專利名稱：一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒，對宿主菌具有高度的專一性。根據(jù)其侵染宿主菌后的狀態(tài)和結(jié)果，噬菌體分為兩種類型，其中一種能在宿主菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌，稱為烈性或毒性噬菌體。毒性噬菌體侵染細(xì)菌后，能在細(xì)菌中增殖并殺死細(xì)菌，而對動植物沒有毒性。因此，毒性噬菌體以其特有的自然特征，被期待成為較好的抗菌藥。早在上世紀(jì)30年代，就有噬菌體治療霍亂成功的報告，至今有文獻(xiàn)報道的噬菌體人體治療的臨床病例已累計達(dá)數(shù)千例。雖然許多早期噬菌體治療的研究似乎都適于臨床應(yīng)用，但噬菌體并沒有廣泛地用于臨床預(yù)防或治療細(xì)菌感染，究其原因主要是噬菌體抗菌譜狹窄，抗菌針對性太強(qiáng)，以及噬菌體的抗菌活性容易被機(jī)體的抵抗力削弱，導(dǎo)致噬菌體的臨床應(yīng)用受到限制。但是，有關(guān)噬菌體預(yù)防和治療細(xì)菌感染的研究歷久彌新，以噬菌體防治動物和人的細(xì)菌感染屢見報道。涉及的病原體主要有假單胞菌、葡萄球菌、克雷伯菌、大腸埃希菌、變形桿菌、沙門菌、志賀菌、鏈球菌、腸球菌、艱難梭桿菌、分枝桿菌、幽門螺桿菌等； 有關(guān)的感染性疾病包括皮膚粘膜感染、腸道感染、敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、膈下膿腫、肺部感染等；使用的方法有局部用藥、口服、滴入、注射等單用噬菌體治療，或者將純化的噬菌體與制藥領(lǐng)域普遍使用的緩沖液、金屬離子、表面活性劑等賦形劑復(fù)配使用(張輝，王冉，魏瑞成，陳明.一種福氏志賀氏菌噬菌體菌株及其應(yīng)用.專利申請?zhí)?200910029306. 9 ；公開號CN101519651A)；也有人采用噬菌體宿主菌破碎制成的無細(xì)胞恥垢分枝桿菌菌苗作為分枝桿菌噬菌體的保護(hù)劑，保存效果理想，且有利于分枝桿菌噬菌體對結(jié)核病的治療(王國治，彭麗，陳保文，等.一種分枝桿菌噬菌體菌的保存方法.專利申請?zhí)?00710097800. X;公開號CN101302498A)。但尚未見利用噬菌體宿主菌活細(xì)胞保護(hù)噬菌體的給藥方法。目前，隨著微生物耐藥性的日趨嚴(yán)峻，耐藥菌及其耐藥譜的快速遞增，多重耐藥菌及超級耐藥菌成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的一個棘手問題，尋找新的有效且無毒副作用的抗菌制劑成為治療微生物感染性疾病迫切需要解決的問題。由于毒性噬菌體具有獨特的特異性遞增放大裂菌效能，噬菌體療法又引起新的關(guān)注，噬菌體可能會成為抵御難治性病菌感染的一個有力武器。尋找新的野生型寬噬噬菌體，以及利用分子生物學(xué)技術(shù)拓寬噬菌體的噬菌譜， 成為噬菌體療法研究的熱點；幫助噬菌體突破機(jī)體免疫屏障發(fā)揮溶菌效能，則是噬菌體臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。裸露的噬菌體很容易被胃液等機(jī)體抗性因子滅活，而被宿主菌保護(hù)的噬菌體，因為噬菌體已經(jīng)侵入宿主菌，必需首先破壞細(xì)菌，方能進(jìn)一步破壞噬菌體。因此，受宿主菌保護(hù)的噬菌體比單純噬菌體抵抗力更強(qiáng)。只有有效的保持噬菌體的抗菌活性，減少機(jī)體抵抗力對噬菌體抗菌效力的削減，才能使噬菌體真正走向臨床應(yīng)用。