專利名稱：體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法，特別是涉及一種體內(nèi)監(jiān) 測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型及其構(gòu)建方法與其在監(jiān)測(cè)HBV特異性 CTLs的殺傷性和非殺傷性功能中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus, HBV)的感染嚴(yán)重影響著人類的健康，它能夠 引起急、慢性病毒性肝炎。急性感染后，有5-10%的成年人發(fā)展為持續(xù)感染，最終可以導(dǎo)致 慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前，全球約有3. 5億乙型肝炎病毒慢性感染者，盡管現(xiàn)有的疫 苗能夠有效的預(yù)防乙型肝炎病毒，但不能治療已經(jīng)感染的患者。已有的研究表明機(jī)體針對(duì)病毒所產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答可能是清除機(jī)體內(nèi) 病毒的重要因素。目前認(rèn)為機(jī)體內(nèi)病毒特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞清除乙肝病毒主要是通 過兩條途徑實(shí)現(xiàn)即胞毒途徑和非溶胞途徑。胞毒途徑是指機(jī)體針對(duì)HBV編碼產(chǎn)物所產(chǎn)生 的特異性T淋巴細(xì)胞借助其分泌的穿孔素、顆粒酶、α腫瘤壞死因子及其表面表達(dá)的Fas配 體等介質(zhì)摧毀感染病毒的靶細(xì)胞。在這條途徑中特異性T淋巴細(xì)胞在清除病毒的同時(shí)也將 導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解。非溶胞途徑是指機(jī)體針對(duì)HBV編碼產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性T淋巴細(xì)胞通 過分泌特定的細(xì)胞因子抑制HBV的復(fù)制繼而達(dá)到清除病毒的作用。這條途徑中特異性T淋 巴細(xì)胞只是清除了靶細(xì)胞內(nèi)的病毒，而對(duì)靶細(xì)胞本身并無(wú)損傷。在急性HBV感染的機(jī)體內(nèi) 這兩條途徑都存在。實(shí)驗(yàn)研究表明在特異性T細(xì)胞清除病毒的過程中，非溶胞途徑可能扮 演著更重要的作用。病毒特異性CTL清除胞內(nèi)病毒機(jī)制的研究不僅有助于更全面地認(rèn)識(shí)特異性CD8+T 細(xì)胞在抗病毒感染方面的重要作用，也有助于更深刻地理解HBV持續(xù)感染的免疫學(xué)機(jī)制， 并為HBV慢性感染的治療，如治療性疫苗的研究，提供了理論基礎(chǔ)和新的思路。目前，HBV特 異性CTLs體內(nèi)抗病毒功能的測(cè)定是主要通過以下幾種間接方式進(jìn)行的(1)通過血清ALT 水平反映肝細(xì)胞的損傷；⑵通過組織化學(xué)檢測(cè)CTL的侵潤(rùn)；(3)通過血清中病毒蛋白或基 因水平的減少反映CTL的殺傷活性。雖然它們是被廣泛認(rèn)可的測(cè)定抗病毒免疫的參數(shù)，但 存在著低敏感度、有樣本誤差、且僅反映過去的免疫反應(yīng)效應(yīng)等缺點(diǎn)。因此，建立一種體內(nèi) 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs的殺傷性和非殺傷性功能的方法勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可用于體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠 模型的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs 功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型的構(gòu)建方法，可包括以下步驟1)載體構(gòu)建構(gòu)建包括HBV啟動(dòng)子、報(bào)告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體；
2)將步驟1)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性 CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型。在上述小鼠模型的構(gòu)建方法中，所述步驟1)中的HBV啟動(dòng)子為四個(gè)基本啟動(dòng)子 spl、sp2、核心啟動(dòng)子(cp)、xp與HBV兩個(gè)增強(qiáng)子(EnhI和Enh II)的所有可能的組合；所 述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛笀?bào)告基因Flue、GLuc等可活體成像的所有已知報(bào)告基因；所述HBV 全基因組為HBV 1. 2倍、1. 3倍、1. 5倍、2. 0倍基因組。所述步驟1)中的HBV全基因組位于報(bào)告基因的下游。所述步驟1)中用于構(gòu)建重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為真核表達(dá)載體pGL3、pQE、 或pCI-neo等，優(yōu)選為pGL3。以pGL3為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶HBV啟動(dòng)子、Fluc報(bào)告基因和HBV全基因組的重 組表達(dá)載體為pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2，其序列如序列表中序列1所示。上述表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。所述步驟2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠前還包括對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行純化的步
