。此外，使用KanAS治療后， 白血病干細(xì)胞(leukaemic stem cell)的祖群(progenitor population)減少了(未經(jīng)治療的小鼠約為25%，而經(jīng)治療的小鼠約為10%)。最后，觀察到Toll樣受體(TLRs)通路下游的MyD88轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的瞬時(shí)上調(diào)，對(duì)于該受體來說，DNA是配體之一。在KanAS上游或下游發(fā)揮免疫應(yīng)答的任何抗原都是可以被克隆的。因此，含有 KanAS的核酸的DNA接種適用于所有的癌癥，以及許多其它需要免疫應(yīng)答的疾病，包括傳染性疾病。根據(jù)本發(fā)明的DNA接種策略還可以適用于患有遺傳傾向的癌癥，諸如乳腺癌和結(jié)腸癌的個(gè)體，其癌基因在生殖細(xì)胞系(germ line)中，并且是可遺傳的。此外，與自體疫苗不同，根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗不是特異性針對(duì)給定癌癥病情的疫苗。它們不存在任何對(duì)自身抗原誘導(dǎo)自體免疫的危險(xiǎn)。此外，這些疫苗可以通過標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌發(fā)酵過程操作，很容易擴(kuò)大生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的KanAS核酸本發(fā)明涉及分離和/或純化的核酸，其含有或組成為與卡那霉素抗性蛋白的編碼序列的片段互補(bǔ)的序列。根據(jù)本發(fā)明的這種核酸被稱為“KanAS核酸”。所述卡那霉素抗性蛋白的編碼序列的片段可以是任何長(zhǎng)度，例如，至少、至多或約為50、100、150、200、250、 300、350、400、450、473 或 500 個(gè)連續(xù)核苷酸。在本發(fā)明的內(nèi)容中，“核酸”是指核糖核酸(“RNA分子”)或脫氧核糖核酸(“DNA 分子”)，或它們的任何磷酸酯類似物(例如硫代磷酸酯和及硫酯)的磷酸酯聚合形式，既可以是單鏈形式，也可以是雙鏈螺旋形式。術(shù)語“核酸”包括雙鏈DNA弧(DNA round)，尤其是線性(如限制性酶切片段)或環(huán)狀DNA分子。所述核酸優(yōu)選對(duì)應(yīng)于DNA分子。本文使用的“分離和/或純化”是指從人或動(dòng)物體和/或化合物庫(kù)中分離和/或純化得到的化合物。本文使用的術(shù)語“卡那霉素抗性蛋白”是指能夠賦予卡那霉素抗性的酶。這樣的酶催化下面的酶反應(yīng)ATP+卡那霉素=> ADP+卡那霉素3 ‘-磷酸酯卡那霉素抗性蛋白編碼序列可以源于任何微生物，例如源自肺炎克雷伯桿菌 (Klebsiella pneumoniae)，環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)，大腸桿菌(Escherichiacoli)，鼠傷寒沙門氏菌(Enterococcus faecalis)，弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)， 糞腸球菌(Salmonella typhimurium)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)，核糖苷鏈霉菌(Streptomyces ribosidificus)，空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。優(yōu)選地，所述卡那霉素抗性蛋白的編碼序列具有SEQ ID NO 9的1226到2020的核苷酸組成的序列。根據(jù)本發(fā)明的KanAS核酸可以進(jìn)一步包括pVaxl核酸載體(vector)片段的互補(bǔ)序列(目錄編號(hào) V260-20，Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。pVaxl 核酸載體的序列如SEQ ID NO 9所示。因此，根據(jù)本發(fā)明的KanAS核酸，例如可能包括，或由SEQ ID NO 9的片段的互補(bǔ)序列組成，其中所述SEQ ID NO :9的片段包括至少、至多或約50、100、150、200、250、300、 350、400、450、473或500個(gè)位于SEQ ID NO 9的1226到2020位置的核苷酸中的連續(xù)核苷酸。例如，所述SEQ ID NO 9的片段可包括50到500、100到500,200到500,300到500或 450到500個(gè)位于SEQ ID NO 9的1226到2020位置的核苷酸中的連續(xù)核苷酸。所述KanAS 核酸還可以是這些序列相應(yīng)的衍生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述KanAS核酸包括或組成為 -與SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%相似性的序列；-SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 中的至少 50、100、150、200、250、300、350、400 或 450個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；或-SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 的衍生物。優(yōu)選地，這些KanAS核酸具有生物活性。本文所使用的KanAS核酸的“生物活性”是指在諸如小鼠、大鼠或人的哺乳動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答的能力。測(cè)量這類生物活性的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可以使用Padua等公開的方法(2003，Nature Medicine 9 1413-1417)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所述KanAS核酸與ATRA聯(lián)合給藥(參見本專利申請(qǐng)的實(shí)施例2和實(shí)施例3)，通過檢測(cè)延長(zhǎng)APL模型小鼠或MDS模型小鼠(此后稱為“APL 小鼠”或“MDS小鼠”)存活的能力來測(cè)量所述KanAS核酸的生物活性。核酸序列與本發(fā)明的相關(guān)序列(query sequence)具有至少，例如95%“相似性”， 是指除非每100個(gè)相關(guān)序列的核苷酸中有高達(dá)5個(gè)核苷酸發(fā)生改變，否則該核酸的序列與所述相關(guān)序列是相同的。