本發(fā)明涉及的一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法，就是幫助噬菌體突破機(jī)體免疫屏障的一種特異的噬菌體保護(hù)方法，隨著噬菌體療法從實驗室研究走向臨床應(yīng)用，本發(fā)明具有十分重要的實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法，適用于采用噬菌體預(yù)防和治療機(jī)體內(nèi)各種原核和真核細(xì)胞型微生物所致的感染性疾病。本發(fā)明的目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的該方法首先使毒性噬菌體預(yù)感染相應(yīng)的宿主菌，然后根據(jù)細(xì)菌的感染部位，采用相對應(yīng)的給藥途徑，比如口服、含漱、栓塞、注射、 噴霧、涂抹等，使帶有活性噬菌體的宿主菌進(jìn)入體內(nèi)，噬菌體在宿主菌的保護(hù)下突破機(jī)體抵抗力，釋放子代噬菌體，侵染并裂解相應(yīng)細(xì)菌，達(dá)到治療細(xì)菌感染的目的。本發(fā)明的方法具體操作步驟如下(1)感染菌的分離和純培養(yǎng)；(2)感染菌的噬菌體分離和純化；(3)噬菌體應(yīng)用液的配制和模擬體內(nèi)抗菌效果檢測。上述步驟(1)中，感染菌包括導(dǎo)致人和動物不同部位感染的各種細(xì)菌、支原體、螺旋體、真菌等細(xì)胞型微生物。分離和純培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)時間，分別對應(yīng)于感染菌的分離培養(yǎng)所需。上述步驟(2)中，感染菌的噬菌體分離和純化，詳見“具體實施方式
”。上述步驟(3)中，噬菌體應(yīng)用液的配制要求噬菌體過量，即所有的宿主菌內(nèi)均含有噬菌體。配制的噬菌體藥用液經(jīng)過模擬體內(nèi)抗菌效果檢測的體外驗證實驗，應(yīng)該同時具備“體外培養(yǎng)檢測無相應(yīng)細(xì)菌生長、模擬消化液等抗性處理噬菌斑依然陽性、未保護(hù)的對照噬菌體模擬抗性處理后噬菌斑消失”等特征。該發(fā)明利用噬菌體進(jìn)入宿主菌后，對外界的抵抗力增強(qiáng)的特征，以噬菌體的宿主菌幫助噬菌體突破機(jī)體的免疫屏障，避免了噬菌體易受理化因素破壞失活的弱點。使噬菌體在宿主菌中保持活性、并釋放子代噬菌體、特異性裂解更多的細(xì)菌，達(dá)到治療相應(yīng)細(xì)菌引起的感染性疾病。


圖1噬菌體單層平板驗證實驗
噬菌體單層平板檢測是噬菌體定性檢測，結(jié)果有噬菌斑，說明有對應(yīng)的噬菌體存在； 圖2噬菌體雙層平板檢測
噬菌體雙層平板檢測是噬菌體定量檢測，每單個噬菌斑都是1個噬菌體增殖的結(jié)
果；
圖3噬菌體應(yīng)用液雙層平板抗菌試驗(左實驗組；右對照組) 噬菌體應(yīng)用液雙層平板抗菌試驗，即噬菌體模擬治療體外驗證實驗，實驗組是模擬消化液等抗性處理后，其噬菌斑依然陽性；對照組為未保護(hù)的噬菌體經(jīng)模擬抗性處理后噬菌斑消失。
