專(zhuān)利名稱(chēng)：一種金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)NAC家族轉(zhuǎn)錄因子，特別涉及 金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物衰老是在自然死亡前生理上的一系列衰退過(guò)程，是長(zhǎng)期進(jìn)化和自然選擇的結(jié) 果(李晴，朱玉賢，分子植物育種，第1卷，第3期，2003年)。它受遺傳基因控制，是發(fā)育的 組成部分。衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成和對(duì)環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)中一個(gè)必要的、主動(dòng)的過(guò)程， 是受內(nèi)外因子直接或間接影響的一種器官或組織逐步走向功能衰退和死亡的變化過(guò)程，它 除了代表器官或組織生命周期的終結(jié)之外，在發(fā)育生物學(xué)上也有著重要意義。
關(guān)于植物衰老的研究主要集中在葉片衰老的研究上。在葉片衰老過(guò)程中，細(xì)胞結(jié) 構(gòu)、生理生化代謝以及基因表達(dá)調(diào)控等都發(fā)生很多變化(G印stein S，Genome Biology, 5(3):212, 2004 ；Chandlee JM, Physiologia Plantarum, 113:1-8, 2001; Nam HG, Trends Plant Sci, 8 (6) : 272-277，2003)。關(guān)于葉片衰老在生理學(xué)，生物化學(xué)和分子生物 學(xué)方面已有不少報(bào)道(Yoshida S. Current Opinion in Plant Biology, 6: 79-84, 2003 ； Larry et al, Physiol Plant, 101: 746—753， 1997; Nam HG, Curr Opin Biotech, 8: 200-207, 1997 ； Smart CM, New Phyto 1, 126: 419-448，1994 ； Nam HG, Annu Rev Plant Biol, 58:115-36， 2007 ； Betania et al Trends Plant Sci ， 5(7):278-282. 2000)。高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆響應(yīng)都通過(guò)其轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控目的基因表達(dá)。NAC轉(zhuǎn)錄 因子是特異存在于植物中具有多種生物功能的一類(lèi)新型轉(zhuǎn)錄因子。1997年Aida等首先報(bào) 道了 NAC結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在矮牽牛NAM基因、擬南芥ATAFl / 2和⑶C2基因編碼蛋白的N端 包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名為NACXAida M，et al, Plant Cell, 9 (6) 841 - 857， 1997)。NAC轉(zhuǎn)錄因子最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是各成員的N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，整 個(gè)N端區(qū)域可劃分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A、B、C、D、E)，其中亞結(jié)構(gòu)域A、C、D高度保守，亞結(jié)構(gòu) 域C、D序列中含有核定位信號(hào)(nuclear localization signals, NLS)，可能與轉(zhuǎn)錄因子 核定位及啟動(dòng)子上特定順式元件的識(shí)別有關(guān)(Kikuchi K, et al, Mol Gen Genet, 262 (6)1047 - 1051，2000 ；Ooka H，et al, DNA Res, 10 (6) 239 -247，2003)。E 亞結(jié) 構(gòu)域在 NAP、AtNAC3、ATAF 和 0sNAC3 亞家族中高度保守(Ooka H, et al, DNA Res, 10 (6) 239 -247，2003)。C 端是轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)(transcrip tional activation regions, TARs)，具有高度的多樣性，該端的共同特點(diǎn)是一些氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷 氨酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率高。2003年，Ooka等通過(guò)全基因組分析，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)105個(gè)NAC 轉(zhuǎn)錄因子，在水稻中則發(fā)現(xiàn)75個(gè)NAC成員。通過(guò)比較NAC結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，將它們分 成2個(gè)大族，3個(gè)亞族(0sNAC3，ATAF，NAM)。根據(jù)近幾年報(bào)道，NAC家族又被劃分為為5 個(gè)亞族(0sNAC3, ATAF，NAM，AtNAC3, NAP)。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物頂端分生組織及花器官分化(Sabl0WSki，et al，Cell,92 (1) 93 - 103，1998)、側(cè)根形成(Mitsuda N, et al, Plant Cell, 17 (11) 2993 - 3006，2005)、次生壁增厚(Xie Q, et al, Genes Dev, 14 (23) 3024 -3036，2000)等植物特定發(fā)育過(guò)程以及抵抗生物(Hegedus D, et al, Plant Mol. Biol, 53:383-397，2003)與非生物脅迫過(guò)程(Nogueira FT, Plant Science, 169: 93 - 106， 2005)中均起著重要作用，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物衰老進(jìn)程也起著重要的調(diào)控作用(GU0 YF, GAN S, Plant Journal, 46(4): 601-612,2006)。