換句話說，通過插入、刪除或使用其它核苷酸替代相關(guān)序列中不超過5% (100個(gè)中的5個(gè))核苷酸，可以得到與相關(guān)序列具有至少95%相似性的核酸序列。術(shù)語“衍生物”包括片段、同源基因、突變體和自然產(chǎn)生的變異體，例如等位基因變異體、剪接變異體或通過蛋白水解處理得到的變異體。由與參照序列具有“至少80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%相似性”的氨基酸序列所組成的衍生物可含有相比于參照序列的突變，例如刪除、插入和/或替代。在替代的情況下，由與參照序列具有至少80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列所組成的衍生物，相比于參照序列，其可能與衍生自其它物種的同源序列更相關(guān)。替代可能對(duì)應(yīng)于如下表所示的保守替代。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于DNA接種的分離的核酸，該核酸含有與卡那霉素抗性蛋白的編碼序列的片段互補(bǔ)的反義序列。
2.一種分離的核酸，該核酸含有與卡那霉素抗性蛋白的編碼序列的片段互補(bǔ)的反義序列，其中，所述反義序列由選自由下列序列組成的組中的序列組成a)與SEQID NO :9所示的片段互補(bǔ)的序列，其中，所述片段包括位于SEQ ID NO 9的1226位置到2020位置的核苷酸中的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸；b)SEQID NO 1 或 SEQ ID NO 2 所示的序列；c)與SEQID NO :1或SEQ ID NO 2具有至少80%相似性的序列；d)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；以及e)能夠在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答的(a)或(b)的衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸，其中，核酸進(jìn)一步含有編碼免疫原性多肽的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸，其中，所述免疫原性多肽是腫瘤抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸，其中，所述編碼腫瘤抗原的序列與SEQID N0:5所示的PML-RARα序列具有至少80%相似性。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核酸含有選自由下列序列組成的組中的序列a)SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 所示的序列；b)與SEQID NO :3或SEQ ID NO 4具有至少80%相似性的序列；c)SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；以及d)能夠在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答的(a)的衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的核酸，其用于治療和/或預(yù)防癌癥、良性腫瘤或傳染性疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的核酸，其與腫瘤細(xì)胞凋亡的非免疫抑制性誘導(dǎo)劑同時(shí)或依次聯(lián)合使用，用于治療和/或預(yù)防癌癥。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的核酸，其中，所述癌癥是血癌，所述血癌選自由淋巴白血病、髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合征、急性髓系白血病、髓單核細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、兒童急性淋巴細(xì)胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的核酸，其中，所述癌癥是實(shí)體腫瘤，所述實(shí)體腫瘤選自由癌、腺癌、肉瘤、惡性黑色素瘤、間皮瘤和胚細(xì)胞瘤組成的組。
11.含有權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的核酸的核酸載體。
12.一種藥用組合物，該藥用組合物含有(i)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的核酸或者權(quán)利要求11所述的核酸載體；( )生理上可接受的載體；以及任選地(iii)腫瘤細(xì)胞凋亡的非免疫抑制性誘導(dǎo)劑。
13.一種聯(lián)合物，該聯(lián)合物包括(i)第一藥用組合物，該第一藥用組合物含有在生理上可接受的載體中的權(quán)利要求 1-10中任意一項(xiàng)所述的核酸或者權(quán)利要求11所述的核酸載體；(ii)第二藥用組合物，該第二藥用組合物含有在生理上可接受的載體中的腫瘤細(xì)胞凋亡的非免疫抑制性誘導(dǎo)劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任意一項(xiàng)所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥用組合物或根據(jù)權(quán)利要求13所述的聯(lián)合物，其中，所述腫瘤細(xì)胞凋亡的非免疫抑制性誘導(dǎo)劑是維甲酸化合物或砷相關(guān)化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥用組合物或根據(jù)權(quán)利要求 14所述的聯(lián)合物，其中，所述維甲酸化合物是ATRA。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有與卡那霉素抗性蛋白的編碼序列的片段互補(bǔ)的序列的核酸。該核酸可用作DNA疫苗的佐劑，例如可以用于治療癌癥，比如與腫瘤細(xì)胞凋亡的非免疫抑制性誘導(dǎo)劑，如全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合使用。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102439150SQ201080021388
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者C·肖米耶納, R·A·帕多瓦 申請(qǐng)人:巴黎狄德羅大學(xué), 法國(guó)國(guó)家健康醫(yī)學(xué)研究院