專利名稱：一種分枝桿菌噬菌體的保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域和微生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種新的噬菌體保存 方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，噬菌體已廣泛應(yīng)用于疾病的診斷，并用于疾病 治療的研究。在耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)成為結(jié)核病第三次大流行的原因之一 時，快速診斷結(jié)核病、快速藥物敏感性試驗(yàn)和結(jié)核病的新療法已成為當(dāng)今研究熱 點(diǎn)。利用噬菌體生物擴(kuò)增法(PhaB assay)以及熒光素酶報告噬菌體(Luciferase reporter phage)的方法快速檢測結(jié)核菌和藥物敏感性試驗(yàn)在最近得到開發(fā)，亦有 人認(rèn)為有必要將細(xì)菌的天敵——噬菌體作為治療耐藥細(xì)菌感染性疾病的手段。隨 著噬菌體技術(shù)用于疾病快速診斷以及噬菌體作為一種有希望治療細(xì)菌感染性疾 病的生物武器，尤其在耐多藥結(jié)核菌不斷增加的形勢下，研究分枝桿菌噬菌體的 擴(kuò)增和保存方法十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分枝桿菌噬菌體的新型保存方法，所述的方法是以無細(xì)胞 恥垢分枝桿菌菌苗作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥后保存。
將噬菌體采用真空凍干后4'C和室溫保存后比較，總體上4'C優(yōu)于室溫；而 采用不同保護(hù)劑時，保存效果相差較大，當(dāng)采用噬菌體宿主菌破碎制成的無細(xì)胞 恥垢分枝桿菌菌苗作為保護(hù)劑時，凍干后室溫或4"C保存，28周內(nèi)效價均只下 降101，保存效果理想。同時，用無細(xì)胞恥垢分枝桿菌疫苗作為保護(hù)劑保存的分 支桿菌噬菌體因含有無細(xì)胞恥垢分枝桿菌疫苗而具有良好的免疫刺激作用，利于 分枝桿菌噬菌體對結(jié)核病的治療。


圖1液體法用不同保護(hù)劑、保存溫度對噬菌體效價的影響
A—E分別代表不同保護(hù)劑7H9 (10%0ADC) +30%甘油、7H9 (10%OADC) +lmmol/L
CaCl2、 7H9 (10%OADC) +10%甘油+1咖01/^&(:12+0. 05%疊氮化鈉、SM、 4%小牛血
清白蛋白；1代表保存溫度為4°。， 2代表保存溫度為-7(TC。
圖2凍干法用不同保護(hù)劑、保存溫度對噬菌體效價的影響
A—G分別代表不同保護(hù)劑10%滅菌脫脂牛奶、7H9 (10%0ADC) +lmraol/L CaCl2 、
4%小牛血清白蛋白、SM、 7%無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗(MS)蛋白、3.5% MS蛋
白、1.75。/。MS蛋白；1代表4。C保存，2代表室溫保存。
圖3無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗免疫小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的IFN-Y (N. S指生理鹽水對照組，M.S指恥垢分枝桿菌菌苗免疫組)
*:指脾臟T淋巴細(xì)胞體外以PPD剌激時，恥垢組與對照組比較p〈0.0具體實(shí)施例方式
到現(xiàn)在為止，巳經(jīng)給出了本發(fā)明的一般性描述。借助于下列實(shí)施例，參 照特定的實(shí)施方案，以下給出更詳細(xì)的說明，目的是為了更好地理解本發(fā)明 的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)和操作方法。然而，無意于將本發(fā)明的范圍限定在此范 圍內(nèi)。在如下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常 規(guī)方法。
實(shí)施例l:分枝桿菌噬菌體的增殖和收集方法
本實(shí)施例詳細(xì)說明了噬菌體的具體增殖和收集方式。 1. 1增殖方式
分別采用單層和雙層Dubos瓊脂培養(yǎng)基，單層培養(yǎng)基與雙層培養(yǎng)基的上層
均含有10epFU噬菌體和lmg恥垢分枝桿菌。37。C培養(yǎng)24、 48h后，分別取上層 培養(yǎng)基于研磨器中加9 mlSM (鎂鹽液)液研磨，然后4。C 4000rpm離心20min， 上清再用0.2 um無菌濾器過濾，得到的噬菌體擴(kuò)增液進(jìn)行效價檢測。1.2.不同噬菌體/宿主菌比例對增殖效率的影響
采用瓊脂雙層法，培養(yǎng)基上層加不同比例的噬菌體(PFU) /宿主菌(CFU):
ioVio9、 io5/5xio8、 io5/io8、 io7io9、 10V5xi08、 io5/io8、 io7io9、 107/5
X108、 107108、 107109。 37。C培養(yǎng)48h后采用孵育-過濾法收集擴(kuò)增的噬菌體，
并進(jìn)行效價檢測。
1.3噬菌體的收集
孵育-過濾法擴(kuò)增平皿中加9ml SM液，37i:孵育lh后回收全部液體，用 0.2um無菌濾器過濾收集的液體，檢測效價。
實(shí)施例2:分枝桿菌噬菌體的保存方法
本實(shí)施例詳細(xì)說明了噬菌體的具體保存方法，包括不同保護(hù)劑、保存溫度對 分枝桿菌噬菌體穩(wěn)定性的影響。
2. 1保存工藝研究