馬聚ο所述步驟2)中的小鼠為雄性BALB/c小鼠(H_2d)或C57BL/6 (H_2b)。所述步驟2)中的小鼠年齡為4-6周。所述步驟2)中的轉(zhuǎn)染方法可采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法，具體方法可為取4-6周齡的雄 性小鼠，稱重，將10 μ g重組表達(dá)載體混合于相當(dāng)于小鼠體重10%的生理鹽水，在五秒鐘內(nèi) 通過尾靜脈使其快速轉(zhuǎn)染至小鼠肝臟。此外，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠體后還包括對(duì)其進(jìn)行鑒定的步驟，具體方法可為 小鼠在轉(zhuǎn)染后第1、4、7、14、28、49、和70d尾靜脈取血，檢測(cè)血清中ALT水平、HBsAg和HBV DNA的表達(dá)情況；活體熒光成像監(jiān)測(cè)報(bào)告基因表達(dá)情況；對(duì)HBsAg檢測(cè)陽(yáng)性的小鼠在不同時(shí) 間點(diǎn)收集肝臟組織檢測(cè)HBcAg表達(dá)情況及肝臟病理變化，以確定小鼠模型是否構(gòu)建成功。具體來(lái)講，所述模型鑒定包括如下指標(biāo)(1)報(bào)告基因的活體熒光成像；
(2) HBV抗原HBsAg的定量檢測(cè)；(3) HBV抗原HBcAg的免疫組化檢測(cè)；(4) HBV DNA含量的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)；(5)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測(cè)定；(6)肝臟病理變化-HE染色觀察。用上述方法構(gòu)建的體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型也 屬于本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明提供一種體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型及其 構(gòu)建方法。首先構(gòu)建了 HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)，報(bào)告基因下游融合HBV 全基因組組成的體內(nèi)表達(dá)報(bào)告基因和HBV抗原的重組質(zhì)粒，再通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)將此重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至正常小鼠肝臟中，經(jīng)檢測(cè)，報(bào)告基因、HBV抗原和HBV DNA的表達(dá)能夠持續(xù)2 個(gè)月以上。本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可重復(fù)的可視化小鼠模型，該模型可用于監(jiān)測(cè) HBV特異性CTLs的殺傷性和非殺傷性功能。利用HBV疫苗或藥物激發(fā)體內(nèi)CTL反應(yīng)后，水 動(dòng)力轉(zhuǎn)染含有熒光素酶報(bào)告基因的HBV表達(dá)載體，由于在該表達(dá)體系中Fluc與HBV共表達(dá)
4于同一細(xì)胞，且Fluc基因由HBV核心啟動(dòng)子與增強(qiáng)子調(diào)控，無(wú)論HBV特異性CTL是通過細(xì) 胞毒作用，還是通過細(xì)胞因子(IFN-γ，TNF-α)介導(dǎo)的非溶細(xì)胞作用清除病毒，都可通過 熒光素酶的活性來(lái)反映，有助于實(shí)時(shí)、快捷的評(píng)價(jià)疫苗免疫后機(jī)體中CD8+T細(xì)胞功能。此外， 本發(fā)明用成年小鼠采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法建立小鼠模型，不需要特殊儀器，具有研究周期短、 花費(fèi)小、目的基因在肝臟特異長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，且具有表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為可在體內(nèi)表達(dá)報(bào)告基因和HBV抗原的重組質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc_HBVl. 2的構(gòu) 建方法流程2A為本發(fā)明建立的/J 檢測(cè)情況圖2B為本發(fā)明建立的/J
率檢測(cè)情況圖2C為本發(fā)明建立的/J 檢測(cè)情況圖2D為本發(fā)明建立的/J 檢測(cè)情況圖3A為本發(fā)明建立的/J
成像示意3B為本發(fā)明建立的/J 水平數(shù)值4A為本發(fā)明建立的/J
肝表面抗原滴度圖4B為本發(fā)明建立的小鼠模型在核心抗原DNA疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用-小鼠血清 HBV-DNA的拷貝數(shù)圖4C為本發(fā)明建立的小鼠模型在核心抗原DNA疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用-小鼠肝臟熒