具體實施例方式實施例1、噬菌體的分離(1)制備目的菌懸液取感染部位的標(biāo)本分離并純培養(yǎng)為目的菌斜面一支，加無菌水洗下菌苔，制成菌懸液。所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，均以培養(yǎng)出目的菌為準(zhǔn)(下同)。(2)樣本中噬菌體的增殖培養(yǎng)于三倍濃縮的液體培養(yǎng)基中，1 2加入過濾除菌的污水樣品，并接種目的菌懸液，使樣本中的噬菌體與目的菌一起培養(yǎng)。具體培養(yǎng)時間根據(jù)不同的細(xì)菌確定，如大腸桿菌等一股細(xì)菌培養(yǎng)12_24h ；幽門螺桿菌培養(yǎng)5-7d (下同)。(3)制備噬菌體裂解液將以上混合培養(yǎng)液2500r/min離心15min后，將離心上清液過濾除菌。所得濾液倒入滅菌三角燒瓶內(nèi)，37°C培養(yǎng)過夜，以作無菌檢查。(4)確證噬菌體存在經(jīng)無菌檢查無細(xì)菌生長的濾液作確證試驗，進(jìn)一步證實噬菌體的存在。將目的菌液涂布接種至固體培養(yǎng)基平板上，待平板菌液干后，分散滴加3小滴濾液于平板菌層上面，37°C培養(yǎng)一定時間。若在滴加濾液處形成無菌生長的透明噬菌斑，便證明濾液中有目的菌的噬菌體存在(圖1)。實施例2、噬菌體的純化(1)明確有噬菌體存在后，做噬菌體雙層平板定量純化試驗。第一管用接種環(huán)取濾液2環(huán)加入0. 2ml懸液，第二管濾液5環(huán)加入0. 2ml菌懸液，第三管濾液10環(huán)加入0. 2ml菌懸液，第四管單用0. 2ml濾液做濾液對照，第五管單用0. 2ml菌懸液做菌對照。各管混勻，37°C靜止15-30min。(2)取上層0. 8%瓊脂培養(yǎng)基，溶化并冷卻至48°C，分別加4ml于以上噬菌體與細(xì)菌的混合液0. 2ml中，立即混勻。(3)并立即倒入底層培養(yǎng)基上，鋪勻。置37°C培養(yǎng)一定時間。(4)此時長出的單個噬菌斑，其形態(tài)、大小和數(shù)量常不一致，在數(shù)量少、單個噬菌斑清晰的平板中(圖2)，挑選形態(tài)圓整、直徑大的噬菌斑，用接種針在單個噬菌斑中刺一下， 小心采取噬菌體，接入含有宿主菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)，37°C培養(yǎng)。(5)待管內(nèi)菌液完全溶解后，過濾除菌，即得到純化的噬菌體。以上⑴⑵(3)三步驟，目的是在平板上得到單個噬菌斑，能否達(dá)到目的，決定于所分離得到的噬菌體濾液的濃度和所加濾液的量，若平板上的噬菌斑連成一片，則需減少濾液接種量或增加宿主菌的量；若噬菌斑太少，則增加濾液接種量。實施例3、高效價噬菌體的制備剛分離純化所得到的噬菌體往往效價不高，需要進(jìn)行增殖。將純化了的噬菌體濾液與液體培養(yǎng)基按1 10的比例混合，再加入宿主菌懸液適量(可與噬菌體濾液等量或1/2的量)，培養(yǎng)，使增殖，如此重復(fù)移種數(shù)次，最后過濾，可得到高效價的噬菌體制品。實施例4、噬菌體與宿主菌混合液(噬菌體應(yīng)用液)的配制取實施例3制備的高效價噬菌體制品，重復(fù)實施例2(1) (2) (3)三步驟，目的是得到在平板上噬菌斑連成一片(無細(xì)菌生長)的最小濾液接種量，按大于/等于此時濾液與宿主菌液的混合比例配制噬菌體與宿主菌混合液，即噬菌體應(yīng)用液，應(yīng)用液配成之后，4-8°C保存，1-2天內(nèi)使用，或者_(dá)25°C 保存，1年內(nèi)使用。實施例5、噬菌體應(yīng)用液的檢測噬菌體應(yīng)用液配制完成后和使用之前均應(yīng)做雙層平板抗菌試驗檢測。噬菌體應(yīng)用液及純化噬菌體液對模擬消化液的抗性檢測參照孟祥晨等試驗方法 (孟祥晨，霍貴成.雙歧桿菌抗消化道逆環(huán)境特性的研究.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29 (10) 6-10.)。