將效價為101QPFU/ml的噬菌體分別用10%滅菌脫脂牛奶、含10%0ADC的7H9 (OADC，牛血清復(fù)合物)+lmraol/L CaCl2 、 4%小牛血清白蛋白、SM、 7%無細(xì)胞 恥垢分枝桿菌菌苗(MS)蛋白、3.5y。MS蛋白、1.75G/。MS蛋白等不同的液體保護(hù) 劑進(jìn)行10倍稀釋，再分裝于冷凍管中，分別保存于4'C、 -70°C。真空冷凍干燥 方法則是將效價為101Q PFU/ml的噬菌體分別用不同的凍干保護(hù)劑進(jìn)行10倍稀 釋，再分裝于安瓶中，每支0.5ml。 -30°<:預(yù)冷過夜、真空干燥后封閉安瓶口。制 備的凍干制品分別保存于4'C、室溫(22°C~25°C)、 37°C。分別在0、 2、 4、 8、 12、 20、 28周，采用雙層瓊脂法檢測不同保藏方法保存的噬菌體的效價。 2. 2不同保存方法對噬菌體穩(wěn)定性的影響
采用不同保護(hù)劑分別在不同條件下進(jìn)行液體保存與凍干保存，28周內(nèi)的效價 變化見圖1和圖2。
從圖1可知，當(dāng)噬菌體以液體形式4'C保存時，無論保護(hù)劑是什么，噬菌體 的效價在28周內(nèi)均未降低10i數(shù)量級以上，穩(wěn)定性好，操作方便，不需要特殊 設(shè)備，如低溫冰箱、凍干機(jī)等，-7(TC保存效果不如4nC保存。
噬菌體真空干燥后37"C保存效果均較差(結(jié)果未列示)。從圖2可以看出，噬菌體采用真空凍干后4'C、室溫保存，總體上4'C優(yōu)于室溫；不同保護(hù)劑保存
效果相差較大，當(dāng)釆用噬菌體的宿主菌破碎制成的無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗作為
保護(hù)劑時，凍干后室溫或4'C保存，28周內(nèi)效價均只下降101，較為理想。
以上結(jié)果表明，所用噬菌體以液體4t:保存28周具有較好的穩(wěn)定性，但凍干 保存更適合于試劑盒中微生物的保存和運(yùn)輸。-7(TC保存和真空冷凍干燥保存符 合菌種的低溫保藏原則，但保存噬菌體效果并不理想，對保護(hù)劑有較強(qiáng)的選擇性。 本研究發(fā)現(xiàn)采用一種以噬菌體宿主菌為主要成分的無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗作 為凍干保護(hù)劑時，室溫或4'C保存，噬菌體28周內(nèi)均保持較好的穩(wěn)定性。
實(shí)施例3:無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗的免疫刺激作用
以不同劑量的無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗免疫小鼠，同時以等體積的生理鹽水
注射另一組小鼠作為對照。末次免疫后l周，無菌取出脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞
濃度分別為2.0X107ml，分裝24孔板，每孔lral，并添加100 u 1ConA或PPD，
37°C、 5%0)2全濕潤培養(yǎng)72h后離心，取上清，-30。C保存。用小鼠IFN-Y ELISA
試劑盒測定脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y的含量。測定值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果
見圖3。
此例結(jié)果說明無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗免疫小鼠IFN-Y的表達(dá)量，具有上 調(diào)Thl類應(yīng)答的免疫刺激作用，由此可以推測以無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗作保護(hù) 劑的分支桿菌噬菌體具有較好的免疫刺激作用，利于其用于結(jié)核病的治療。
權(quán)利要求
1、一種分枝桿菌噬菌體的保存方法，包括以半固體培養(yǎng)方式培養(yǎng)噬菌體，離心過濾收集噬菌體，取無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥后保存。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述真空冷凍干燥保存包括下列 步驟向噬菌體液中加入蛋白濃度為3. 5 ~ 7%的無細(xì)胞恥垢分枝桿 菌菌苗，真空冷凍干燥后，在室溫或4。C保存。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中過濾膜的孔徑為0. 2 jam。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的無細(xì)胞恥垢分枝桿菌 菌苗的蛋白終濃度為3. 5~7%。
5、 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法制備的分枝桿菌噬菌體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分枝桿菌噬菌體，具有無細(xì)胞恥垢分枝 桿菌菌苗的免疫刺激作用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分枝桿菌噬菌體的保存方法，該方法采用半固體培養(yǎng)基擴(kuò)增分枝桿菌噬菌體，過濾法收集噬菌體，采用無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥法后室溫或4℃保存。該方法工藝簡單，穩(wěn)定性好，保存效果佳，所保存的噬菌體在作生物治療時兼具免疫刺激作用。
文檔編號C12N7/00GK101302498SQ200710097800
公開日2008年11月12日 申請日期2007年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月9日
發(fā)明者麗 彭, 苗 徐, 李恪梅, 沈小兵, 王國治, 城 蘇, 陳保文 申請人:中國藥品生物制品檢定所