光素酶表達(dá)量圖5A為本發(fā)明建立的小鼠模型在表面抗原蛋白疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用_小鼠血清乙 肝表面抗原滴度圖5B為本發(fā)明建立的小鼠模型在表面抗原蛋白疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用-小鼠血清 HBV-DNA的拷貝數(shù)圖5C為本發(fā)明建立的小鼠模型在表面抗原蛋白疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用_小鼠肝臟熒 光素酶表達(dá)量
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體 的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例?；诒景l(fā)明的設(shè)計(jì)思想，實(shí)施中 HBV 1. 2倍基因組可由1. 3倍、1. 5倍、2. 0倍基因組代替；報(bào)告基因Fluc可由GLuc等所有
、鼠模型中乙肝病毒標(biāo)志物_小鼠血清乙肝表面抗原滴度 、鼠模型中乙肝病毒標(biāo)志物_小鼠血清乙肝表面抗原陽(yáng)性 、鼠模型中乙肝病毒標(biāo)志物_小鼠血清HBV-DNA的拷貝數(shù) 、鼠模型中乙肝病毒標(biāo)志物_小鼠肝臟核心抗原的表達(dá)量 、鼠模型中報(bào)告基因的檢測(cè)情況_小鼠肝臟熒光素酶活體 、鼠模型中報(bào)告基因的檢測(cè)情況_小鼠肝臟熒光素酶表達(dá) 、鼠模型在核心抗原DNA疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用-小鼠血清乙可活體成像的報(bào)告基因代替。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型的構(gòu)建用本發(fā)明的方法構(gòu)建體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型， 具體方法包括以下步驟一、可在體內(nèi)表達(dá)報(bào)告基因和HBV抗原的重組質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc_HBVl. 2的構(gòu)建含有AAV 的 HBV 1. 2 倍基因組(subtype adw, gene type Α)重組表達(dá)載體 pAAV/ HBV1. 2 (Huang LR, Wu HL，Chen PJ and Chen DS. Proc Natl Acad Sci USA. 2006，103 17862-17867.)包括HBV基因組1400_3182bp+l_1987bp和兩個(gè)反向重復(fù)序列(ITR)。利用 高保真PrimeSTARTMHS DNA聚合酶，通過PCR擴(kuò)增，獲得含有ITR的完整1. 2倍HBV基因片段， 反向插入真核表達(dá)載體 pGL3-CP-Fluc(Juan Du, YongZhou, Qiu-Xia Fu, Wei-Li Gong, Fang Zhao, Jian-Chun Peng and Lin-Sheng Zhan. FEBS Letters. 2008,582 :3552_3556. Fang Zhao, Sheng-qiang Liang, Yong Zhou, Ying-Ii Wang, Hu Yan, Xiao—hui Wang, Hai-ping Wang, Juan Du and Lin-sheng Zhan. Virus Research.)，構(gòu)建得到帶有報(bào)告基因和 HBV 基 因組的表達(dá)質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2。具體流程圖見圖1，操作過程如下1、獲取 ITR-HBV1 · 2 片段根據(jù)pAAV/HBVl. 2 載體上的 ITR-HBV1. 2 (subtype adw, gene type Α)的 cDNA 序 列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增上述基因片段的引物，引物序列如下PA(上游引物)5，-CCGCTCGAGTTACGATTACCGTTCATCG-3，；
PB (下游引物)5，-CGACGCGTGGAGCAAACAAGAGAATCGC-3，。以pAAV/HBVl. 2為模板，用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶，通過引物PA、PB 擴(kuò)增ITR-HBV1. 2的基因片段，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收純化試劑 盒(購(gòu)自TaKaRa公司)回收擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，PCR反應(yīng)體系為質(zhì)粒(pAAV/HBVl. 2) 2 μ 1， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1 μ 1，引物PA和PB各 1 μ 1，5XPrimeSTAR Buffer 20 μ 1, dNTP Mixture 8 μ 1，ddH20 67 μ 1，總體積 100 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為先 94°C預(yù)變性 5min ； 然后98°C變性IOsec, 55°C復(fù)性15sec，72°C延伸5min,共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min。2、載體和目的片段酶切、連接將步驟1回收獲得的ITR-HBV1. 2的基因片段經(jīng)Xhol/Mlul雙酶切處理后， 與經(jīng)過相同酶切(Xhol/Mlul)處理的載體pGL3-CP-Fluc進(jìn)行連接，構(gòu)建成目的質(zhì)粒 pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2。