以噬菌體應(yīng)用液(噬菌體預(yù)感染宿主菌)為實驗組、純化噬菌體(濾液)為對照組，37°C處理1.5h。采用實施例2(1) (2) (3)中的雙層平板試驗，檢測實驗組和對照組中噬菌體的溶菌效果。結(jié)果實驗組噬菌斑依然陽性，對照組噬菌斑消失，說明噬菌體可以在宿主菌的保護(hù)下，通過機(jī)體抵抗力，發(fā)揮溶菌作用(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法，其特征在于該方法是采用噬菌體的宿主菌來保護(hù)相對應(yīng)的毒性噬菌體。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的噬菌體保護(hù)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)分離純化機(jī)體某部位細(xì)胞型感染性微生物的毒性噬菌體；(2)以雙層瓊脂平板法確定噬菌體的滴度，即噬菌體的空斑形成單位(pfu)；(3)以“噬菌體宿主菌>1”的滴度使噬菌體預(yù)感染宿主菌，配制成受宿主菌保護(hù)的噬菌體藥用液體，即噬菌體的感染復(fù)度MOI (multiplicity of infection)值遠(yuǎn)大于等于1時 (即噬菌體過量)；(4)所配制的噬菌體藥用液經(jīng)過體外驗證實驗，應(yīng)該同時具備“體外培養(yǎng)檢測無相應(yīng)細(xì)菌生長、模擬消化液等抗性處理噬菌斑依然陽性、未保護(hù)的對照噬菌體模擬抗性處理后噬菌斑消失”等特征。
3.根據(jù)權(quán)力要求2所述噬菌體保護(hù)方法，其特征在于步驟(1)中所述機(jī)體為人和豬、 牛、雞、鴨、鵝、羊、馬、狗等動物。
4.根據(jù)權(quán)力要求2所述噬菌體保護(hù)方法，其特征在于步驟(1)中所述機(jī)體某部位為人和動物的口腔、胃、腸道、泌尿生殖道、呼吸道、眼結(jié)膜等機(jī)體的粘膜表面和腹膜腔、胸腔、血管腔、硬膜下腔、蛛網(wǎng)膜下腔等無菌的腔道，以及其它組織器官。
5.根據(jù)權(quán)力要求2所述噬菌體保護(hù)方法，其特征在于步驟(1)中所述細(xì)胞型感染性微生物為細(xì)菌、支原體、衣原體、螺旋體、真菌等細(xì)胞型微生物中的具體種和型。
6.根據(jù)權(quán)力要求2所述噬菌體保護(hù)方法，其特征在于步驟(1)中所述毒性噬菌體為用于治療微生物感染的野生型毒性噬菌體和基因工程改造的具有裂菌作用的噬菌體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種保護(hù)噬菌體活性的給藥方法及其應(yīng)用，該方法以噬菌體的宿主菌保護(hù)噬菌體，從而增強(qiáng)了噬菌體的抵抗力，目的是幫助噬菌體突破機(jī)體免疫屏障，使噬菌體在宿主菌的保護(hù)下完成初次增殖，并釋放眾多的子代噬菌體，進(jìn)而特異性侵染并裂解感染菌。本發(fā)明的方法可用于機(jī)體內(nèi)所有部位和臟器的原核和真核細(xì)胞型微生物所致感染的噬菌體療法。本發(fā)明減少了機(jī)體抵抗力對噬菌體療法的干擾，擴(kuò)增和放大了噬菌體的治療劑量和治療效果，為臨床實施噬菌體治療微生物感染性疾病，提供了一種實用有效的給藥新方法。
文檔編號A61P31/04GK102370669SQ201010253208
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月14日
發(fā)明者萬學(xué)勤, 唐冬生, 崔志新, 李宏鳴 申請人:萬學(xué)勤