重組Ⅱ型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物領域，特別涉及重組豬圓環(huán)病毒PCV2-Cap/Phage展示顆粒的制備和運用，重組Ⅱ型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒的制備方法，具體包括：1）優(yōu)化編碼Ⅱ型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白的核苷酸，2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建，3）重組噬菌體基因組的構(gòu)建，4）重組Ⅱ型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒的制備四個步驟；經(jīng)動物實驗證明重組展示顆粒具有良好的抗原性，可以刺激豬機體產(chǎn)生良好的體液免疫和細胞免疫反應，能夠防控II豬圓環(huán)病毒感染；本工藝復制所需要的時間短；重組展示顆粒生產(chǎn)成本低；產(chǎn)品使用便捷，保存簡單方便，克隆產(chǎn)量高。
【專利說明】重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領域，特別涉及重組豬圓環(huán)病毒PCV2_Cap/Phage展示顆粒的制備和運用。
【背景技術】
[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus, PCV)為 Tischer (1974)在 PK-15 細胞系中發(fā)現(xiàn)的一種無囊膜、無CPE的細胞污染物；于1982年鑒定為單股環(huán)狀DNA病毒。它是目前發(fā)現(xiàn)的最小的一種脊椎動物病毒，分類上屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。豬圓環(huán)病毒分為不致病豬圓環(huán)病毒I型(PCVl)及致病性豬圓環(huán)病毒2型(PCV2，下同)兩種病毒。
[0003]豬圓環(huán)病毒病(PCVD)是由PCV2病毒引起的斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning systemic wasting syndrome,PMWS)是公認的危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟影響性疾病，同時也是我國養(yǎng)豬業(yè)繼豬瘟和藍耳病之后的第三大傳染病。PCV2急性感染損害豬免疫系統(tǒng)，造成免疫系統(tǒng)紊亂，產(chǎn)生免疫抑制，使機體免疫力下降，最終導致死亡率急劇上升。同時PCV2可與其他多種病原混合感染、大大降低豬場生產(chǎn)成績。目前，我國絕大多數(shù)豬場的豬群均已感染豬圓環(huán)病毒。豬圓環(huán)病毒病可能給豬場帶來嚴重的經(jīng)濟損失，其導致的直接經(jīng)濟影響主要表現(xiàn)為:豬群保育期和生長育肥期的高死亡率，以及受疾病影響，豬出欄重無法達到要求等；間接經(jīng)濟影響則包括:豬場為控制細菌混合感染而不得不增加抗生素用量，改變豬場管理 辦法，以盡可能減少疾病發(fā)生，增加養(yǎng)豬的成本等。
[0004]PCV2基因組為單股環(huán)狀負鏈DNA，全長1768bp或1767bp。已有的資料顯示，PCV2的基因組共編碼11個開放閱讀框(Open reading frames, 0RF),其中主要的閱讀框為ORFl和0RF2。ORFl功能是與病毒的復制轉(zhuǎn)錄有關(Mankertz et al.1998)，為最大的閱讀框;0RF2的功能是編碼病毒的衣殼(Cap)蛋白，共有702bp核苷酸，位于基因組的互補鏈上，編碼233個氨基酸。Cap蛋白的N-端65~87aa、113~147aa、157~183aa區(qū)域及C端的4個氨基酸為病毒的主要抗原位點。其中的N端69~83aa和117~131aa兩個抗原位點具有針對PCV2型特異性；能被PCV2多抗所識別，N端157~183aa抗原位點為PCVl和PCV2共同具有。盡管PCVl和PCV2的Cap蛋白存在一個共同的抗原位點，但血清學實驗顯示兩種血清型的Cap蛋白之間不存在抗原交叉性。Cap蛋白是PCV2病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，能誘導產(chǎn)生較強的抗體反應，是構(gòu)建重組疫苗和臨床檢測的首選抗原。因此，大量地生產(chǎn)Cap蛋白是將其應用于疫苗研制中急需克服的問題。