其中，雙酶切體系為 JTR-HBVl. 2 或 pGL3_CP_Fluc 7 μ 1，XhoI 和 MluI 各 2. 5 μ 1，10ΧΗ Buffer 5 μ 1, ddH20 33 μ 1，總體積 50 μ 1。37°C 酶切 3h，酶切產(chǎn) 物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后回收。酶切產(chǎn)物連接反應(yīng)體系為載體質(zhì)粒粘性末端1 μ 1， ITR-HBV1. 2 酶切產(chǎn)物 5 μ 1，10ΧΤ4 DNA Ligase Bufferl μ 1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1，ddH20 2μ1，*10μ1。4°C過夜連接。3、轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5 α，抗性篩選。將步驟2的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)菌，涂布氨芐抗性平板。4、陽(yáng)性克隆的篩選和酶切鑒定挑取步驟3中在抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落，提質(zhì)粒，用Xhol/Mlul酶進(jìn)行酶切鑒 定，經(jīng)酶切獲得4100bp和5100bp的目的片段為陽(yáng)性克隆。
5、測(cè)序?qū)⒉襟E4經(jīng)酶切鑒定正確的pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果 表明獲得了序列及插入位置均正確的重組質(zhì)粒，序列如序列表中序列1所示。二、構(gòu)建體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的HBV穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型1、純化將步驟一得到的重組質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量純化試劑 盒(QIAGEN 公司的 Protocol for EndoFree Plasmid Maxi Kit)進(jìn)行質(zhì)粒純化。2、轉(zhuǎn)染4-6周齡的雄性BALB/c小鼠(H_2d)和C57BL/6 (H_2b)(購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心)各12只，將10μ g重組質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2混合于相當(dāng)于小鼠體重10% 的生理鹽水，在五秒鐘以內(nèi)通過尾靜脈快速轉(zhuǎn)染至小鼠肝臟。三、鑒定1、血清HBsAg的檢測(cè)分別在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)通過小鼠尾靜脈取血200-300 μ 1，置于室溫下靜置4_6h后 4000rpm離心15min，吸取上層血清20 μ 1，用生理鹽水稀釋至200 μ 1，利用全自動(dòng)免疫分析 儀檢測(cè)HBsAg,結(jié)果彡0. 05IU/ml判斷為陽(yáng)性，< 0. 05IU/ml為陰性。檢測(cè)結(jié)果如圖2A(小鼠血清乙肝表面抗原滴度)所示，兩組小鼠在水動(dòng)力轉(zhuǎn)染后 1星期(w)內(nèi)高水平表達(dá)HBsAg，兩組之間無(wú)差異，此后，BALB/c小鼠HBsAg表達(dá)較大幅度 下降；而C57BL/6小鼠HBsAg表達(dá)下降不顯著，在實(shí)驗(yàn)的7w內(nèi)維持高水平表達(dá)。圖2B(小鼠血清乙肝表面抗原陽(yáng)性率)顯示HBsAg陽(yáng)性率發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠在 pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第7w HBsAg陽(yáng)性率仍達(dá)100%，隨之陽(yáng)性率開始下降，第 15w時(shí)為40% ；BALB/c小鼠在第4w后陽(yáng)性率開始下降，第15w為20%。 2、血清HBV DNA的檢測(cè)分別在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第1、4、7、14、28、49、和70d小鼠尾靜脈取血，4000rpm離心 20min后分離血清取10 μ 1，RT-PCR進(jìn)行HBV DNA的定量檢測(cè)。結(jié)果如圖2C (小鼠血清HBV-DNA的拷貝數(shù))所示，兩組小鼠轉(zhuǎn)染后第4至7d HBV DNA達(dá)到高峰，隨后開始下降，在實(shí)驗(yàn)的70d內(nèi)維持在103COpieS/mL以上。3、免疫組織化學(xué)染色分別在轉(zhuǎn)染后第3、135d采用斷頸法處死血清HBsAg陽(yáng)性的C57BL/6小鼠，分離肝 組織，用10%中性福爾馬林固定。固定肝組織，采用常規(guī)免疫組化方法檢測(cè)HBcAg表達(dá)水 平。檢測(cè)結(jié)果如圖2D(小鼠肝臟核心抗原的表達(dá)量)所示，在轉(zhuǎn)染后第3d HBcAg高水 平表達(dá)，第135d HBcAg仍有表達(dá)，但表達(dá)水平降低。4、活體熒光成像監(jiān)測(cè)肝臟Fluc的表達(dá)分別在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，注射Fluc的作用底物-D-Luciferin至小鼠腹腔， 5min后麻醉小鼠，置于IVIS活體熒光成像儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3A(小鼠肝臟熒光素酶活體成像示意圖)和圖3B (小鼠肝臟熒光素酶 表達(dá)水平數(shù)值圖)所示，在兩組小鼠中Fluc表達(dá)時(shí)間均超過7w，但BALB/c小鼠(H_2d)中 Fluc表達(dá)水平較C57BL/6 (H_2b)小鼠高1_2個(gè)數(shù)量級(jí)。