研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生 長(zhǎng)發(fā)育、器宮建成、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。相 較于MYB類(lèi)、bZIP類(lèi)及WRKY類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子，NAC轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究較少。竹類(lèi)植物是禾本科(Ggramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物的總稱(chēng)，是重要的 森林資源，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在溫帶和寒溫帶也有少量分布。全世界共有竹種 70余屬1200余種，自然分布于亞洲、非洲、南北美洲、大洋洲等地，東南亞的熱帶亞熱帶地 區(qū)為其分布的中心地區(qū)，、其中生長(zhǎng)于亞洲的竹種約有38屬500余種。中國(guó)是亞洲竹子的 分布中心，是竹子種類(lèi)最豐富、分布最廣的國(guó)家，共有竹類(lèi)植物約29屬300余種，竹林面積 500萬(wàn)hm2，占全國(guó)森林總面積的4%以上，產(chǎn)量1. 3億噸；2006年竹業(yè)年產(chǎn)值可達(dá)598億元， 不論是竹林面積、竹種數(shù)量、竹筍和竹材產(chǎn)量均居世界首位，被譽(yù)為“竹子王國(guó)”。竹子是人類(lèi)目前所知道的生長(zhǎng)最快的植物。竹子用途相當(dāng)廣泛，根據(jù)最近統(tǒng)計(jì)，竹 子的傳統(tǒng)用途達(dá)1500多類(lèi)，而這個(gè)數(shù)字隨著世界各國(guó)對(duì)竹子的不斷開(kāi)發(fā)還在與日俱增。竹 子生長(zhǎng)快、成材早、產(chǎn)量高、用途廣，如今在建筑、造紙、裝飾材料、食品保健、園林綠化和生 態(tài)防護(hù)等領(lǐng)域，竹子均以其獨(dú)有的特點(diǎn)表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力。此外，竹子還是中國(guó)國(guó)寶 級(jí)動(dòng)物熊貓的主要食物。因此研究竹類(lèi)植物的衰老不僅有助于認(rèn)識(shí)其發(fā)育過(guò)程，而且有助于建立調(diào)控衰老 的方法，從而推遲衰老起始或延緩衰老進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種金絲慈竹NAC家族衰老調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基 因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的竹子衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于金絲慈竹(feffltom emeiensis ‘Viridiflavus，)，名稱(chēng)為^^4C7，是具有SEQ ID NO 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是 將SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與 SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白質(zhì)。金絲慈竹BeNACl轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，是下列核苷酸之一 1) SEQ ID NO 1所示的DNA序列。2)編碼SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的多核苷酸。序列表中，SEQ ID NO: 1由1684個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?，端第208位 至1275位堿基；SEQ ID NO: 2由355個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明還包括所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還包括所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的細(xì)胞系。本發(fā)明還包括所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因在竹子衰老調(diào)控分子 機(jī)制中的應(yīng)用。
本發(fā)明還包括所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因在延緩植物衰老性狀 改良中的應(yīng)用。


圖1為302bp中間片斷擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖2為1074bp 3’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖3為513bp 5’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖4為金絲慈竹BeNACl轉(zhuǎn)錄因子與其他物種的同源性分析。圖5為BeNACl轉(zhuǎn)錄因子在金絲慈竹中的表達(dá)模式分析。圖6正常生長(zhǎng)23天時(shí)，野生型，過(guò)表達(dá)^轉(zhuǎn)基因株系的表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1金絲慈竹BeNACl轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的獲得 1. 1 RNA提取