[0005]有效疫苗免疫是預防和控制豬圓環(huán)病毒感染的關鍵。疫苗免疫通過特異性地刺激機體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抗病毒抗體、細胞免疫力以及免疫記憶，以清除病毒。利用傳統(tǒng)的豬腎細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)圓環(huán)病毒滅活疫苗，病毒效價低，抗原含量不足，產(chǎn)量低。目前，國內(nèi)豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)滅活疫苗產(chǎn)量低，價格高，限制了該類產(chǎn)品的推廣和應用。盡管國外已有上市的亞單位疫苗，能夠顯著地降低病毒學癥，但價格昂貴。此外，關于使用酵母和桿狀病毒表達0RF2蛋白的報道，但酵母表達系統(tǒng)繁瑣，存在蛋白切割的問題，桿狀病毒則存在表達成本高，蛋白純化困難等缺點。
[0006]本發(fā)明是基于上述現(xiàn)有技術，并針對現(xiàn)有技術的不足進行改進發(fā)明的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體(以下簡稱PCV2_Cap/Phage)的展示顆粒及其制備方法，以及制備重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒所需的關鍵基因、重組質(zhì)粒等。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為:
[0009]PCV2-Cap蛋白(II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白的簡稱)在制備重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒中的應用，所述CV2-Cap蛋白的氨基酸序列以如SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
[0010]如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列如下:
[0011 ] “MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP”，其中，上述以大寫首字母對應的氨基酸及氨基酸簡寫詳見【具體實施方式】部分。
[0012]編碼II型豬圓環(huán) 病毒的衣殼蛋白的表位氨基酸的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，該核苷酸序列在保證編碼氨基酸相同的前提下，把序列中稀有的密碼子替換成為大腸桿菌偏愛的密碼子，在序列的兩段上面加上E.coRI, HindIII雙酶切位點(即起始端:5，-端-EcoR I酶切位點5’ -GAATTC ;終止端:3’ -端-Hind III酶切位點aagctt-3’，總計合成DNA序列長度為714bp，要求序列內(nèi)部不出現(xiàn)EcoRI和HindIII的作用位點。
[0013]^gaattcatgacttatccgcgtcgtcgctatcgtcgtcgccgtcaccgcccacgttcccatctgggtcagatcctgcgtcgtcgtccgtggctggtacatccgcgccaccgctaccgttggcgccgtaaaaacggtattttcaacacccgtctgtctcgtaccttcggttacactatcaaacgtaccaccgtgaagaccccttcttgggcagttgacatgatgcgcttcaacatcaacgacttcctgccgccaggcggtggttccaacccgcgttccgttccgtttgaatactaccgcattcgtaaagtgaaagttgagttctggccgtgctctccgattacgcagggcgaccgtggtgttggctcttctgcggttatcctggatgataatttcgtaacgaaagctactgctctgacctacgacccgtacgtcaattactctagccgccacaccattacccaaccgttctcttaccacagccgttacttcacgccgaaaccggtactggattccaccatcgactattttcagccgaacaataagcgtaaccagctgtggctgcgtctgcaaactgccggtaacgtggatcacgttggcctgggcactgcgtttgagaacagcatctatgaccaggaatataacatccgtgtgaccatgtacgtccagttccgcgaatttaacctgaaagatcctccactgaacccgtaaaagctt，，。