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上述鑒定結(jié)果表明獲得了體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的HBV 穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型。實(shí)施例2、報(bào)告基因標(biāo)記的HBV穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型用于疫苗激發(fā)的HBV特異性 CTLs功能的檢測(cè)1、重組真核表達(dá)載體pVAXl-HBc的構(gòu)建1. 1針對(duì)HBV核心抗原的表達(dá)基因HBc的引物由上海生工生物工程公司合成，引物 序列如下PC(上游引物)5，-CGCGGATCCATGGACATTGACCCTTAT-3，；PD (下游引物)5，-CCGGAATTCCTAACATTGAGATTCCCG-3，。1. 2獲取HBc片段以pAAV/HBVl. 2為模板，利用Taq DNA聚合酶，以PC、PD引物擴(kuò)增帶有EcoRI和 BamHI酶切位點(diǎn)的HBc的基因片段，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收純化 試劑盒(購(gòu)自TaKaRa公司)回收擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，PCR反應(yīng)體系為pAAV/HBVl. 23 μ 1，Ex Taq 0. 5μ 1，上、下游引物各 0. 5μ l，5XEx Taq Buffer 5 μ 1, dNTPMixture 2. 5 μ 1, ddH20 38 μ 1，共50 μ 1。PCR反應(yīng)條件為先94°C預(yù)變性5min ；然后94°C變性30sec，55°C復(fù)性 30sec，72°C延伸40sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min。1. 3載體和目的片段酶切、連接將回收的HBc基因片段經(jīng)EcoR I/BamH I雙酶切處理后，與經(jīng)過相同酶切(EcoRI/ BamH)處理的空載體pVAXl (購(gòu)自Invitrogen公司)進(jìn)行連接，構(gòu)建成目的質(zhì)粒pVAXl_HBc。 其中，雙酶切體系為HBc基因片段或載體質(zhì)粒7 μ 1，EcoR I 2. 5 μ l,BamH 12. 5 μ 1，10XK Buffer 5 μ LddH2O 33 μ 1，共50 μ 1。37°C酶切3h，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn) 行回收。連接反應(yīng)體系為載體質(zhì)粒粘性末端3yl，HBc基因片段的酶切產(chǎn)物4μ1，10ΧΤ4 DNA Ligase Bufferl μ 1, Τ4 DNALigase 1 μ 1, ddH20 1μ1，*10μ1。4°C連接過夜。1. 4轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5 α、陽(yáng)性克隆的篩選和酶切鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)菌，涂布氨芐抗性平板。挑取在抗性平板 上長(zhǎng)出的單菌落，提質(zhì)粒，用EcoR I/BamH I酶進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得3000bp和550bp 的目的片段為陽(yáng)性克隆。1. 5 測(cè)序?qū)⒔?jīng)酶切鑒定正確的pVAXl-HBc質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及 插入位置均正確的重組質(zhì)粒，序列如序列表中序列2所示。2、動(dòng)物免疫用重組酵母乙型肝炎疫苗(購(gòu)自葛蘭素史克公司)和HBc DNA疫苗對(duì)小鼠分別進(jìn) 行免疫。具體步驟如下2. 1重組酵母乙型肝炎疫苗免疫3-4w齡C57BL/6小鼠14只，隨機(jī)分為2組生理鹽水對(duì)照組和重組酵母乙型肝炎 疫苗組。采用頸背部皮下免疫，注射劑量為2 μ g/只；間隔兩周加強(qiáng)免疫，共免疫3次。2. 2HBc DNA 疫苗免疫3-4w齡C57BL/6小鼠14只，隨機(jī)分為2組pVAXl對(duì)照組和pVAXl-HBc。采用脛 骨前肌作為免疫部位，分別用100 μ g pVAXl和pVAXl-HBc溶解在50 μ 1的PBS中，進(jìn)行肌
8肉注射后，在免疫部位用500U、5ms條件下正反電轉(zhuǎn)3次，間隔兩周加強(qiáng)免疫，共免疫3次。3、報(bào)告基因標(biāo)記的HBV重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染免疫的小鼠及測(cè)定在最后一次免疫兩周后，將質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2加至相當(dāng)于小鼠體重10% 的生理鹽水，利用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法快速注射(5-Ssec)入小鼠體內(nèi)。分別檢測(cè)HBV抗原、病 毒顆粒和熒光素酶的表達(dá)。3. 1用DNA疫苗評(píng)價(jià)HBV小鼠模型3. 1. 