取金絲慈竹衰老葉片約O.lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，加Iml Tri Zfi ！ Φ ( invitrogen公司)，混勻后，室溫放置15分鐘，加0. 2ml氯仿異戊醇(24 1)，劇烈搖動(dòng)15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體 積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀，室 溫干燥15分鐘。溶解于適量的經(jīng)0. 1% DEPC處理過(guò)的ddH20水中，貯存于_80°C備用。1. 2 cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR
采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南 將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2ug制備的總RNA，0. 5ul Rnase inhibitor，加 DEPC 處理過(guò)的去離子水至 8. 5ul，2ul 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C, 5min，室溫放置lOmin，13000rpm簡(jiǎn)短離心5s。 再依次加入4μ1 5XFirst-Strand buffer,0.5 μ 1 RNase Inhibitor,2 μ 1 IOOmM DTT, 2μ 1 dNTP,1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase ο小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離 心5秒鐘，存放于-20°C待用
1.3 RT-PCR擴(kuò)增召eUCV基因中間片斷
根據(jù)以往在其他植物中克隆到的NAC家族基因的保守序列，設(shè)計(jì)了兩條同源兼并 弓I 物 BeNAClCF (5，TTCAGCCCGCGGGACCGCAAGTA 3，( SEQ ID N0: 3))禾口 BeNAClCR (5’ TAGATCCGGCACAGCACCCAGTCATC 3’ ( SEQ ID N0: 4))作為 PCR 反應(yīng)的引物。PCR 反應(yīng) 體系為50ul，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，58°C復(fù)性40s，72°C延伸60s，循 環(huán)38次。72°C充分延伸lOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得一段約 300bp的片斷。回收并且通過(guò)TA克隆至TAKARA pMD19_T載體后，由上海英駿公司測(cè)序，獲 得BeNACl基因的中間序列。1. 4 BeNACl全序列的獲得
1.4. 1 BeNACl的3’末端序列的擴(kuò)增
BeNACl基因的3，末端序列擴(kuò)增使用Clontech公司的SMART RACE cDNA amplification試劑盒。根據(jù)已經(jīng)獲得的保守序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。BeNACl3' RACE F 5， CGGCAACACCTACCGACCCATGAAGT 3， (SEQ ID NO: 5) BeNACl3' RACE NF 5' GTTGGATGACTGGGTGCTGTG 3' ( SEQ ID NO: 6)
反應(yīng)條件分別為
第一輪PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，60°C復(fù)性40s，72°C延伸90s，循環(huán)35 次。72 °C充分延伸IOmin。第二輪PCR 反應(yīng)94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，58°C復(fù)性 40s，72°C延伸 90s，循 環(huán)38次。72°C充分延伸IOmin。第二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)，獲得約IOOObp的片段，割膠回收并克隆至 克隆載體進(jìn)行測(cè)序，獲得3’末端序列。1.4.2 5，RACE法擴(kuò)增^MCrJ基因的末端序列
BeNACl基因的5，末端序列擴(kuò)增使用Clontech公司的SMART RACE cDNA amplification試劑盒。根據(jù)已經(jīng)獲得的保守序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性引物進(jìn)行巢式PCR反 應(yīng)。BeNACl5' RACE F 5’ TGCGGAACTTCATGGGTCGGTAGGTGT 3’ (SEQ ID NO: 7) BeNACl5' RACE NF 5' ATTGGTCTTGGTGCCCTTAG 3' (SEQ ID NO: 8)
反應(yīng)條件分別為
第一輪PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，60°C復(fù)性40s，72°C延伸90s，循環(huán)35 次。72 °C充分延伸IOmin。第二輪PCR 反應(yīng)94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，58°C復(fù)性 40s，72°C延伸 90s，循 環(huán)38次。72°C充分延伸IOmin。第二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，1 %電泳檢測(cè)，獲得約500bp的片段，割膠回收并克隆至克 隆載體進(jìn)行測(cè)序，獲得5’末端序列。根據(jù)已經(jīng)獲得的ife似CV 3’末端序列和5’末端序列以及中間序列拼接獲得了 BeNACl的全長(zhǎng)序列。實(shí)施例2 BeNACl序列分析 2. 1序列相似性分析
利用 NCBI BLAST 程序(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)對(duì) BeNACl 進(jìn)行序列 相似性分析表明，BeNACl與水稻中的NAC轉(zhuǎn)錄因子最相似，相似性達(dá)76%，一致性達(dá)70%。2. 2多物種序列比較分析