[0014]以如SEQ ID NO:1所示的DNA為模板，在擴增體系下進行PCR擴增，循環(huán)30次，得PCR產(chǎn)物:PCR擴增所設計并合成的上游引物為5’ -RRctRcaRRaattcatRactt-3? (SEQ IDNO: 2),下游引物為 5’ -tcgataagcttgtacgggttc-3’ (SEQ ID NO: 3);將所得 PCR 產(chǎn)物純化后，經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物與同樣經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切的線性表達載體pET28a ( + )連接，得重組質(zhì)粒。
[0015]重組噬菌體基因組，將所述的重組質(zhì)粒用E.coRI, HindIII進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與具有相同粘端的T7噬菌體載體(型號:T7SelectlO-3b，載體圖詳見圖7)試劑盒中的雙臂連接，得重組噬菌體基因組。[0016]運用所述的重組噬菌體基因組制備重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒，將所述重組噬菌體基因組經(jīng)過體外包裝后，轉(zhuǎn)染宿主菌E.coli BLT5403，通過培養(yǎng)裂解宿主菌，得到重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒。
[0017]所述的重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒在制備防控PCV2感染的疫苗中的應用。
[0018]所述的重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒在制備II型豬圓環(huán)病毒抗原中的應用。
[0019]所述的重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒的制備方法,具體包括以下步驟:
[0020]A優(yōu)化PCV2_Cap蛋白的核苷酸
[0021]以GenBank中編號為HM565924.1的衣殼蛋白，即Cap蛋白的核苷酸序列作為模板,優(yōu)化后,其序列如SEQ ID NO:1所示，進行人工合成；
[0022]B重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0023]以人工合成的核苷酸為模板，進行PCR擴±曾，上游弓丨物為5’-RRctRcaRRaattcatRactt-3’,下游弓丨物為5’-tcgataagcttgtacgggttc-3’，循環(huán)30次，得PCR產(chǎn)物;將所得PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切，回收酶切產(chǎn)物;將酶切產(chǎn)物與同樣經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切的線性表達載體pET28a⑴連接,得重組質(zhì)粒；
[0024]C重組噬菌體基因組的構(gòu)建
[0025]將所述的重組質(zhì)粒用E.coRI, HindIII進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與具有相同粘端的T7噬菌體載體(型號:T7selectlO-3b)試劑盒中的雙臂連接，得重組噬菌體基因組；
[0026]D重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒的制備
[0027]將所述重組噬菌體基因組經(jīng)過體外包裝后，轉(zhuǎn)染宿主菌E.coli BLT5403,通過培養(yǎng)裂解宿主菌，得到重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒。
[0028]進一步,所述的制備方法,將步驟D所得重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒通過離心處理，得濃縮重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒。
[0029]本發(fā)明的有益效果在于:利用噬菌體展示系統(tǒng)對PCV2_Cap蛋白進行高效表達展示，可以獲得更高含量的抗原蛋白，且下游處理工藝更加成熟，對圓環(huán)病毒的檢測防控都有巨大的應用價值。噬菌體展示系統(tǒng)成熟，具有以下的優(yōu)點:噬菌體展示顆粒的基因組大，可以容納的IOkb左右外源DNA且不影響復制，還可以同時進行多個外源片段的表達。噬菌體展示顆粒有明顯的宿主界限，對脊椎動物無致病性，也不能夠在脊椎動物細胞內(nèi)復制表達，更不能整合。因此，對眾多生物具有很高的安全性。噬菌體感染宿主后產(chǎn)生大量的噬菌體顆粒，高效展示PCV2-Cap蛋白。