1 血清 HBsAg 的檢測(cè)免疫的小鼠通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2質(zhì)粒后，分別在第1、7、14、21、 28d采血分離血清，全自動(dòng)免疫分析儀測(cè)量HBsAg。檢測(cè)結(jié)果如圖4A(小鼠血清乙肝表面抗原滴度)所示，pVAXl-HBc免疫組HBsAg在 第14d開始下降，21d時(shí)明顯降低直至28d轉(zhuǎn)變成陰性，而對(duì)照組HBsAg雖然隨時(shí)間的推移 也有下降，但下降不明顯，第28d仍可達(dá)100IU/mL。3. 1. 2血清HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果用RT-PCR 分別在水動(dòng)力轉(zhuǎn)染 pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2 質(zhì)粒后第 1、7、14、21、28d 檢
測(cè)小鼠血清中的病毒DNA的含量。結(jié)果如圖4B (小鼠血清HBV-DNA的拷貝數(shù))所示，pVAXI-HBc免疫組HBV DNA在 第14d開始下降，21d時(shí)明顯降低直至28d降至陽(yáng)性臨界值以下，而對(duì)照組HBV DNA雖然隨 時(shí)間的推移也有下降，但下降不明顯，第28d仍然維持在103COpieS/mL以上。3. 1. 3活體熒光成像監(jiān)測(cè)肝臟Fluc的表達(dá)免疫的小鼠通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2質(zhì)粒后，分別在第1、7、14、21、 28d活體熒光成像檢測(cè)小鼠肝臟Fluc表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果如圖4C(小鼠肝臟熒光素酶表達(dá)量)所示，pVAXl-HBc免疫組Fluc在第 14d開始下降，21d明顯降低直至28d不表達(dá)，而對(duì)照組Fluc雖然隨時(shí)間的推移也有下降， 但下降不明顯，28d仍保持在105photons/sec以上。說明pVAXl-HBc疫苗免疫的小鼠在清 除病毒的同時(shí)，也導(dǎo)致了肝臟損傷從而引起Fluc表達(dá)水平的下降。3.2重組HBsAa疫苗評(píng)價(jià)HBV小鼠模型3. 2. 1 血清 HBsAg 的檢測(cè)免疫的小鼠通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2質(zhì)粒后，分別在第1、7、14、21、 28d采血分離血清，全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)HBsAg。檢測(cè)結(jié)果如圖5A(小鼠血清乙肝表面抗原滴度)所示，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上HBsAg蛋白 疫苗免疫組血清HBsAg水平明顯低于對(duì)照組，且在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第14d以后所有小鼠都成陰性， 這是由于實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)的抗體快速中和了表面抗原而導(dǎo)致其快速下降。3. 2. 2血清HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量？0 分別在水動(dòng)力轉(zhuǎn)染？61^3-0 呼111(3-冊(cè)￥1.2質(zhì)粒后第1、7、14、21、 28d檢測(cè)小鼠血清中病毒DNA的含量。結(jié)果如圖5B (小鼠血清HBV-DNA的拷貝數(shù))所示，HBsAg疫苗免疫組HBV DNA在 第7d急速下降，21d時(shí)降低至102COpieS/mL，而對(duì)照組HBV DNA隨時(shí)間的推移也有下降，但 下降不明顯，第28d仍然維持在103COpieS/mL以上。3. 2. 3活體熒光成像監(jiān)測(cè)肝臟 的表達(dá)
免疫的小鼠通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2質(zhì)粒后，分別在第1、7、14、21、 28d活體熒光成像檢測(cè)在小鼠肝臟Fluc的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果如圖5C(小鼠肝臟熒光素酶表達(dá)量)所示，兩組小鼠的肝臟Fluc的表 達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。說明HBsAg疫苗是通過體液免疫而不是CTL應(yīng)答清除病毒。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明報(bào)告基因標(biāo)記的HBV穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型可用于疫苗激 發(fā)的HBV特異性CTLs功能的檢測(cè)。
權(quán)利要求