使用軟件Genedoc軟件分別分析了 BeNACl與其他物種的同源性。分析結(jié)果表明， BeNACl跟其他物種的NAP-Like轉(zhuǎn)錄因子具有極大的同源性，具有保守的NAC DNA結(jié)合結(jié) 構(gòu)域(A，B, C，D，E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域)，這一結(jié)構(gòu)域在其它物種中均高度保守。如圖4所示，圖 中加黑部分是一致性的氨基酸序列。所用基因的基因登錄號(hào)分別為0sNAP (NP_912423), HvNAM (ABI94358)，StNAC2 (ABK96797)，GmNACl(AAY46121)，CarNAC3(AC040486. 1), NAP (CAA10955), ATAFl or ANAC002 (NP_171677), AtNAM (AAD17314)。實(shí)施例3 BeNACl表達(dá)模式分析
3. 1金絲慈竹JCT/Λ/保守片斷的獲得 根據(jù)其他植物中分離得到的JCTI保守序列，設(shè)計(jì)了如下一對(duì)引物擴(kuò)增金絲慈竹JCTJtV保守片斷
BeActinF: 5' GAAGCACAATCCAAAAGAGGTAT 3' ( SEQ ID NO: 9) BeActinR: 5，GAGCCTCCGATCCAGACACT3，(SEQ ID NO: 10)
PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，52°C復(fù)性30s，72°C延伸60s，循環(huán)38 次。72 °C充分延伸IOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收，測(cè)序，NCBI比對(duì)驗(yàn)證。3. 2 BeNACl表達(dá)模式分析
1)取自然生長(zhǎng)狀態(tài)下嫩綠，開(kāi)始衰老以及衰老的金絲慈竹葉片，按照本發(fā)明1.1中的 方法抽提RNA，并按1. 2中的方法進(jìn)行第一鏈CDNA的反轉(zhuǎn)錄。2)取黑暗處理0天、6天、12天、18天、24天、30天的金絲慈竹葉片，按照本發(fā)明 1. 1中的方法抽提RNA，并按1. 2中的方法進(jìn)行第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄。3) Real-time 實(shí)時(shí)定量 PCR 使用日本 Toyobo 公司的 SYBR Green II PCR kit。所用的引物如下
BeNAClRT-F 5’ CGCCTAAGGGCACCAAGACC 3’ (SEQ ID NO: 11)
BeNAClRT-R 5’ CGGCACAGCACCCAGTCATC 3’ (SEQ ID NO: 12)
BeACTINRT-F: 5' TCACGCTATTCTTCGGTTGG 3' (SEQ ID NO: 13)
BeACTINRT-R 5' TAATCAAGGGCAACATAGGCG 3' (SEQ ID NO: 14)
PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，62°C復(fù)性25s，72°C延伸20s，循環(huán)40次。利用Real-time PCR檢測(cè)自然生長(zhǎng)狀態(tài)下不同生長(zhǎng)階段以及黑暗處理不同時(shí)間 的金絲慈竹葉片內(nèi)BeNACl的表達(dá)量，結(jié)果表明，在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下隨著葉片衰老程度的增 加，SeUCV的表達(dá)量不斷升高；黑暗處理?xiàng)l件下的表達(dá)量也隨著黑暗處理時(shí)間的增 長(zhǎng)而升高，但上升趨勢(shì)不如自然衰老誘導(dǎo)明顯。實(shí)施例4 BeNACl功能分析
4. 1組成型過(guò)表達(dá)植物表達(dá)載體構(gòu)建
利用引物 BeNAClF 和 BeNAClR 擴(kuò)增 BeNACl 的 CDS，并克隆至 pMD19_T vector (Takara)，測(cè)序無(wú)誤之后。使用Kpnl和Xbal雙酶切，回收純化目的片斷，并連接到經(jīng)過(guò)同 樣兩個(gè)酶酶切，純化的PCHF3植株表達(dá)載體上，命名為BeNACl-pCHF3。BeNAClF 5' GGGGTACCATAGAGATCTTGGAAAG 3' (SEQ ID N0: 15) BeNAClR 5' GTGTTCTAGAGCCCCATTGTTCACA 3' (SEQ ID N0: 16)
4. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
4. 2. 1 GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
1)在含利福霉素40ug/ml，慶大霉素30ug/ml的YEB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，28°C培養(yǎng) 48h-72h。2)挑單菌落到含利福霉素40ug/ml，慶大霉素30ug/ml的YEB液體培養(yǎng)基中 28°C 培養(yǎng)至 OD600 0 . 5，
3)冰上冷卻菌液，5000rpm，4°C10分鐘收集菌體
4)ImM Hepes pH 7. 0洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次
5)懸浮菌體于3ml10%甘油中，分裝到1.5ml離心管中，每管40ul。
4. 2. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
1)200ng質(zhì)粒DNA，W 40ul農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻后按以下條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。U1. 8 KV R 200 W
C 25 uF
2)電擊后添加800ulSOC液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)Ih