加之，噬菌體感染的宿主菌為大腸桿菌工程菌，其遺傳背景清楚，培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)等優(yōu)點。因此，以感染效率高、增殖周期短、純化成本低廉、穩(wěn)定性高的噬菌體作為PCV2保護性抗原(基因)的投遞系統(tǒng)，展示蛋白位于顆粒的外表，是一種克服用傳統(tǒng)方法獲得PCV2抗原成本高的問題，以及PCV2亞單位疫苗免疫原性弱的不足。本工藝復制所需要的時間短；重組展示顆粒生產(chǎn)成本低；產(chǎn)品使用便捷，保存簡單方便，克隆產(chǎn)量高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為不同GenBank號的PCV2_Cap氨基酸序列比較分析。
[0031]圖2為人工合成序列與原序列的比較分析，其中，>0ri DN:為>GenBank:HM565924.1即原序列，>Modify DN:為優(yōu)化合成的編碼PCV2_Cap蛋白的DNA序列，>Consensus:兩DNA序列比較的一致性結(jié)果。
[0032]圖3為重組質(zhì)粒pET28a(+)_Cap的E.coRI, HindIII雙酶切鑒定圖。
[0033]圖4為重組PCV2-0RF2表達鑒定，經(jīng)IPTG誘導，在0h，2h，4h，6h，8h，IOh等不同時相內(nèi)產(chǎn)生的融合蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0034]圖5為重組PCV2_Cap/Phage的噬菌體斑進行PCR鑒定的電泳圖，結(jié)果表明重組PCV2-Cap/Phage展示顆粒構(gòu)建成功，其中，圖5-A為PCV2_Cap-Phage噬菌體斑，圖5-B為隨機噬菌體斑的PCR鑒定。[0035]圖6為用豬圓環(huán)病毒II型抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定血清中的PCV2抗體效價進行豬抗體消長規(guī)律分析圖。
[0036]圖7 為 T7selectl0_3b 的載體圖。
【具體實施方式】
[0037]以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0038]部分氨基酸相應的縮寫如下:
[0039]谷酰胺gin Q ;甘氨酸gly G ;絲氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸t(yī)hrT ;繳氨酸val V;異亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L;酪氨酸t(yī)yr Y;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H ;脯氨酸pro P;天冬氨酸asp D ;甲硫氨酸met Μ;谷氨酸glu E;色氨酸t(yī)rp W ;賴氨酸Iys K ;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R0
[0040]實施例1 II型豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的研究
[0041]從GenBank中下載不同時期登錄的、不同GenBank號的PCV2_Cap的氨基酸序列，進行比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼PCV2-Cap氨基酸序列相似性高，氨基酸序列比較保守，這與PCV2-Cap蛋白是PCV2病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白的特征相符，如圖1所示。最后確定PCV2(GenBank:HM565924.1)編碼的衣殼蛋白(Cap蛋白)序列作為研究模板，其氨基酸序列如SEQID NO:4 所示。
[0042]在前述PCV2_Cap蛋白分析的基礎上，結(jié)合卩遼菌體T7Select Phage DisplaySystem的宿主菌為大腸桿菌(E.coli BL5403)的特點，設計并優(yōu)化編碼PCV2_Cap的核酸序列。方法是在保證編碼氨基酸相同的前提下，把序列中稀有的密碼子替換成為大腸桿菌偏愛的密碼子，在序列的兩段上面加上E.coRI, HindIII雙酶切位點(即起始端:5’-端-EcoRI酶切位點5’ -gaattc ;終止端:3’ -端-Hind III酶切位點AAGCTT-3’，總計合成DNA序列長度為714bp，要求序列內(nèi)部不出現(xiàn)EcoRI和HindIII的作用位點。優(yōu)化序列與原序列比較分析，出現(xiàn)較大程度上的堿基同義替代，詳見圖2。