一種體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)載體構(gòu)建構(gòu)建包括HBV啟動(dòng)子、報(bào)告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體；2)將步驟1)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟1)中的HBV啟動(dòng)子為四個(gè) 基本啟動(dòng)子spl、sp2、核心啟動(dòng)子(cp)、xp與HBV兩個(gè)增強(qiáng)子(EnhI和EnhII)的所有可能的 組合；所述報(bào)告基因?yàn)榭苫铙w成像的所有已知報(bào)告基因，如熒光素酶報(bào)告基因Flue、GLuc ； 所述HBV全基因組為HBV 1. 2倍、1. 3倍、1. 5倍、2. 0倍基因組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟1)中的HBV全基因組 位于報(bào)告基因的下游。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟1)中 用于構(gòu)建重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為真核表達(dá)載體PGL3、pQE或pCI-neo ；以pGL3為 出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶HBV啟動(dòng)子、Fluc報(bào)告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體為 pGL3-CP-Fluc-HBVl. 2，其序列如序列表中序列1所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟2)將重組表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠前還包括對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行純化的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟2)中的 小鼠為雄性BALB/c小鼠(H-2d)或C57BL/6 (H-2b)；所述小鼠年齡為4_6周。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟2) 中的轉(zhuǎn)染方法采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法，具體方法為取4-6周齡的雄性小鼠，稱重，將10 μ g重組 表達(dá)載體混合于相當(dāng)于小鼠體重10%的生理鹽水，在五秒鐘內(nèi)通過尾靜脈使其快速轉(zhuǎn)染至 小鼠肝臟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于將重組 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠體后還包括對(duì)其進(jìn)行鑒定的步驟，具體方法為小鼠在轉(zhuǎn)染后第1、4、7、 14、28、49、和70d尾靜脈取血，檢測(cè)血清中ALT水平、HBsAg和HBVDNA的表達(dá)情況；活體熒 光成像監(jiān)測(cè)報(bào)告基因表達(dá)情況；對(duì)HBsAg檢測(cè)陽(yáng)性的小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)收集肝臟組織檢測(cè) HBcAg表達(dá)情況及肝臟病理變化，以確定小鼠模型是否構(gòu)建成功；所述模型鑒定包括如下指標(biāo)(1)報(bào)告基因的活體熒光成像；(2)HBV抗原HBsAg的定量檢測(cè)；(3)HBV抗原HBcAg的免疫組化檢測(cè)；(4)HBV DNA含量的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)；(5)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測(cè)定；(6)肝臟病理變化-HE染色觀察。
9.權(quán)利要求8所述方法確定的體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠 模型在監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs的殺傷性和非殺傷性功能中的應(yīng)用。
10.用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述方法構(gòu)建的體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因 標(biāo)記的小鼠模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。其構(gòu)建方法包括以下步驟1)載體構(gòu)建構(gòu)建包括HBV啟動(dòng)子、報(bào)告基因和HBV全基因組的重組表達(dá)載體；2)將步驟1)構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到體內(nèi)監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs功能的報(bào)告基因標(biāo)記的小鼠模型。本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可重復(fù)的可視化小鼠模型，該模型可用于監(jiān)測(cè)HBV特異性CTLs的殺傷性和非殺傷性功能。此外，本發(fā)明用成年小鼠采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法建立小鼠模型，不需要特殊儀器，具有研究周期短、花費(fèi)小、目的基因在肝臟特異長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，且具有表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A01K67/027GK101979605SQ20101028638
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者杜娟, 梁聲強(qiáng), 詹林盛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所