3)4000rpm, 10分鐘收集菌體，懸浮于200ul SOC中，涂在含100 ug/ml壯觀霉素，利 福霉素40ug/ml，慶大霉素30ug/ml YEB固體培養(yǎng)基上，28 °C倒置培養(yǎng)48h_72h。4. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化 4. 3. 1擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)
基質(zhì)組分蛭石黑土 珍珠巖9 3 0. 5 營(yíng)養(yǎng)液組分
基質(zhì)浸透營(yíng)養(yǎng)液后，將種子播于缽子中，用保鮮膜覆蓋，置于4°C黑暗條件下，2天后轉(zhuǎn) 入(16h L/8h D)光照，23°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)。擬南芥生長(zhǎng)到抽苔開(kāi)花即可供轉(zhuǎn)化。
4. 3. 2農(nóng)桿菌準(zhǔn)備
1)接種攜帶目的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌到含適量抗生素的YEB培養(yǎng)基中，280C，220rpm搖菌培養(yǎng)至OD6tltl 1.2。2) 5000rpm, 4°C 10分鐘離心收集菌體
3)菌體重新懸浮于5%的蔗糖溶液中，并調(diào)至0D_0. 8
4)加入SilwetL-77至終濃度為0. 03%。4. 3. 3擬南芥轉(zhuǎn)化(花蕾浸染法)
取擬南芥野生型材料，倒置浸泡地上部分于預(yù)備好的農(nóng)桿菌溶液中，晃動(dòng)約3秒，取 出，放置到蔭蔽條件下，保濕24h，轉(zhuǎn)入正常條件培養(yǎng)。4. 3. 4擬南芥轉(zhuǎn)化子篩選
收集轉(zhuǎn)化后擬南芥的種子。種子用0.01% HgCl2表面滅菌8分鐘，無(wú)菌水沖洗4次， 懸浮在0. 1 %的瓊脂糖中，然后按每平板(直徑15cm)2000粒種子(約40mg)，鋪在卡那霉素 50mg/L的MS培養(yǎng)基上。將平板置于4°C黑暗冰箱中2天，轉(zhuǎn)移到(16h L/8h D)光照，23°C 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。約10天左右可篩選出具卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株。將具抗性的植株 轉(zhuǎn)移到基質(zhì)培養(yǎng)，并收獲Tl代種子。4. 4過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定
收獲的Tl代轉(zhuǎn)基因植株種子經(jīng)表面滅菌后鋪在含50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上， 4°C黑暗冰箱中放置3天后，轉(zhuǎn)移到(16h L/8h D)光照，23°C條件下培養(yǎng)。在自然生長(zhǎng)狀 態(tài)下，通過(guò)觀察轉(zhuǎn)基因植株，野生型植株Col-O的衰老進(jìn)程發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在第23天甚至 更早就出現(xiàn)了明顯的衰老現(xiàn)象(提前抽苔，葉片黃化)，衰老進(jìn)程明顯快于野生型植株(第23 天尚未出現(xiàn)衰老現(xiàn)象)，見(jiàn)圖6所示。
權(quán)利要求
一種金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于是具有SEQ ID NO: 2 氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO: 2衍生的蛋白質(zhì)。
2.金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子BeNACl的編碼基因，其特征在于是下列核苷酸之一1)SEQ ID NO: 1所示的DNA序列；2)編碼SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于該基因的編碼框?yàn)樽?’端第208位到第 1275位堿基的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子BeNACl的編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子BeNACl的編碼基因的細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求2或3所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子BeNACl的編碼基因在竹子葉片衰 老調(diào)控分子機(jī)制中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求2或3所述金絲慈竹衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子BeNACl的編碼基因在改良竹子 衰老性狀中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種竹子中與衰老調(diào)控相關(guān)的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于金絲慈竹(Bambusaemeiensis‘Viridiflavus’)，名稱(chēng)為BeNAC1，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。BeNAC1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID NO1；(2)編碼序列表中SEQ ID NO2氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的基因在延緩竹子衰老性狀改良中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101928339SQ20101028624
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者丁雨龍, 梁寧菁, 蒯本科, 邱凱, 陳云霞, 魏強(qiáng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)