[0043]優(yōu)化編碼PCV2_Cap的核酸序列交由上海生工生物工程技術服務有限公司人工合成，得合成的DNA序列，如SEQ ID N0:2所示。同時，根據(jù)合成的DNA序列，設計一對引物(上游引物Pl:5，-ggctgcaggaattcatgactt_3，，紅色為EcoRI酶切位點，下劃線為EcoRI酶切位點的保護性堿基；下游引物P2為:5，-tcRataaRcttRtacRRRttc_3，，紅色為HindIII酶切位點，下劃線為HindIII酶切位點的保護性堿基，引物交由上海生工合成)。之后，進行PCR。擴增體系為:合成序列Ι.Ομ 1，上下游引物(20pmol/L)各1.0 μ 1，dNTPs (2.5mmol/L) 4.Ομ I, Taq0.5μ I, IOXEx Taq? buffer5 μ I, Ex Taq? DNA 聚合酶 0.5 μ 1，去離子水37 μ L ；PCR反應條件:預變性3min，進入PCR循環(huán)，94°C變性45s，55。。退火55s，72。。延伸40s，進行30個循環(huán)后，72°C延伸IOmin。反應結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增，并對PCR產(chǎn)物用OMGA膠回收試劑盒回收純化。
[0044]實施例2重組質(zhì)粒的制備
[0045]將實施例1所得的PCR產(chǎn)物，即回收純化的DNA片段經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切，電泳檢測回收大約為720bp的目的片段，與同樣經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切的線性表達載體pET28a ( + )連接。連接體系為:目的片段5.0μ 1，線性pET28a ( + )載體L O μ 1，T4DNAligasel.00 μ 1,10XT4DNA ligase buffer 1.0 μ I, ddH202.0 μ L.4°C 連接過夜，獲得重組質(zhì)粒 pET28a (+) -Cap。
[0046]實施例3轉(zhuǎn)化及蛋白的表達
[0047]取實施例2制備的重組質(zhì)粒pET28a(+)-CaplO μ I與100 μ I BL21感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，42°C熱擊90s后，迅速置冰浴中，靜止2min，加入800 μ I無抗生素的LB培養(yǎng)基，37 0C 150rpm搖床培養(yǎng)45min后，5000rpm離心5min，棄去上清，留200 μ I將菌體吹勻后涂布含kana，100 μ g/ml的LB平板，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12_16h ;次日挑選白色單菌落，用含kana的LB培養(yǎng)基小量擴增培養(yǎng)；0MGA試劑盒小量提取質(zhì)粒；分別經(jīng)E.coRI, HindIII雙酶切鑒定，酶切體系同前，結(jié)果如圖3。將鑒定的陽性的重組菌命名為pET28a-Cap/BL21并進行序列測定分析。
[0048]取空載菌(pET28a/BL21)和鑒定陽性克隆菌(pET28a_Cap/BL21)，按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到含Kana的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，OD600值為0.6，加入IPTG誘導表達，取不同時相的 菌液3mL,大約培養(yǎng)間隔2h,共取樣6次。12000rpm離心Imin,去掉LB培養(yǎng)液。干燥后加入50 μ I去離子水，并加入溶菌酶2 μ 1，振蕩混勻4°C過夜。12000rpm離心lmin，分別取含溶菌酶的上清和菌體沉淀，加2XSDS-PAGE上樣緩沖液20 μ I。100°C煮沸5min。取5μ I上清液進行12%SDS_PAGE電泳(方法是將配制好的12%的分離膠加入玻璃板間，留出灌制積層膠所需的空間(梳子的齒長再加1cm)，并在膠的上方加入去離子水H2O ;待分離膠凝固后30min。吸出上層的水，加入配制好的5%的濃縮膠，并將樣品梳插入濃縮膠中，濃縮膠凝固后30min，拔出梳子，用蒸餾水把加樣孔徹底沖洗干凈。然后，加滿電泳液。)結(jié)果顯示，pET28a-Cap/BL21在30kD處有一條很濃的蛋白質(zhì)條帶，與預期的目的條帶大小相符，空白組菌pET28a/BL21則無此條帶，說明PCV2_Cap蛋白已經(jīng)得到了表達，如圖4所示。
[0049]實施例4重組T7噬菌體基因組的構(gòu)建及其體外包裝
[0050]采用OMGA質(zhì)粒提取試劑盒，小量提取用上述實施例方法制備的重組質(zhì)粒pET28a(+)-Cap，用E.coRI, HindIII進行雙酶切，酶切體系為:E.coRIl.0μ I, HindIIIl.0μ I,重組質(zhì)粒 pET28a_Cap34 μ 1，10XBuffer4.0 μ I，37 °C酶切過夜。電泳檢測，收集酶切的、具有粘端的線性化DNA序列，與相同粘端的T7噬菌體載體(型號:T7SelectlO-3b)試劑盒中的雙臂連接。連接體系為:粘端 PCV2-0RF2DNA2.5 μ 1，T7Select Vector Armsl.0 μ I, IOXLigaseBuffer0.5 μ I, T4Ligasel.0 μ I, 16°C連接過夜，獲得重組 PCV2_0RF2_Phage 基因組，即重組T7噬菌體基因組。[0051]體外包裝的方法為:從-80°C的冰箱中取I支T7Select Packaging Extract,冰上融化；向保存的連接體系中添加入25 μ I包裝物，輕微地混勻；16°C -22°c孵育2h ;轉(zhuǎn)移包裝好的物質(zhì)至一個消毒的1.5ml Eppendorf管中，加入270 μ I滅菌的LB培養(yǎng)基,終止反應；長時間保存，加入20 μ I氯仿，輕輕混勻后，4°C保存。
[0052]取宿主菌BLT5403劃線接種LB (amp抗性)培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑一個單克隆菌落于50ml的amp抗性的液體培養(yǎng)基中，37°C，150rpm搖動約5h，分光光度計測定OD600值，當OD6tltl在0.6-1.0之間時。貯存宿主菌在4°C，直到被使用，但不能夠保存過48h。用滅菌的LB為稀釋液，取10 μ I包裝好噬菌體，作1:100倍稀釋，稀釋成為4管。
[0053]取包裝的噬菌體和不同倍比稀釋的噬菌體約100 μ 1，加入的菌液250 μ 1，混勻后加3ml預熱的并保溫50°C的頂層瓊脂搖勻。
[0054]同時，將LB固體平板37°C預熱，將液體傾入其中的表面。搖勻平鋪LB平板上，冷卻后，倒置在37°C培養(yǎng)箱之中，約l_3h，觀察噬菌體斑(圖5-A)，計算庫容量。
[0055]觀察記錄每個平板上的噬菌體斑，挑選形狀規(guī)則、邊界清晰的噬菌體斑多個，每個曬菌體斑放入一個Eppendorf管之中，每個管加入100 μ IlOmM EDTA (ρΗ7.5)溶液。65°C水浴熱處理lOmin，待所有的瓊脂溶解之后，13000g離心3min，取上清液體(含有重組噬菌體的DNA)作為PCR反應的模板。
[0056]用PCR進行噬菌體鑒定，反應體系為7.1的模板2 μ 1，IOXTaq buffer(含MgCl2)
2.5 μ 1，上游引物 Ι.Ομ 1，下游引物 1.Ομ I, Taq 酶 0.5 μ 1，ddH2017 μ I,合計 25 μ I。擴增條件:預變性900C 4min ;變性94°C 45Sec，退火55°C 45sec，延伸72°C lmin, 30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物4°C保存。
[0057]用1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察插入片段的大小，如圖5-B所示，將PCR產(chǎn)物送上海生工測序，最終完成重組噬菌體展示顆粒的鑒定。
[0058]實施例5噬菌體展示顆粒的制備
[0059]一噬菌體展示顆粒的擴增
[0060]準備50ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，從平板上挑選單克隆宿主菌BLT5460，37°C振搖培養(yǎng)過夜，加5ml過夜的培養(yǎng)的菌種到500ml Lb amp抗性的培養(yǎng)基中，搖動培養(yǎng)到OD6tltl 為 0.5-1.0 之間時。
[0061]取重組噬菌體展示顆粒(濃度為108CFU/ml)進行感染。經(jīng)過37°C培養(yǎng)l_3h，直到裂解物能夠被觀察到，因為噬菌體裂解物可能導致培養(yǎng)基的可視度降低。SOOOg離心lOmin，取清新的液體傾倒到一個滅菌的瓶子之中，測定裂解物的滴度。
[0062]二重組噬菌體展示顆粒的濃縮
[0063]將重組噬菌體展示顆粒，通過適當截留量的濾膜進行離心；收集膜上的產(chǎn)物，獲得高濃度的重組噬菌體展示顆粒，保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，確定液體噬菌體的滴度(滴度為大于I X IO9CFU 為宜)。
[0064]實施例6功能驗證
[0065]一重組噬菌體展示顆粒應用
[0066]顆粒的處理，方法是將收集的重組II型豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白噬菌體展示顆粒與佐劑混合均勻，進行乳化分裝，使重組噬菌體終含量大于109CFU/ml，處理好的顆粒用來防控PCV2感染。[0067]二安全性試驗
[0068]購買25日齡、無PCV2病毒感染、健康斷奶的仔豬，共計6頭，直接注射，臨床觀察30d,未見異常反應,證明重組曬菌體展示顆粒對本動物是安全的。
[0069]三抗原性試驗
[0070]選擇豬只:到豬場購買健康的、未斷奶的仔豬6頭，經(jīng)前腔靜脈采血，收集血清，用豬圓環(huán)病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(購自深圳市康百得生物科技有限公司)檢測陰性的仔豬。
[0071]分組實驗:首先進行前腔靜脈采血，將多次檢測原圈(未斷奶的0d，之后16d、32d檢測)均合格的雜交仔豬。購回后隨機分為二組，每組3頭；第I組為實驗組(全為公豬)，注射重組噬菌體展示顆粒；第2組(I公2母)為空白對照組，注射滅菌水；公母豬表示(公古，母早，下同)。其次，將弗氏佐劑油相與噬菌體展示顆粒按照體積比1:1的比例乳化分裝，噬菌體最終含量約為109CFU/ml。最后，分別于第32d、第47d和第65d，用2ml/頭的劑量頸部肌肉注射，免疫。
[0072]體液免疫監(jiān)測主要是對實驗豬的PCV2抗體監(jiān)測，通過在試驗期間，每隔大約10-20d進行所有豬只前腔靜脈采血，用豬圓環(huán)病毒II型抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定血清中的PCV2抗體效價，進行豬抗體消長規(guī)律分析，結(jié)果見圖6。分析表明二免疫之后，免疫組的豬圓環(huán)病毒抗體滴度一直呈現(xiàn)上升趨勢，一直持續(xù)到80多日齡；之后，抗體滴度略有下降。相反，未免疫(空白對照組)抗體變化不明顯，而且都是陰性值(即OD45tl值小于試劑盒要求的Cut-OfT=0.168值)。結(jié)果說明重組噬菌體展示顆粒能產(chǎn)生較好的體液免疫。
[0073]細胞免疫監(jiān)測主要是淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗進行。參照文獻(Spector DL et al.998)的方法執(zhí)行。具體執(zhí)行的方法如下:
[0074](I)淋巴細胞收集與處理:三次免疫結(jié)束之后，選擇免疫的公豬，仰臥保定，在公豬的前腔的凹陷處用碘酒消毒，用IOml無菌注射器采取2ml，之后迅速地加入到含有枸櫞酸鈉的抗凝血管中，經(jīng)輕輕搖動混勻，防治血液凝固，獲得豬的抗凝血液，即獲得豬前腔靜脈血液；向2ml的豬抗凝液血中加入等體積(2ml)的稀釋液，輕輕混合均勻；向15ml細胞離心管中加入4ml豬外周血淋巴細胞分離液，靜止放置，提前預熱，孵育到室溫即可；吸取稀釋抗凝血液4ml，沿著細胞離心管管壁輕輕加在4ml的豬淋巴細胞分離液面上；以2000r/min離心，15min ;收集中間層淋巴細胞；向收集的淋巴細胞中加入RPMI1640 (購自GIBCO BRL公司，下同)的洗液IOmL,輕輕混勻，2000r/min離心20min,棄上清,重復2次；最后,加入總體積為2.0ml RPMI1640營養(yǎng)液，輕輕混勻，分裝到2個1.5ml的離心管中。用RPMI1640營養(yǎng)液稀釋至細胞終濃度為IO7個/ml。
[0075](2)淋巴細胞增值試驗:取IOOmL制備好的白細胞懸液于96孔板中；向100ml單細胞懸液的培養(yǎng)板孔內(nèi)，加入磷酸脂多糖(LPS，下同)和植物血凝素(PHA，下同)，終濃度為20 μ g / ml，并設陰性對照。每個樣本設3個重復孔，置5% CO2, 37°C培養(yǎng)44h后加入噻唑藍(MTT，下同)，終濃度5mg / ml，10 μ I /孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出后置微量振蕩器上室溫振蕩lOmin，使紫色結(jié)晶完全溶解，排盡氣泡后用酶聯(lián)檢測儀器測定OD57tl的值，所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0進行統(tǒng)計學處理。(3)培養(yǎng)刺激指數(shù)(Stimulation Index，SI)按照SI= (0D免疫實驗-OD培養(yǎng)基對照)/(0D空白對照-OD培養(yǎng)基對照)計算執(zhí)彳丁 ,結(jié)果見表1。分析表中的數(shù)據(jù)顯不LPS和
PHA兩種刺激物的SI都大于1，說明重組噬菌體展示顆粒促進了豬只淋巴細胞的增殖，證明重組噬菌體展示顆粒具有良好的細胞免疫效果。
[0076]表1
[0077]
【權(quán)利要求】
1.重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒的制備方法，具體包括以下步驟: A優(yōu)化編碼II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白的核苷酸 以GenBank中編號為HM565924.1的衣殼蛋白的核苷酸序列作為模板，優(yōu)化后，其序列如SEQ ID NO:1所示，進行人工合成； B重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以人工合成的核苷酸為模板，進行PCR擴增，上游引物為如SEQ ID N0:2所示，下游引物如SEQ ID N0:3所示，循環(huán)30次，得PCR產(chǎn)物；將所得PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)過E.coRI，HindIII雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物與同樣經(jīng)過E.coRI，HindIII雙酶切的線性表達載體pET28a ( + )連接,得重組質(zhì)粒； C重組噬菌體基因組的構(gòu)建 將所述的重組質(zhì)粒用E.coRI, HindIII進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與具有相同粘性末端的T7噬菌體載體的雙臂連接，得重組噬菌體基因組； D重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒的制備 將所述重組噬菌體基因組經(jīng)過體外包裝后，轉(zhuǎn)染宿主菌E.coli BLT5403，通過培養(yǎng)裂解宿主菌，得到重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:將步驟D所得重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒通過離心處理，得濃縮重組PCV2_Cap/Phage展示顆粒。
3.編碼II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白的表位氨基酸的核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一種重組質(zhì)粒的制備方法,其特征在于:以如SEQ ID NO:1所示的DNA為模板，在擴增體系下進行PCR擴增，循環(huán)30次，得PCR產(chǎn)物；PCR擴增所設計并合成的上游引物為如SEQID N0:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示；將所得PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物與同樣經(jīng)過E.coRI, HindIII雙酶切的線性表達載體pET28a ( + )連接，得重組質(zhì)粒。
5.重組噬菌體基因組，其特征在于:擴增和收集權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，用E.coRI, HindIII進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與具有相同粘性末端的T7噬菌體載體的雙臂連接，得重組噬菌體基因組。
6.運用權(quán)利要求5所述的重組噬菌體基因組制備重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒的方法，其特征在于:將所述重組噬菌體基因組經(jīng)過體外包裝后，轉(zhuǎn)染宿主菌E.coli BLT5403,通過培養(yǎng)裂解宿主菌，得到重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒。
7.權(quán)利要求6所制備的重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒在制備防控II型豬圓環(huán)病毒感染的應用。
8.權(quán)利要求6所制備的重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白噬菌體展示顆粒在制備II型豬圓環(huán)病毒抗原中的應用。
9.1I型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白的表位蛋白在制備重組II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白/噬菌體展示顆粒中的應用，其特征在于:II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白的表位蛋白的氨基酸序列以如SEQ ID NO:4所示。
【文檔編號】C12R1/92GK103540605SQ201310432346
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】楊柳, 沈克飛, 鄭華, 張邑帆, 付利芝, 谷山林, 熊仲良 申請人:重慶市畜牧科學院